一种霸王鞭悬浮细胞的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明研究了一种霸王鞭悬浮细胞培养的快速繁殖方法，包括从霸王鞭诱导愈伤组织、继代培养愈伤组织、悬浮细胞培养、细胞悬浮体系的优化等步骤。本发明方法所制备的霸王鞭悬浮细胞工艺流程简单，不受地域，季节等自然环境因素影响，有利于建立霸王鞭悬浮细胞的大规模工厂化生产。
【专利说明】一种霸王鞭悬浮细胞的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组培条件下霸王鞭悬浮细胞的培养，属于植物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]霸王鞭，EupHorbia royleana Boiss,大戟科,乔木状，莖干肉质、粗壮，具5棱，后变圆形。分枝螺旋状轮生，浅绿色，后变灰，具黑刺。叶片多浆，革质，倒卵形，基部渐狭，浅绿色。全株含有白色剧毒乳汁，若误食会中毒；溅入眼中可致失明。全草含蒲公英赛醇(taraxerol), 2，3_ 二甲氧基并没食子酸，丁二酸，又含大戟二烯醇、巨大戟萜醇。乳汁含四环三萜，环霸王鞭萜烯醇，蒲公英赛醇，β -粘霉烯醇，大戟二烯醇，又含巨大戟萜四乙酸酯，巨大戟新萜醇三乙酸酯。主要用来祛风解毒；杀虫止痒。主疮疡肿毒；牛皮癣。喜温暖干燥和阳光充足环境。喜光，喜温暖气候，甚耐干旱。畏寒，温度偏低时常落叶。不耐寒，耐高温。宜排水良好、疏松的沙壤土，性喜光照强、气温高的环境，培养得好主茎可高达3米。采用扦插法繁殖，组培方法研究目前尚处于起步阶段，悬浮细胞培养尚无人研究，悬浮细胞具有操作简单可控，生产成本低，繁殖率高。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供霸王鞭悬浮细胞培养的快速繁殖方法，工艺流程简单，不受地域，季节等自然环境因素影响等优点，有利于建立霸王鞭悬浮细胞的大规模工厂化生产。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案:
选用霸王鞭幼嫩的叶片，用漂白粉浸泡三分钟，自来水冲洗15分钟，在超净工作台上用2%的次氯酸钠消毒8分钟，无菌水冲洗至无残留，接种在1/2ΜΡ，愈伤组织诱导培养基上，光照1000-15001χ，光照10h/d，温度21°C，将诱导出来的愈伤组织接入培养基MP+0.5-lmg/L6-BA+1-2mg/LNAA+反玉米素2_3mg/L+lg/L活性炭培养基中进行继代培养，愈伤组织经过继代培养之后，挑选生长均一，颗粒细小，外观湿润，质地松软的愈伤组织，用120目的不锈钢筛过滤，除去大细胞团,接种量为2g每30mL，每次换培养液,先将培养物静止，倒去上层2/3培养液，添加2/3新液，每十天换一次培养液，用300目不锈钢网过滤，洗漆，烘干。
[0005]采用本发明制备的霸王鞭悬浮细胞，生长速度快，能耗小，污染小，次生代谢物含量高。
[0006]下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
【具体实施方式】
[0007]实施例1
选用霸王鞭幼嫩的叶片，用漂白粉浸泡三分钟，自来水冲洗15分钟，在超净工作台上用2%的次氯酸钠消毒8分钟，无菌水冲洗至无残留，接种在1/2MP，愈伤组织诱导培养基上，光照1000-15001x，光照10h/d，温度21°C，将诱导出来的愈伤组织接入培养基MP+0.5mg/L6-BA+lmg/LNAA+反玉米素2mg/L+lg/L活性炭培养基中进行继代培养，愈伤组织经过继代培养之后，挑选生长均一，颗粒细小，外观湿润，质地松软的愈伤组织，用120目的不锈钢筛过滤，除去大细胞团，接种量为2g每30mL，每次换培养液，先将培养物静止，倒去上层2/3培养液，添加2/3新液，每十天换一次培养液，用300目不锈钢网过滤，洗涤，烘干，成活率95%。
