专利名称：一种植物悬浮细胞的固定化修饰方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种植物悬浮细胞的固定化修饰方法。
背景技术：
原子力显微镜(AFM)因为具有较高的空间分辨率和力学灵敏度，使其在诸多领域得到了广泛的应用，同时在生物学领域也得到了极大的发展。近年来，AFM的高分辨成像和单分子测力在对生物大分子和细胞膜超微结构和动态结构表征以及DNA、抗体-抗原、药物和生物分子之间的相互作用力等方面有了较深入的研究。但是，关于AFM在活细胞上的研究大多局限于动物贴壁细胞，植物悬浮细胞及其原生质体由于悬浮生长的特殊的存在状态，而又缺乏合适的固定悬浮细胞的方法，使得活细胞水平上关于细胞表面的结构、功能、 粘性和弹性以及小分子之间的相互作用力等的研究手段非常局限，这也束缚了相关研究的进展。目前比较常用的是荧光显微镜，如GFP染色等，AFM在悬浮生长细胞的研究上受到了极大地限制，使得悬浮细胞在结构和相关功能上的高分辨的研究并不多。因此，发展一种将悬浮细胞固定化修饰的方法具有重要的意义，同时也可以为其它相关的研究提供思路。目前，有多篇文献报道了悬浮细胞的固定方法，如多聚赖氨酸交联、微量移液管口捕捉、小孔径滤膜截留法等，但是这些方法均存在不同程度的缺陷。在动物细胞实验中，多聚赖氨酸仅作为一种辅助交联手段用于增强不易贴壁或半贴壁细胞的贴壁效果，用于固定悬浮的细胞，效率较低，且贴壁效果不好。而微量移液管口捕捉、小孔径滤膜截留等方法对细胞表面施加的作用力过大，对于植物细胞原生质体作用尤为明显，破坏了生物细胞正常的生理状态，难以实时反映细胞结构、功能的真实状况。因此有必要发展一种具有操作简便，细胞贴壁性好，生物活性受影响小，近生理环境等优势的悬浮细胞固定化修饰方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种固定悬浮细胞的方法。该方法为将悬浮细胞与基底材料交联，使二者表面的基团间形成化学键，得到固定在所述基底材料上的悬浮细胞。该方法中首先通过分子间反应羧基与碳化二亚胺形成不稳定的酯过渡态，再与N-羟基亚胺生成一种半稳定的处于活化状态的亚胺酯，可与基底表面修饰的氨基生成更稳定的酰胺键从而将悬浮细胞捕获到修饰有氨基的基底表面。在上述方法中，所述将悬浮细胞与基底材料交联的方法具体包括如下步骤1)分别活化所述悬浮细胞和所述基底材料，得到活化后悬浮细胞和活化后基底材料；2)将步骤1)得到的活化后悬浮细胞与活化后基底材料反应，即得到固定在所述基底材料上的悬浮细胞。在上述方法中，步骤1)中，所述活化所述悬浮细胞采用的活化剂为EDC (1- (3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)或其盐酸盐形式和NHS (N-羟基丁二酰亚胺)或其衍生物形式，所述EDC的其盐酸盐形式为EDC-HCl (1-(3- 二甲基氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐)，所述NHS的衍生物形式具体为Sulfo-NHS (N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐)；本发明的实施例活化所述悬浮细胞具体用的是EDC-HCl和Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐)；上述活化基底材料采用的活化剂为硅烷化试剂，所述硅烷化试剂具体可为 APTES((3-氨基丙基)三乙氧基硅烷)或MPTMS(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，本发明的实施例具体用的是APTES ((3-氨基丙基)三乙氧基硅烷)；步骤2)中，所述反应的温度为^°C，所述反应时间为10min-2h，所述反应时间具体为池，所述反应为静置、避光反应。在上述方法中，步骤1)中的活化悬浮细胞的方法包括如下步骤A、将悬浮细胞溶液与所述EDC-HCl混勻，得到混合液；B、再向步骤A得到的混合液中加入所述Sulfo-NHS混勻，反应，即得到活化后的悬浮细胞；其中，悬浮细胞溶液按照如下方法制备将所述悬浮细胞在培养基中培养3天，得到悬浮细胞溶液，所述悬浮细胞在所述悬浮细胞溶液中的浓度为2. 