专利名称：一种水稻耐冷相关转录因子基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及一种与水稻耐冷相关的基因， 以及将该基因转化到拟南芥植物中，提高植物的耐冷能力的应用。
背景技术：
干旱、高盐和低温是诸多非生物逆境中对作物危害最为严重的自然灾害， 它严重影响了作物的产量和种植区域。据统计，世界干旱、半干旱地区占地球
陆地面积的33%，盐碱地占地球陆地面积的7.6%，另外还有很多地区常年受 低温冷害的影响。而在我国干旱和半干旱耕地面积为5. 7亿亩，占全国总耕地 面积的38%。干旱少雨导致大批植被死亡，土壤风化，土地荒漠化加剧，导 致境内沙尘暴频繁发生，这不仅严重制约了粮食生产，而且日益恶化人们的生 存环境。低温冷害是我国南北方农业生产中常见的自然灾害之一，严重限制着 早春作物的种植和晚秋作物的收获。除此之外，我国还有大片的盐渍土壤等待 进一步的开发利用。因此，长期以来，人们都非常关注对干旱、高盐和低温等 非生物胁迫的研究。目前，植物与非生物逆境之间的关系在细胞分子水平上已 进行了一定的研究(Xkmg， etal.2002)。研究植物抗非生物逆境的分子机理和 克隆与抗逆相关的基因，对植物抗逆性能的提高具有重要的指导意义。
干旱、高盐和低温都会造成植物不同程度的脱水，形成水分胁迫逆境，引 起一系列的生理代谢变化，所以我们又将干旱、高盐和低温等非生物胁迫称为 水分胁迫，或渗透胁迫。在逆境条件下，植物感受水分胁迫并通过一系列的信 号转导，植物细胞开始合成一些新的与抗逆相关转录因子，同时增强已有的逆 境相关转录因子的表达来调控其它抗逆功能基因的作用，再由这些功能基因去 执行各种各样的生理功能，如转变细胞代谢，合成脯氨酸、多胺等抗渗透物质， 调节离子平衡，调控基因表达等(Bohnert, etal. 1995)。在各个物种中都已发
现大量的水分胁迫应答基因，通过与己知蛋白质的同源序列比较，己推测出这些基因所编码蛋白的功能。水分胁迫诱导的基因不仅通过生成重要的蛋白质保 护植物细胞不受水分缺失的影响，并能够调控水分胁迫应答中信号转导的基
因。根据这个区别，可将这些基因产物分成两类，即功能蛋白(functional proteins)和调节蛋白(regulatory proteins)。前者包括在渗透胁迫作用的诸多 蛋白如与细胞膜水分运输相关的水分通道蛋白，各种渗透保护剂(糖，脯氨 酸，甜菜碱)合成所需的酶蛋白，大分子渗透保护蛋白(LEA，渗透蛋白，抗 冻蛋白，伴侣蛋白以及mRNA结合蛋白)，解毒酶类(谷胱甘肽一S—转移酶、 超氧化物歧化酶和抗坏血酸过氧化氢酶等)，蛋白质转换的蛋白酶类(巯基蛋 白酶、泛醌蛋白质)等。后者包括与调控信号转导和基因表达相关的蛋白因子， 如蛋白激酶(MAPK:活化丝裂素的蛋白激酶，MAPKK:磷酸化的MAPK激 酶，MAPKKK:磷酸化的MAPKK激酶，S6K:核糖体S6蛋白激酶，CDPK: 依赖Ca2+的蛋白激酶)，转录因子(CBF、 bZIP、 MYB、 MYC等等)，PLC及 14一3—3蛋白等，这些调节蛋白对进一步了解水分胁迫反应显得尤为重要。
当前，有关转录因子的研究，已成为植物逆境调控领域的热门课题。应 用DNA芯片研究基因的表达谱发现，受低温、干旱和高盐逆境调控的基因非 常多(Bohnert， etal. 2001; Kawasaki， etal. 2001; Sedi， etal. 2001)，尽管 其中大部分基因的功能及信号转导路径还不清楚，但有些逆境响应基因已得 到了深入的研究，最有代表性的是W"A COi 7S/i:7777S等，这些基因的启 动子区包含有ABRE和DRE/CRT顺式元件(Yamaguchi-Shinozaki, 1994)。这 些DRE/CRT顺式元件几乎都有一个保守的由5个碱基对组成的核心序列 CCGAC。结合DRE/CRT顺式元件的转录因子己得到分离，如属于EREBP/AP2 类转录因子的CBF1/DREB1B、 CBF2/DREB1C、 CBF3/DREB1A (Stockinger， etal. 1997; Gilmour,etal. 1998; Medina, etal. 1999)等。这些于转录相关的 CSF基因一起串联排列在拟南芥的第四号染色体上，组成一个小基因家族。 CBF基因为低温诱导后迅速表达的基因，其编码的转录激活子控制着包括 DRE/CRT调节因子基因的表达。JagloOttosen等(1998)将CBF7基因导入拟 南芥，不需低温刺激就可诱导一系列C(9i 基因的表达，如C(9i M.6 ,Q9i 7"",CC^"7和CO及7S等，使未经低温驯化的植株就有较高的抗冻性。 C3F3也可诱导低温调节的靶基因(COi )表达。拟南芥CBF3基因的过度表达 提高了耐低温胁迫能力,且导致许多与低温胁迫有关的生理生化变化，如脯氨 酸和可溶性糖(蔗糖、棉籽糖、葡萄糖和果糖等)含量提高。拟南芥C^i^基因 的过度表达提高了耐低温和耐干旱的能力。
