水稻抗旱相关转录因子基因OsWTF1及其编码蛋白与应用的制作方法

专利名称：水稻抗旱相关转录因子基因OsWTF1及其编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一个水稻转录因子家族AP2/ERF超家族 ERF亚家族蜡质相关基因的分离克隆、功能验证和应用。
背景技术：
水稻是我国最重要的粮食作物，水稻也是农业耗水的第一大户。近年来由于生态环境和气候变暖的影响，水资源匮乏严重制约了我国粮食的生产，并已成为水稻减产的主要原因。为培育抗干旱的水稻新品系，人们尝试通过生物技术途径来认识植物对干旱的反应机制，并利用分子生物学手段来提高植物的抗旱性。研究表明，植物能分泌蜡质到角质层表面或者角质层内，限制植物非气孔性水分丧失，具有保水抗旱的作用。另一方面，对植物转录因子的深入研究也发现含有58-59个高度保守氨基酸结构域的ERF转录因子能参与调节植物对生物及非生物因素胁迫的应答过程，提高植物对干旱、病虫、低温逆境等胁迫的耐受作用。针对我国正面临的越来越严重的缺水问题，能找到调控水稻蜡质相关基因表达的 ERF类转录因子，将对培育新型抗旱的水稻品种，提高水稻产量具有重要的意义。

发明内容
本发明的目的是提供一种与水稻抗旱性相关的蜡质转录因子基因及其编码蛋白。 本发明所提供的与水稻抗旱性相关的蜡质转录因子基因，名称为OsWTFI (与拟南芥中wmi 同源)，该基因在水稻基因组数据库TIGR中的编号为0s02g0202000，编码一个含有“AP2” 结构域的ERF类型水稻蜡质代谢转录因子，该基因的CDS全长618bp，编码205aa的蛋白。 到目前还没有任何关于OsWTFl功能的研究报道。本发明所述基因即是水稻基因组数据库 TIGR中的编号为0s02g0202000的基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表 SEQ ID No 1 的 DNA 序列；2)编码序列表中SEQ ID No 2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID No 1限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。序列表中SEQ ID No 1的DNA序列由912个碱基组成，含有2个外显子，分别为自 5'端第154位到第236位碱基和自5'端第357位到第892位碱基。该序列编码SEQ ID No 2的核苷酸残基序列。与水稻耐旱性相关的基因OsWTFl的编码蛋白OsWTFl，是具有序列表中SEQID No 2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID No :2的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No :2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID No :2衍生的蛋白质。序列表中SEQ ID No 2氨基酸残基序列是由205个氨基酸残基组成的蛋白质。含有本发明基因OsWTFl的表达载体、转基因细胞系及寄主菌均属于本发明的保护范围。
扩增OsWTFl中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。本发明的另一个目的是提供一种改良植物抗旱性的方法。本发明所提供的改良植物抗旱性的方法，是将所述与抗旱性相关基因OsWTFl构建过表达载体导入植物组织或细胞，改良植物的抗旱性。用于构建所述植物表达载体的出发载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。利用任意一种可以引导外缘基因在植物中表达的载体，将本发明的OsWTFl 基因在植物中超量表达表现出耐旱特征。本发明的基因在构建到植物表达载体上时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一个强启动子或诱导性启动子，也可使用增强子。携带有本发明OsWTFl基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射以及电穿孔等常规生物技术方法转入植物细胞，并培育出抗旱性得到改良的植物。被转化的植物寄主可以是水稻、玉米、小麦等单子叶植物，也适用于烟草、 大豆等双子叶植物，培育抗旱的植物品种。下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。