36 X IO3个/ml ；上述悬浮细胞的培养为避光培养，所述培养温度为^rc，所述培养采用的转速为 120rpm ；在上述方法中，步骤1)中的活化基底材料的方法包括如下步骤C、将所述基底材料经Plasma处理，得到处理后基底材料(表面羟基化)；D、将步骤C得到的处理后基底材料浸入含有APTES的甲苯溶液中，反应，即得到所述活化后基底材料。在所述活化悬浮细胞的方法中，所述悬浮细胞溶液、所述EDC-HCl和所述 Sulfo-NHS 的配比为 4ml l(T5mol (3Xl(T5)mol;在所述活化基底材料的方法中，其中步骤C的所述基底材料经Plasma处理具体为将所述基底材料放入等离子体反应器(PDC-32G-2，Harrick Scientific Corp. , NY)中，在纯氧Im bar的氛围中反应120s ；步骤D中的含有APTES的甲苯溶液按照如下方法制备将APTES与甲苯混勻，得到含有APTES的甲苯溶液，所述APTES在所述含有APTES的甲苯溶液中的浓度为(体积百分含量)。步骤1)中，在上述活化悬浮细胞的方法的步骤B中，所述反应温度为，所述反应时间为10min-2h，所述反应具体为20min ；所述反应为静置、避光反应；步骤1)中，在上述活化基底材料的方法的步骤D中，所述反应温度为25V ；所述反应时间为1-3小时，所述反应具体为池。在上述活化所述悬浮细胞的方法中，在步骤B的所述反应后还包括如下步骤将反应产物静置后弃上清液、得到的剩余产物悬于培养基中，得到活化后悬浮细胞；在上述活化所述基底材料的方法中，在步骤D的所述反应后还包括如下步骤将反应后的基质材料依次用甲苯、丙酮、乙醇洗涤，干燥后得到活化后基底材料；在所述将悬浮细胞与基底材料交联的方法中，步骤2)中，在所述反应后还包括如下步骤洗涤反应后得到的基底材料，得到固定在所述基底材料上的悬浮细胞；
所述洗涤方法具体为用培养基冲洗反应后得到的基底材料，去掉未连接到表面上的细胞；在所述将悬浮细胞与基底材料交联的方法中，在步骤1)前还包括如下步骤将所述悬浮细胞在含有富勒烯的培养基中培养；上述的含有富勒烯的培养基为将富勒烯与培养基混合，得到含有富勒烯的培养基，所述富勒烯在所述含有富勒烯的培养基中的浓度为0. 01mg/ml ；上述培养时间为3天，所述培养时间为^°C，所述培养的转速为120rpm，所述培养为避光培养。上述的悬浮细胞均为离体悬浮细胞，优选为植物悬浮细胞或其原生质体；本发明的实施例中采用的是烟草悬浮细胞BY-2或其原生质体；上述的基质材料可为硅片、玻璃片、云母片或各种含硅成分的基底。上述的培养基为液体的细胞培养基，在本发明的实施例中具体为MS液体培养基。由上述的方法制备的固定在所述基底材料上的悬浮细胞也是本发明保护的范围。上述的方法或由上述得到的固定在所述基底材料上的悬浮细胞在用原子力显微镜检测方法检测细胞表明分子结构或功能中的应用也是本发明保护的范围。上述EDC/NHS及其各种衍生物是可商业化途径得到的化学试剂。上述针对利用AFM研究细胞表面的力学性质具体可以是对固定后的活细胞进行成像或研究力学性质，具体可以是研究BY-2细胞壁表面糖基受体与修饰在AFM针尖上的麦芽凝集素(WGA，Sigma-Aldrich)配体之间的特异性相互作用。本发明的实验证明，本发明中首先通过分子间反应羧基与碳化二亚胺形成不稳定的酯过渡态，再与N-羟基亚胺生成一种半稳定的处于活化状态的亚胺酯，将悬浮细胞捕获到修饰有氨基的基底表面，然后利用共聚焦显微镜成像技术和荧光染料标记的细胞活性检测物质检测固定的细胞的形态及活性，以确定经该方法用于固定悬浮细胞的可靠性，并第一次将原子力显微镜(AFM)应用到植物悬浮细胞表面性质的研究上，也进一步说明了本发明具有较实质的科学研究价值，可以为植物悬浮细胞体系的研究提供更广泛的思路。本发明属于植物悬浮细胞固定化修饰的方法，与同类技术相比具有操作简便，细胞贴壁性好， 生物活性正常，近生理环境等优势，可以固定多种悬浮生长的植物细胞及其原生质体。
图1为悬浮细胞固定化修饰方法的示意2为固定细胞玻璃片上的细胞形态和活性检测图3为经WGA修饰后的AFM针尖与固定到玻璃片表面的BY_2细胞之间相互作用力的测定结果图4为固定细胞原生质体的玻璃片上的细胞的形态和活性检测
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，所用到的材料、试剂及仪器如下