[0008]实施例2
选用霸王鞭幼嫩的叶片，用漂白粉浸泡三分钟，自来水冲洗15分钟，在超净工作台上用2%的次氯酸钠消毒8分钟，无菌水冲洗至无残留，接种在1/2MP，愈伤组织诱导培养基上，光照1000-15001x，光照10h/d，温度21°C，将诱导出来的愈伤组织接入培养基MP+lmg/L6-BA+2mg/LNAA+反玉米素3mg/L+lg/L活性炭培养基中进行继代培养，愈伤组织经过继代培养之后，挑选生长均一，颗粒细小，外观湿润，质地松软的愈伤组织，用120目的不锈钢筛过滤,除去大细胞团,接种量为2g每30mL，每次换培养液，先将培养物静止,倒去上层2/3培养液，添加2/3新液，每十天换一次培养液，用300目不锈钢网过滤，洗涤，烘干，成活率94%。
[0009]实施例3
选用霸王鞭幼嫩的叶片，用漂白粉浸泡三分钟，自来水冲洗15分钟，在超净工作台上用2%的次氯酸钠消毒8分钟，无菌水冲洗至无残留，接种在1/2MP，愈伤组织诱导培养基上，光照1000-15001x，光照10h/d，温度21°C，将诱导出来的愈伤组织接入培养基MP+lmg/L6-BA+lmg/LNAA+反玉米素2mg/L+lg/L活性炭培养基中进行继代培养，愈伤组织经过继代培养之后，挑选生长均一，颗粒细小，外观湿润，质地松软的愈伤组织，用120目的不锈钢筛过滤,除去大细胞团,接种量为2g每30mL，每次换培养液，先将培养物静止,倒去上层2/3培养液，添加2/3新液，每十天换一次培养液，用300目不锈钢网过滤，洗涤，烘干，成活率93%。
【权利要求】
1.一种霸王鞭悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是:霸王鞭的叶片经消毒处理，接种在1/2MP，愈伤组织诱导培养基上，将诱导出来的愈伤组织接入培养基MP+0.5-lmg/L6-BA+l-2mg/LNAA+反玉米素2_3mg/L+lg/L活性炭培养基中进行继代培养，继代培养40天后接入不加琼脂的液体培养基中进行悬浮细胞培养，十天换一次培养液，用300目不锈钢网过滤，洗涤，称量鲜重，60°C烘干至恒重称量，得干重。
2.根据权利要求1所述的一种霸王鞭悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是:所述的消毒处理为:选用霸王鞭幼嫩的叶片，用漂白粉浸泡三分钟，自来水冲洗15分钟，在超净工作台上用2%的次氯酸钠消毒8分钟，无菌水冲洗至无残留。
3.根据权利要求1所述的一种霸王鞭悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是:诱导愈伤组织的条件为光照1000-15001x，光照10h/d，温度21 °C。
4.根据权利要求1所述的一种霸王鞭悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是:霸王鞭愈伤组织继代中添加了反玉米素和活性炭，反玉米素可以促进细胞的分裂生长，活性炭可以防止愈伤组织的褐化。
5.根据权利要求1所述的一种霸王鞭悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是:悬浮细胞的培养方法为愈伤组织经过继代培养之后，挑选生长均一，颗粒细小，外观湿润，质地松软的愈伤组织，用120目的不锈钢筛过滤，除去大细胞团，接种量为2g每30mL，每次换培养液，先将培养物静止，倒去上层2/3培养液，添加2/3新液，每十天换一次培养液。
【文档编号】C12N5/02GK104178450SQ201410463090
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】杨存 申请人:南京通泽农业科技有限公司