图1是采用ClustalW软件(公开使用软件)将水稻OsWTFl蛋白与其拟南芥中同源蛋白进行同源性比较结果。其中黑色表示高度保守的氨基酸。图2是OsWTFl基因编码蛋白的保守域分析图。图3是OsWTFl的全长cDNA克隆图中从左到右依次为M，分子量大小Marker ； 1，5’ RACE扩增产物；2，5’ RACE扩增的阴性对照；3，3，RACE扩增产物；4，3，RACE扩增的阴性对照。5，RACE扩增得到约750bp 左右的片段，3’ RACE扩增得到约300bp左右的片段，将5’ RACE和3’ RACE产物切胶回收， 并转入pGEM-T Easy Vector,经测序拼接获得791bp全长cDNA，编码区长度618bp，预测编码蛋白质为 205aa。克隆全长 cDNA 在 Genbank 登录(DQ468387，ABE98440)。图4是干旱和紫外辐射条件下OsWTFl的基因表达分析图。其中CK表示未处理的日本晴叶片中OsWTFl基因的表达，1表示干旱处理后水稻叶片中OsWTFl基因的表达，2表示紫外处理条件下，水稻叶片中OsWTFl基因的表达。 OsActin基因的表达被作为内参(OsActin的表达一轮，28cycles)。图5是OsWTFl超量表达转基因植物的PCR和RT-PCR检测结果图。其中A =OsffTFl超量表达转基因植物的PCR检测。P表示含有OsWTFl基因片段的质粒作为阳性对照；1，2为非转基因植株作为隐性对照；3-16为独立转基因植株株系。B =OsffTFl超量表达转基因植物的RT-PCR检测。P表示含有OsWTFl基因片段的质粒；CKl和CK2为非转基因对照植株，其余为独立转基因株系，OsActin基因被作为内参。图6是OsWTFl超表达水稻植株叶片表皮蜡质晶体的扫描电镜观察结果。其中ai为野生型对照植株叶片腹面；a2为为野生型对照植株叶片背面办为 OsffTFl超表达转基因水稻叶片腹面；b2为OsWTFl超表达转基因水稻叶片背面。图7是OsWTFl超量表达转基因植株叶片的叶绿素浸提率分析图。
图8是OsWTFl转基因植物对干旱的抗性反应显示图。是对培养于温室的分蘖期水稻植株进行抗旱处理实验。其中a为野生型(WT)日本晴植株，b为OsWTFl转基因植株。如图分别为干旱处理前，OsffTFl超表达转基因水稻Id1与野生型 的比较；干旱处理一周后，OsffTFl超表达转基因水稻b2与野生型a2的比较；干旱处理一周后再复水一周，OsffTFl超表达转基因水稻b3与野生型a3的比较。
具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、植物抗逆性相关蛋白OsWTFl及其编码基因的获得微陈列(Microarray)分析的结果表明水稻0s02g0202000基因是一个AP2型的转录因子基因，编码一个含有“AP2”结构域的ERF类型水稻蜡质代谢转录因子。利用BLAST 程序发现它与拟南芥中wmi高度同源，对wmi的研究表明它是参与蜡质代谢途径的一个转录因子。于是我们将0s02g0202000基因命名为OsWTFl。根据水稻已公布的BAC文库 AP004869 序列设计 5，RACE 扩增引物WTFlRl 和 WTFlXbaR, 3' RACE 扩增引物WTFlFl 和 WTFlBamF，进行OsWTFl基因的全长cDNA扩增。扩增条件参照SMART RACE cDNA Amplification Kit 说明进行操作。5’RACE 在Superscript III逆转录酶的作用下，以4 μ L水稻幼穗总RNA为模板、 5，CDS primer 和 SMARTII A oligo 为引物，合成 5，RACE 的单链 cDNA。3’RACE 在Superscript III逆转录酶的作用下，以4 μ L水稻幼穗总RNA为模板， 加入 3，CDS primer A 和 DTT、dNTP 及 First-strand Buffer，42°C加入 1.5h，合成 3，RACE 的单链cDNA。5’ RACE单链cDNA和3’ RACE单链cDNA合成后，稀释反转录产物100倍，5’ RACE 以5，RACE单链cDNA为模板，以UPM和WTFlRl为引物；3，RACE以3，RACE单链cDNA为模板，以UPM和WTFlFl为引物进行降落PCR，反应条件94°C 5s, 72°C 3min，5循环；4°C 5s， 70 °C 10s, 72 °C 3min，5 循环；94°C 5s, 68 °C 10s, 72 °C 3min，25 循环；4°C 保存。将第一轮 PCR产物分别以UPM、WTFlXbaR和UPM、WTFlBamF进行PCR反应，扩增条件为94°C 3min ； 94°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin，35 循环；72°C 5min ；4°C保存。