烟草悬浮细胞(Nicotianatobaccum L. cv. Bright Yellow，BY-2)记载在 Calmodulin Binds to Extracellular Sites on the Plasma Membrane of Plant Cells and Elicits a Rise in Intracellular Calcium Concentration, Qinli Wang, et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol. 284, No. 18, pp. 12000-12007, May 1,2009, 公众可从中国科学院化学研究所获得。BY-2的原生质体将BY-2细胞用酶解基液进行酶解Mi得到；其中所用的酶解基液成分为纤维素酶(9032-75-1，北京拜尔迪生物科技公司)3% (wt/vol)和浸解酶 (9012-54-8，北京拜尔迪生物科技公司)0. 5% (wt/vol)组成。细胞培养条件避光培养在摇床中，转速为120rpm ；孵育BY-2 细胞所用培养基MS (Murashige and Skoog Medium)培养基(1L MS 培养基组分如下MS 盐(Sigma M5524)4. 3g，硫胺(VBl) 1. Omg，肌醇 100mg，2，4_D 0. 2mg，蔗糖 30g, KH2PO4O. 255g, KOH 调节 PH 值为 5. 0)；孵育烟草BY-2细胞原生质体所用培养基MS (Murashige and Skoog Medium)培养基(1L MS培养基组分如下=MS盐4. 3g，蔗糖137g，MES水化物0. 5g，CaCl2 · 2Η200· 75g， NH4NO3O. 25g, KOH 调节 PH 值为 5. 7)。活性检测所用到的染料为FDA (二乙酸荧光素，Sigma)和PI (溴化丙叮，北京拜尔迪公司)，前者用于检测细胞的活性，后者用于检测细胞的死亡状况。上述试剂如无特殊说明，均购自北京拜尔迪公司。下述实施例中所用倒置显微镜购自Olympus公司，使用型号为FV 1000-1X81激光扫描共聚焦显微镜(Olympus，Japan)。分别以488nm激发FDA，559nm激发PI染料。下述实施例中所用到的原子力显微镜(AFM)测力的实验条件实验所用的AFM针尖为氮化硅针尖(型号NP-10，针尖半径为20-60nm，Veeco, Santa Barbara, CA, USA)，弹性常数范围在0.0347到0.0621N/m范围内。实验所用仪器为Pico SPM II (Agilent,USA) 配有 Picc^can 3000 控制器，及大扫描头(N9524A-US08380108，Agilent, USA)，AFM 扫描器安装于倒置荧光显微镜上方(Olympus 1X71，Japan)。活细胞上的力曲线均为室温下接触模式所测得，并且所得到的力曲线用 PicoScan5 软件(Agilent, USA)进行采集。图1为悬浮细胞固定化修饰方法的示意图实施例1、固定交联到基底的植物悬浮细胞获得及其应用一、固定交联到基底的植物悬浮细胞获得1、活化植物细胞和活化基底材料1)活化植物悬浮细胞(1)取Iml生长状态良好的烟草悬浮细胞(Nicotiana tobaccum L. cv. Bright Yellow, BY-2)，加入至含有20ml培养基的锥形瓶中。避光放置到^°C，转速为120rpm的摇床中，培养3天，得到BY-2细胞溶液(可以作为后面实验用的正在生长BY-2细胞，其中 BY-2细胞的浓度为2. 36 X IO3个/ml。(2)取細1步骤(1)中的BY-2细胞，转移到15ml的离心管中，静置沉降去上清液，再加入2ml培养基，轻轻吹打均勻，转移至60mm培养皿中；然后称取 1.917mgEDC-HCl (1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，Sigma，03449)和 6. 514mgSulfo-NHS (N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐，Sigma, 56485)，分别溶于Iml培养基，吹打使其充分溶解。