一种枳椇悬浮细胞生产黄酮的方法
【专利摘要】本发明研究了一种枳椇悬浮细胞生产黄酮的方法。包括无菌叶片的获得，愈伤组织的诱导，悬浮细胞培养，细胞悬浮体系的优化，黄酮的提取测定等步骤。本发明方法所制备的枳椇悬浮细胞中含有较高含量的黄酮。本发明有助于解决枳椇资源短缺和保护枳椇种质资源的可持续生长，并且有利于建立枳椇悬浮细胞的大规模工厂化生产，为黄酮生产提供新的途径。
【专利说明】一种枳犋悬浮细胞生产黄酮的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组培条件下枳犋悬浮细胞的培养，尤其是钙离子对悬浮细胞中黄酮的调控。
【背景技术】
[0002]积犋(Hovenia acerba Lindl.),又名拐率、鸡爪梨、木室、龙率、长寿果,为鼠李科(Rhamnaceae)积犋属(Hovenia Thunb)植物。它集材、果、药、观赏于一身，生长快，适应性强，是一种极具开发价值的珍稀树种。主要分布在陕西、四川、重庆、湖北、湖南、江西、江苏、浙江、福建、广东、安徽、河北、河南等省。到目前为止共从该属植物中分离出70多种成分，主要为黄酮类和三萜皂苷类化合物。枳犋全身都是宝。枳犋具有解酒、保肝、抗癌、抗衰老等作用，我国枳犋资源丰富，但优良品种较少，目前的主要繁殖方法单一，多为实生繁殖。用枳犋成熟植株不同外植体进行组培并成功分化成完整植株的工作，国内外尚未见报道。未来既要利用传统的杂交、诱变方式，也要利用分子生物学的方式培育出更适应人们需求的新品种。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供枳犋悬浮细胞培养的快速繁殖方法，并通过水杨酸对悬浮细胞调控获得生长良好，黄酮含量高的悬浮细胞。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案:选用枳犋幼嫩的叶片，用洗洁精浸泡三分钟，自来水冲洗30分钟,在超净工作台上用0.1 %的升汞消毒9分钟,无菌水冲洗4-5次。接种在MS+NAA0.2 mg/L+IBA3mg/L愈伤组织诱导培养基上，培养条件为暗室培养，温度25°C，湿度50%~60%，将诱导出来的愈伤组织接入液体培养基MS+NAA0.2mg/L+ 2，4-D0.3mg/L上进行悬浮细胞培养30天，转速:90r/min，温度25°C，待悬浮细胞生长稳定，在培养基中附加前体物诱导子柠檬酸进行枳犋悬浮细胞的调控，取培养出来的枳犋悬浮细胞使用微波提取方法提取黄酮，采用HPLC法检测黄酮的含量。
[0005]采用本发明制备的枳犋悬浮细胞，生长速度快，能耗小，污染小，黄酮含量3.713%。
[0006]下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
【具体实施方式】
[0007] 实施例1
选用枳犋幼嫩的叶片，用洗洁精浸泡三分钟，自来水冲洗30分钟，在超净工作台上用
0.1 %的升汞消毒9分钟，无菌水冲洗4-5次。接种在MS+NAA0.lmg/L+IBA2mg/L愈伤组织诱导培养基上，培养条件为暗室培养，温度25°C，湿度50%~60%，将诱导出来的愈伤组织接入液体培养基MS+NAA0.2mg/L+ 2,4-D0.7mg/L上进行悬浮细胞培养30天，待悬浮细胞生长稳定，在培养基中附加前体物诱导子柠檬酸进行枳犋悬浮细胞的调控，取培养出来的枳犋悬浮细胞使用微波提取方法提取黄酮，采用HPLC法检测黄酮的含量，黄酮含量2.905 %。
[0008]实施例2