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收5’ RACE和 3’ RACE片段，将回收片段与载体pGEM-T Easy连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，根据PGEM-T Easy载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，结合图3，测序结果表明扩增到了 OsWTFl基因5’端和3’端的蛋白编码区片段，然后再从2个有相互重叠序列的3，-RACE和5，-RACE产物中获得全长OsWTFl基因的全长cDNA。 OsffTFl基因的蛋白编码区序列如SEQ No 3所示，由618个脱氧核糖核苷酸组成，编码SEQ No :2所示的蛋白。特异性引物信息如下上游引物WTFlBamF 5，-AT GGATCC ATCTCTGCCTCCCCTGTCCTTC-3，，加粗带下划线的碱基为BamHI酶切位点，
下游引物WTFlXbaR 5，-AT TCTAGA CGTCGTTTCATCCAAGCCTTTC-3，，加粗带下划线的碱基为XbaI酶切位点；上游引物WTFlFl :5，-GACTCCAACTGGGTGATGACGGTG-3，，下游引物WTFlRl :5，-TTGCTACGGGCGTCCTGGTCTGC-3，。实施列2、OsffTFl基因的Blast比对，编码蛋白的亚细胞定位和保守结构域分析参见图1 及图 2，通过 http //www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/ 网站的 CLUSTAL W和DNAMAN软件进行同源性分析。水稻OsWTFl基因与拟南芥蜡质代谢转录因子基因 WINl (SHNl)的同源性较高，OsWTFl与拟南芥基因WINl (atlgl5360)氨基酸的同源性是 61%，与At5g25390的氨基酸同源性是54%，与At5glll90的氨基酸同源性是55%。拟南芥基因Wim(SHNl，atlgl5360)、At5glll90、At5g25390基因为调控蜡质代谢相关基因，推测OsWTFl基因可能与水稻蜡质代谢相关。通过http://W0lfpS0rt. org/网站亚细胞定位分析软件分析，找到与OsWTFl同源性较高的已知基因有11个定位在细胞核中，2个定位在叶绿体中。初步确定，OsWTFl基因编码的蛋白定位在细胞核中。根据水稻OsWTFl基因编码蛋白的序列保守区用 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi 提供的软件进行功能分析，并用http^/swissmodel. expasy. org/软件进行蛋白质结构预测， 发现OsWTFl有一个AP2结构域，在6-66aa处，属于EREF类的转录因子。实施列3、OsffTFl基因在逆境条件下的表达差异分析为检验OsWTFl基因在逆境条件下的反应，采用干旱和紫外辐射方法处理水稻叶片并检测处理后植株中OsWTFl基因的表达。常规栽培的水稻至分蘖末期分成三组，一组对照，在自然光下生长；紫外处理组在自然光照条件下另加UVB管提供UVB辐射(15W，上海顾村光电仪器厂)。紫外灯管定位于植物上端20-30cm，UVB辐射光期8h/d (处理时间为每天9 00-17 00)，处理一周时间。干旱处理组则在自然光下生长另加6天干旱处理。处理后取叶片采用Invitrogen公司的Trizol 抽提液提取总RNA，并以总RNA为模板对逆境处理后叶片中OsWTFl基因的表达进行RT-PCR 分析。反转录体系2 μ L 50ng/ μ L Olig (dt), 4. 0 μ L 5Χ first strand buffer>0. 4μ L 1 OOmmo 1/L DDT、2. OyL lOmmol/L dNTPU. 0μ L M-MLV 200U/μ L，再加入 DEPC 处理的 H20 至 20yL。于 37°C 水浴 lh。置于 95°C 下 5min，灭活 M-MLV，加入 2 μ L TE (pH = 8. 0)，合成单链cDNA。以合成的各cDNA第一链为模板，用WTFlBamF和WTFlXbaR检测OsWTFl基因的表达。发现正常栽培条件下，OsWTFl基因在水稻叶片中的表达较低，反转录的cDNA经过两轮PCR(第一轮28cycles第二轮30cycles)后才见表达的条带。以OsActin基因被作为内参，反应条件为94 °C预变性3min ；94 °C 30sec, 60°C 30sec ；72°C 35sec，28个循环；72°C延伸IOmin0其特异性引物如下ActinBamF :5’ -ATGGATCCAGGTAATAAGATCTTCAACAC-3，ActinSpeR 5' -ATACTAGTACCTGGAAACACACAAGACA-3'如图4所示，经一段时间的紫外和干旱处理后，水稻叶片中OsWTFl基因的表达均比对照明显增加，干旱处理对OsWTFl表达的增加比经紫外处理更显著。实施列4、OsffTFl基因超量表达载体的构建和转化为了能更好地阐明OsWTFl基因的功能，申请人将其在水稻中超量表达，从转基因植物的表型来进行OsWTFl基因的功能验证。