首先将Iml EDC-HCl溶液加入到上述细胞培养皿中，吹打混合均勻后，将培养皿静置于摇床中活化lOmin，再将Iml Sulf0-NHS溶液加入到上述培养皿中，吹打混合均勻后，再将培养皿静置于26°C摇床中活化20min (避光)，得到活化的细胞溶液，然后将该溶液转移至15ml的离心管中静置沉降后吸出上清液丢弃，再加入干净培养基，冲洗后静置沉降去上清液，反复几次，最后加入2ml培养基，轻轻吹打至混合均勻，得到活化后的BY-2细胞， 以上操作均在超净台中完成。上述反应中，BY-2细胞溶液、EDC-HCl和Sulfo-NHS的配比为 4ml l(T5mol (3Xl(T5)mol;2)活化基底材料清洗干净的玻璃片(22X22mm)经Plasma处理，具体为玻璃片放入等离子体反应器中，在纯氧Im bar的氛围中反应120s，得到表面羟基化的玻璃，再将表面羟基化的玻璃浸入(V/V) APTES ((3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，Sigma, A3648)的甲苯溶液中，室温 (250C )反应2小时，取出后分别用甲苯、丙酮、乙醇反复冲洗干净，用纯N2吹干，得到活化后玻璃片。2、活化后悬浮细胞与活化后基底材料交联反应将上述1中的步骤2)得到的活化后玻璃片置于30mm的培养皿中，吸取步骤1)中的活化后BY-2细胞滴加到上述活化后玻璃片上，静置于^rc的摇床中反应2小时，将反应后的细胞溶液全部吸出丢弃，用培养基反复冲洗玻璃片，使得没有交联到玻璃片上的细胞完全冲洗掉，然后向培养皿中加入Iml培养基，得到固定在所述玻璃片上的BY-2细胞；尽量将未交联到玻璃片表面的细胞冲洗掉，然后向细胞中加入Iml培养基。3、植物悬浮细胞交联到基底上的固定化修饰的鉴定1)、明场观察细胞形态及活性将上述步骤一的2得到的玻璃片(固定在所述玻璃片上的BY-2细胞)置于倒置显微镜上，上面轻轻加上盖玻片，对未经FDA和PI染色的固定后的BY-2细胞进行明场成像， 以正常生长的BY-2细胞为对照。结果如图2所示，其中A为悬浮生长的BY-2细胞的明场图像(对照)，D为交联到玻璃片上的BY-2细胞的明场图像；标尺20 μ m。从明场图上可以看到，固定后BY-2细胞形态(D)与正常悬浮生长的BY-2(A)大致相同，细胞形态正常，透光性好，结构清晰，没有发生细胞萎缩和质壁分离现象。2)荧光观察细胞形态及活性针对检测细胞活性的荧光标记物质，具体可以是二乙酸荧光素(FDA)、碘化丙啶 (PI)，前者用来检测细胞活性，后者用于检测细胞的死亡状况。将上述步骤一上述步骤一的2得到的玻璃片(固定在所述玻璃片上的BY-2细胞) 分别用FDA、PI染色，具体操作如下取5mg/ml FDA染料5 μ 1或lmg/ml PI染料10 μ 1，加入经交联细胞的培养基溶液(含有固定在所述玻璃片上的ΒΥ-2细胞)中，孵育3分钟，吸出溶液丢弃，用干净培养基反复冲洗几次，最后加入Iml干净培养基待用荧光成像。对于上述正常生长的ΒΥ-2细胞染色的具体操作如下取5mg/ml FDA染料5 μ 1或 lmg/ml PI染料10 μ 1，加入0. 5ml细胞溶液中，孵育3分钟，静置沉降去上清液，加培养基清洗，静置沉降去上清液，反复几次，最后加入0. 5ml干净培养基待用荧光成像。最后，分别取染色后的交联到玻璃片上的细胞和正常的悬浮细胞于激光扫描共聚焦显微镜上进行荧光成像，以检测固定后的细胞的活性状态。结果从图2可以看到，在玻璃片上固定化修饰后的BY-2细胞(E，F)与正常悬浮生长的BY-2细胞(B，C)荧光强度基本相同，经FDA染色后具有较强的荧光(B，E)，而经PI染色(C，F)后没有荧光，说明固定化修饰后的细胞活性正常，这说明该悬浮生长细胞的固定化修饰方法达到了预期的效果。二、固定交联到基底的植物悬浮细胞在AFM检测中的应用1、用于AFM检测的固定交联到基底的植物悬浮细胞的修饰采用与水溶性富勒烯共同孵育的BY-2细胞，其中与水溶性富勒烯共同孵育的 BY-2细胞按照如下方法获得将BY-2细胞在含有富勒烯的培养基中培养，所述富勒烯在所述培养基中的浓度为0. 01mg/ml，孵育的温度为摇床中，转速为120rpm，共同避光孵育 3天。按照上述步骤一的步骤1-2，得到有受体的且固定到玻璃上的BY-2细胞(固定有 BY-2细胞的玻璃片)。