选用枳犋幼嫩的叶片，用洗洁精浸泡三分钟，自来水冲洗30分钟，在超净工作台上用0.1 %的升汞消毒9分钟，无菌水冲洗4-5次。接种在MS+NAA0.3 mg/L+IBA3mg/L愈伤组织诱导培养基上，培养条件为暗室培养，温度25°C，湿度50%~60%，将诱导出来的愈伤组织接入液体培养基MS+NAA0.3mg/L+ 2,4-Dlmg/L上进行悬浮细胞培养30天，待悬浮细胞生长稳定，在培养基中附加前体物诱导子柠檬酸进行枳犋悬浮细胞的调控，取培养出来的枳犋悬浮细胞使用微波提取方法提取黄酮，采用HPLC法检测黄酮的含量，黄酮含量2.932 %。
[0009]实施例3
选用枳犋幼嫩的叶片，用洗洁精浸泡三分钟，自来水冲洗30分钟，在超净工作台上用0.1 %的升汞消毒9分钟，无菌水冲洗4-5次。接种在MS+NAA0.3mg/L+IBA4mg/L愈伤组织诱导培养基上，培养条件为暗室培养，温度25°C，湿度50%~60%，将诱导出来的愈伤组织接入液体培养基MS+NAA0.3mg/L+ 2,4-Dlmg/L上进行悬浮细胞培养30天，待悬浮细胞生长稳定，在培养基中附加前体物诱导子柠檬酸进行枳犋悬浮细胞的调控，取培养出来的枳犋悬浮细胞使用微波提取方法提取黄酮，采用HPLC法检测黄酮的含量，黄酮含量3.157 %。
[0010]实施例4
选用枳犋幼嫩的叶片，用洗洁精浸泡三分钟，自来水冲洗30分钟，在超净工作台上用0.1 %的升汞消毒9分钟，无菌水冲洗4-5次。接种在MS+NAA0.2mg/L+IBA4mg/L愈伤组织诱导培养基上，培养条件为暗室培养，温度25°C，湿度50%~60%，将诱导出来的愈伤组织接入液体培养基MS+NAA0.2mg/L+ 2,4-D0.3mg/L上进行悬浮细胞培养30天，待悬浮细胞生长稳定，在培养基中附加前体物诱导子柠檬酸进行枳犋悬浮细胞的调控，取培养出来的枳犋悬浮细胞使用微波提取方法提取黄酮，采用HPLC法检测黄酮的含量，黄酮含量3.468 %。
【权利要求】
1.一种枳犋悬浮细胞生产黄酮的方法，其特征是:枳犋的叶片经消毒处理，接种在MS+NAA0.1-0.3 mg/L+IBA2^4mg/L愈伤组织诱导培养基上，将诱导出来的愈伤组织接入液体培养基MS+NAA0.1-0.3mg/L+ 2,4-D0.3~lmg/L上进行悬浮细胞培养30天，待悬浮细胞生长稳定，在培养基中附加前体物诱导子柠檬酸进行枳犋悬浮细胞的调控，取培养出来的枳犋悬浮细胞使用微波提取方法提取黄酮，采用HPLC法检测黄酮的含量。
2.根据权利要求1所述的一种枳犋悬浮细胞生产黄酮的方法，其特征是:所述的消毒处理为:选用枳犋幼嫩的叶片，用洗洁精浸泡三分钟，自来水冲洗30分钟，在超净工作台上用0.1 %的升汞消毒9分钟,无菌水冲洗4-5次。
3.根据权利要求1所述的一种枳犋悬浮细胞生产黄酮的方法，其特征是:诱导愈伤组织的条件为暗室培养，温度25°C，湿度50%~60%，为防止愈伤组织褐化，培养基中加入少量VC0
4.根据权利要求1所述的一种枳犋悬浮细胞生产黄酮的方法，其特征是:培养基中加入的柠檬酸为过滤灭菌。
5.根据权利要求1所述的一种枳犋悬浮细胞生产黄酮的方法，其特征是:枳犋悬浮细胞提取方法为微波提取方法。
6.根据权利要求1所述的一种枳犋悬浮细胞生产黄酮的方法，其特征是:HPLC检测条件:色谱柱，C18柱，甲醇-0.5%磷酸(55:45)，流速1.5ml/min，注温:29°C，波长360nm。
【文档编号】C12N5/04GK103468632SQ201310423711
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】杨存 申请人:南京通泽农业科技有限公司