超量表达载体构建方法如下将全长OsWTFl全长cDNA(SEQ ID No 3)定向克隆到 pCambial300M载体35S启动子下游，用于构建水稻35S_0sWTFl超量表达的植物双元表达载体。经冻融法转入农杆菌EHA105中后，通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法将其导入到水稻品种“日本晴”中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、 炼苗移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻遗传转化方法应用Qu等人报道的方法(Qu et al. ，2006)。实施列5、OsffTFl基因超量表达转基因植物的分子检测本发明OsWTFl基因超量表达转基因分子检测采用PCR和RT-PCR法进行。5. IOsffTFl基因超量表达转基因植株DNA层面上的PCR分子检测用CTAB法提取水稻基因组DNA 剪取水稻叶片约IOOmg在研钵中用液氮磨成粉状后，加入60°C预热的600 μ L DNA提取缓冲液，60°C水浴保温30-60min，不时温和摇动。加入600 μ L等体积氯仿/异戊醇，颠倒混勻，室温下静置5-lOmin，使水相和有机相分层。室温下10000r/min离心30min。取上清液至另一 1. 5mL eppendorf管，加入一倍体积异丙醇， 混勻，_20°C放置30min后10000r/min离心IOmin ；70%酒精洗两遍，晾干，加入100 μ L TE 溶液溶解。OsffTFl基因超量表达转基因植株的PCR鉴定取具有潮霉素抗性的转OsWTFl水稻植株基因组DNAlOOng，以HygF和HygR引物进行PCR扩增鉴定潮霉素编码基因，以引物WTFlBamF和WTFlXbaR进行PCR扩增鉴定，同时设置过表达质粒为阳性对照，未转基因植株基因组DNA为阴性对照。结果如图5中A所示，所有转基因阳性植株都能扩增出水稻基因组本身具有的约820bp带内含子的DNA片段和插入到水稻基因组中的OsWTFl全长约700bp的cDNA片段，而未转基因的阴性对照植株和转基因阴性植株都只能扩增到约820bp带内含子的水稻基因组自身带有的DNA片段，质粒对照也能扩出约700bp的OsWTFl全长cDNA片段。PCR检测获得转OsWTFl全长cDNA的阳性植株22株。5. 20sffTFl基因超量表达转基因植株RNA层面上的RT-PCR分子检测提取DNA水平上检测为阳性植株的幼穗部总RNA和未转基因的日本晴幼穗总RNA， 反转录成cDNA为模板，用WTFlBamF和WTFlXaR为引物进行PCR，分析目的基因在转录水平上的表达情况，并以ACTIN基因的表达作为内参。RNA的提取和RT-PCR反应的方法同实施列3中的RT-PCR方法。结果如图5中B所示，与未转基因植株相比，OsWTFl已经在部分转基因植株中得到不同表达程度的增强表达，其中6号转基因植株获得强表达，可以用于进一步表型鉴定。实施列6、OsffTFl基因超量表达转基因植株叶片表面蜡质的扫描电镜观察取同一生长期超量表达转OsWTFl基因植株和未转基因的对照植株的水稻全展叶叶片用戊二醛固定，保存于4°C的冰箱内，按扫描电镜的要求脱水、干燥后，将样品于JEOL JFC-1600镀膜机上喷金镀膜，于JSM-6360LV扫描电镜下观察并拍照。结果如图6所示 OsWTFl超量表达植株叶片背面(b2)和腹面(bl)都有表皮蜡质明显增厚、乳突增多增大、乳突形态发生改变，乳突高度明显增加，变成接近圆柱体的形状等形态上的变化，而且这些变化在转OsWTFl基因水稻叶片的腹面(bl)表现更加明显。实施列7、OsffTFl基因超量表达转基因植株叶片的叶绿素浸提率