2、用AFM测定BY_2细胞表面的多糖配受体之间的相互作用力将上述1获得的固定有BY-2细胞的玻璃片(有受体的且固定到玻璃上的BY-2细胞)置于AFM上进行测力，测定AFM探针经麦芽凝集素(WGA，Sigma，L-9640)修饰后与BY-2 细胞表面多糖之间的相互作用力的大小。以用游离的WGA结合ΒΥ-2细胞表面的多糖作为对照(这样AFM探针上的WGA就不会再与细胞表面的多糖发生作用了)。AFM探针经麦芽凝集素修饰和用游离的WGA结合ΒΥ-2细胞表面的多糖的方法参 照 J. Yu, Q.Wang, X. Shi, X. Ma, H. Yang, Y.G.Chen, X. Fang, Single-molecule force spectroscopy study of interaction between transforming growth factor β 1 and its receptor in living cells, J. Phys. Chem. B 111 (2007) 13619-13625.结果如图3所示，为交联到玻璃片表面的BY-2细胞经AFM测力的实验结果，其中图3A为几条典型力曲线的示意图(a.未经WGA修饰的AFM针尖与BY-2细胞之间相互作用力的力曲线；b.经WGA修饰的AFM针尖与BY-2细胞之间相互作用力的力曲线；c.在游离的 WGA阻断后，经WGA修饰的AFM针尖与BY-2细胞之间相互作用力的力曲线)，图为经WGA 修饰的AFM针尖与BY-2细胞表面之间相互作用力的分布图；图3C为该实验结合几率的分布图，从上述图中可以看出，将AFM探针用WGA修饰后，可以与BY-2细胞之间发生特异性相互作用，且测得的相互作用大小为47士 15pN(数据是由图;3B中高斯拟合所得到的结果)，这与以往文献报道是相符的。且从结合几率(图3C)上也可以看到，AFM针尖上WGA与BY-2细胞表面的结合几率为19. 5%，而经游离的WGA阻断后，AFM针尖上WGA与BY-2细胞之间的结合几率降为 3.观％，充分说明WGA与BY-2细胞表面确实存在特异性相互作用。证明了该植物悬浮细胞固定化修饰的方法可以用于AFM对该类体系的研究，同时也证实了该方法对于研究悬浮生长植物体系具有较明显的实用价值，可以为该类体系潜在的科学研究方法和思路提供线索。实施例2、交联固定到基底上的植物悬浮细胞原生质体的获得
按照与实施例1步骤一的1-2完全相同的方法及步骤，对植物悬浮细胞进行固定化修饰，仅将所用的BY-2细胞替换为BY-2细胞的原生质体，得到固定到玻璃上的BY-2原生质体(固定有BY-2原生质体的玻璃片)。采用实施例1的步骤一的3检测固定到玻璃上的BY-2原生质体(固定有BY-2原生质体的玻璃片)，以正常生长的原生质体为对照；结果如图4所示，A、B、C为悬浮生长的BY-2原生质体，D、E、F为固定到玻璃上的 BY-2原生质体的图像。其中，A、D为阴性对照的明场图像，B、E为经FDA染色的荧光图像， 而C、F为经PI染色后细胞的明场图像和荧光图像的叠加图像。标尺20 μ m，从图中可以看到，固定到玻璃上的BY-2原生质体(D、E、F)与悬浮生长的BY-2原生质体(A、B、C)相比较， 细胞形态正常，饱满且结构清晰，透光性好。经FDA染色(E)和PI染色(F)的荧光图像可以看到，固定后的原生质体活性能够保持，说明了该固定化修饰方法同样能够将原生质体修饰到基底表面且能保持较好的生物活性。
权利要求
1.一种固定悬浮细胞的方法，为将悬浮细胞与基底材料交联，使二者的表面的基团间形成化学键，得到固定在所述基底材料上的悬浮细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述将悬浮细胞与基底材料交联的方法包括如下步骤1)分别活化所述悬浮细胞和所述基底材料，得到活化后悬浮细胞和活化后基底材料；2)将步骤1)得到的活化后悬浮细胞与活化后基底材料反应，即得到固定在所述基底材料上的悬浮细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤1)中，所述活化所述悬浮细胞采用的活化剂为EDC或其盐酸盐形式和NHS或其衍生物形式，所述EDC的其盐酸盐形式为EDC-HCl，所述NHS的衍生物形式具体为Sulf0-NHS ； 所述活化所述悬浮细胞采用的活化剂具体为EDC-HCl和Sulfo-NHS ； 所述活化基底材料采用的活化剂为硅烷化试剂；所述硅烷化试剂具体为APTES或 MPTMS ；步骤2)中，所述反应的温度为沈！