转OsWTFl基因植株叶片的叶绿素浸提率按一定时间内叶绿素浸提量占叶绿素总量的百分比进行。取OsWTFl基因超量表达转基因植株和对照植株(未转基因的野生型植株)在同一抽穗期剑叶下第一片功能叶，自来水冲洗后称重，各取5g放入三角瓶中，加入30mL 80% 的乙醇，置于黑暗条件下偶尔摇动。前Ih每隔IOmin从各个样品中各取400 μ L浸提液，然后在901^11、1201^11再各取40(^1^浸提液，测量其在λ 664ηπι和λ 647nm波长下的吸收值。 按公式计算叶绿素总量(mmol/g) = 7. 93A664+19. 53A647。结果如图7所示，随着时间的推移，转基因和对照野生型植株的叶绿素浸提率逐渐提高，但在浸提的全部过程中，转OsWTFl 基因植株的叶片叶绿素浸提率一直都比对照低，酒精浸提120min后，未转基因野生型植株叶片中大约80%的叶绿素被浸提出来，而转OsWTFl基因植株的叶片浸提率却不到40%，表明转基因植株对叶绿素的通透性降低。实施列8、OsffTFl基因超量表达转基因植物对干旱处理的反应在实施例5结果前提下，本发明首先对OsWTFl基因超量表达转基因植物T3 代植物进行了纯合体筛选。具体步骤如下每个植株选取30粒种子去壳，70%乙醇表面消毒lmin，30%漂白液消毒30min，灭菌水洗5遍，用无菌镊子播种在含潮霉素的 1/2MS (Murashige & Skong)培养基平皿上进行筛选，野生型日本晴作为对照，培养条件为 28°C，持续光照强度为25001UX，16h光照/8h黑暗。两周后统计发芽及成活率，本发明默认 100%成活率的植株为纯合体，每个纯合体植物单独取样并进行相应的分子检测。取分子检测和潮霉素筛选结果一致的株系用于接下来的表型鉴定。本发明选取三条独立的超量表达转基因纯和水稻用于表型筛选。取纯和转基因株系种子和野生型日本晴种子发芽并常规培养至分蘖期中期，不浇水进行干旱处理。干旱一周后，如图8所示，OsWTFl超表达植物基本保持着正常的生长状态(b2)，而对照野生型(a2)大多数萎焉，叶片下垂，出现严重的旱胁迫表现。干旱一周后复水一周，如图8所示，绝大多数对照野生型植物叶片出现不可恢复的干枯，仅有少数的两个分蘖返青，见a3 ；而OsWTFl超表达植物均可恢复至正常生长状态， 见b3。植物在干旱后的复水能力也是抗旱的一个重要指标。干旱及复水实验表明，OsWTFl 超量表达增强了植物的耐旱性，结果证实OsWTFl对干旱的响应起了重要的作用。
权利要求
1.一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中SEQID No :2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中SEQID No 2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于所述一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加是指在SEQ ID No 2的第1位氨基酸至第206位氨基酸进行取代和/或缺失和/或添加。
3.权利要求1或2所述蛋白的编码基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于如下(a)或(b)或(c)的基因(a)其核苷酸序列为序列表中SEQID No :1自5'末端第1位至第912位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子，(b)其核苷酸序列为序列表中SEQID No 1所示的DNA分子，(c)在严格条件下与(a)限定的DNA序列杂交的编码所述蛋白质的DNA分子。
5.含有权利要求3或4所述基因的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为 pCambial300M-0sWTFl，所述 pCambial300M_0sWTFl 是在 pCambial300M 载体的多克隆位点插入权利要求3或4所述基因得到的重组表达载体。
7.含有权利要求3或4所述基因的转基因细胞系或重组菌。
8.一种培育抗旱水稻的方法，是将权利要求5或6所述的重组表达载体导入水稻细胞中，得到抗旱水稻。
全文摘要
本发明公开了一种水稻抗旱相关转录因子基因OsWTF1及其编码蛋白与应用，该水稻抗旱相关蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中SEQ ID No2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中SEQ ID No2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。该水稻抗旱相关蛋白及其编码基因可用于培育抗旱水稻。
文档编号C12N15/63GK102351950SQ20111033299
公开日2012年2月15日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者刘爱玲, 周小云, 张先文, 邹杰, 陈信波 申请人:湖南农业大学