，所述反应时间为10min-2h，所述反应时间具体为池，所述反应为静置、避光反应。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 步骤1)中，所述活化悬浮细胞的方法包括如下步骤A、将悬浮细胞溶液与所述EDC-HCl混勻，得到混合液；B、再向步骤A得到的混合液中加入所述Sulfo-NHS混勻，反应，即得到活化后的悬浮细胞；所述悬浮细胞溶液为按照如下方法制备将悬浮细胞在培养基中培养3天，得到悬浮细胞溶液，所述悬浮细胞在所述悬浮细胞溶液中的浓度为2. 36 X IO3个/ml ； 所述培养为避光培养，所述培养温度为26°C ； 步骤1)中，所述活化基底材料的方法包括如下步骤C、将所述基底材料经Plasma处理，得到处理后基底材料；D、将步骤C得到的处理后基底材料浸入含有APTES的甲苯溶液中，反应，即得到所述活化后基底材料。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于步骤1)中，在所述活化悬浮细胞的方法中，所述悬浮细胞溶液、所述EDC-HCl和所述 Sulfo-NHS 的配比为 4ml l(T5mol (3Xl(T5)mol;步骤1)中，在所述活化基底材料的方法的步骤C中，所述基底材料经Plasma处理为将所述基底材料放入等离子体反应器中，在纯氧Im bar的氛围中反应120s ；步骤D中，所述含有APTES的甲苯溶液按照如下方法制备将APTES与甲苯混勻，得到含有APTES的甲苯溶液，所述APTES在所述含有APTES的甲苯溶液中的浓度为(体积百分含量)。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于步骤1)中，在所述活化所述悬浮细胞的方法的步骤B中，所述反应温度为，所述反应时间为10min-2h，所述反应具体为20min ；所述反应为静置、避光反应；步骤1)中，在所述活化所述基底材料的方法的步骤D中，所述反应温度为25V ；所述反应时间为1-3小时，所述反应具体为池。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于步骤1)中，在所述活化所述悬浮细胞的方法的步骤B中，在所述反应后还包括如下步骤将反应产物静置后弃上清液、得到的剩余产物悬于培养基中，得到活化后悬浮细胞；步骤1)中，在所述活化所述基底材料的方法的步骤D中，在所述反应后还包括如下步骤将反应后的基质材料依次用甲苯、丙酮、乙醇洗涤、干燥得到活化后基底材料的步骤；步骤2)中，在所述反应后还包括如下步骤洗涤反应后得到的基底材料，得到固定在所述基底材料上的悬浮细胞。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述悬浮细胞为离体悬浮细胞，所述离体悬浮细胞为植物悬浮细胞或其原生质体； 所述植物悬浮细胞具体为烟草悬浮细胞BY-2或其原生质体； 所述基质材料为硅片、玻璃片、云母片或各种含硅成分的基底； 所述培养基为液体的细胞培养基，所述液体的细胞培养基具体为MS液体培养基。
9.由权利要求1-8所述的方法制备的固定在所述基底材料上的悬浮细胞。
10.权利要求1-8所述的方法或权利要求9所述的固定在所述基底材料上的悬浮细胞在用原子力显微镜检测方法检测细胞表明分子结构或功能中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种植物悬浮细胞的固定化修饰方法。本发明提供的固定悬浮细胞的方法，所述将悬浮细胞与基底材料交联具体包括如下步骤1)分别活化所述悬浮细胞和所述基底材料，得到活化后悬浮细胞和活化后基底材料；2)将步骤1)得到的活化后悬浮细胞与活化后基底材料反应，即得到固定在所述基底材料上的悬浮细胞。本发明的实验证明，本发明属于悬浮生长细胞固定化修饰的方法，与同类技术相比具有操作简便，细胞贴壁性好，生物活性正常，近生理环境等优势，可以固定多种悬浮生长的生物细胞。
文档编号C12Q1/02GK102433319SQ20111033323
公开日2012年5月2日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者刘巧玲, 师晓丽, 张雪洁, 方晓红 申请人:中国科学院化学研究所