目前有关CBFs类植物抗逆有关转录因子的研究大部分来自拟南芥，而其 它物种的研究报道不多。水稻中的Z)i^万L4基因的过量表达能提高植物的低 温、干旱和高盐的耐受性(Yusuke Ito, et al, 2006; Joseph, et al， 2003)。对水稻 CBF基因家族的功能研究还比较少，存在很多问题没有解决。如这些转录因 子的功能是什么？他们是如何参与逆境诱导的信号转导途径？各种转录因子 在逆境应答过程中是如何分工协作的？通过转基因拟南芥来研究水稻CBF类 转录因子的功能，可能对这些问题的解决有所帮助。
酵母单杂交体系含有两个质粒，其中一个为含物种cDNA库的酵母表达 质粒，用于表达cDNA与GAL4激活功能域的融合蛋白；另一个质粒将含cis 盒的DNA片段(即鱼饵)与带有基本启动子的/^Z报告基因相连，构建鱼 饵质粒。当这两个质粒转化到酵母中后，若cDNA库中有一个cDNA克隆所 编码的DNA结合蛋白能识别cis盒的DNA片段，并与之结合，则融合蛋白 中的GAL4激活功能域能激活与鱼饵连接的基本启动子，而使/"cZ基因表达， 菌落在X-gal平板上显现蓝色。
本发明以水稻为研究材料，构建一个含水稻cDNA库的酵母表达质粒 pPC86 (Cheway,et al. 1992)。为了克隆水稻中的抗逆相关的转录因子基因， 首先合成了相关的顺式元件，将它们插入到大肠杆菌-酵母穿梭质粒 pLGA-265UPl中(Guarente，et al. 1983)，构建鱼傳质粒，将两个质粒共转化 酵母，通过/"cZ基因的表达来筛选转录因子。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻中与耐冷相关的转录因子基因。 所说的水稻耐冷相关转录因子基因，是i C万i^，它具有SEQIDNO.l的序列。
上述的转录因子基因编码的蛋白质，它具有SEQIDN0.2的氨基酸序列。 能与CCGAC顺式元件结合。
上述的转录因子基因AC^^V能用于植物转化，提高植物的耐冷和耐高盐 的能力。可在培育耐冷和耐高盐的转基因植物中的应用。
上述所说的水稻耐冷相关转录因子基因及CSiW，是通过以下方法得到-
(1) 合成一个具有SEQ IDNO.3序列的顺式元件；将该顺式元件通过^0 I和位点插入到pG221质粒(引自上海农科院)，该质粒是来自大肠杆 菌-酵母穿梭质粒pLGA-265UPl(Guarente， etal. 1983)，替换其中的CCAAT盒， 构建用于酵母单杂交筛选的鱼饵质粒pLG cold;
(2) 采用SMARTcDNA文库构建试剂盒构建水稻冷害诱导的表达文库； 将cDNA连接到经酶切处理好的pPC86载体(Chevray， etal. 1992)，连接产 物利用电击仪高效转化DH5(x感受态中；
(3) 采用酵母单杂交方法将以上(1)和(2)的两个质粒共转化酵母， 通过/acZ基因的表达筛选转录因子。
(4) 通过核苷酸序列测定筛选的水稻cDNA的表达质粒，获得插入载体 中的水稻序列，进行生物信息学分析，搜索到NCBI数据库中CBF/DREB类 转录因子的核苷酸序列与其同源关系最近，二级结构示意图(图3)显示其 氨基酸序列与AP2类转录因子保守的DNA结合域同源关系很近，说明其属 于AP2类转录因子。进化树(图4)分析则表明其是属于AP2类转录因子的 亚族DREB类转录因子。CBF/DREB类转录因子为一类耐冷相关转录因子， 因此将其归入CBF类转录因子，并命名为RCBF4。认为其为水稻中与耐冷相 关的转录因子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2;编码该转录因子的基因的碱 基序列如SEQIDNO.l。
本发明获得的耐冷相关转录因子ACSF4基因，分别用^W2M和&cl进 行双酶切后，通过T4 DNA连接酶将它与含有双35S启动子的pCAMBIA1301(BioForge公司)植物表达载体连接，经酶切鉴定和序列测定获得了含有目 的基因及C^i^的重组质粒pCAM RCBF4。该表达载体还包含Gf/S报告基因 和潮霉素抗性标记基因。
本发明利用电击法将重组质粒pCAMRCBF4导入根癌农杆菌中，根癌农 杆菌菌株包括EHA105， LBA4404, GV3101， AGL-1 (Sambrook， etal. 1989; 本实验室保存)。通过农杆菌蘸花法将耐冷相关的转录因子及CS7^基因转化 到拟南芥中(Clough，etal. 1998)，然后验证了转基因植物提高了对冷和高盐 的耐受性。
本发明的耐冷基因是能够针对性获得调控植物耐冷和耐高盐的转录因子 基因；且该抗逆基因来自植物本身，对环境影响较小。
图1用于筛选耐冷转录因子基因的酵母鱼饵质粒的构建。
图2耐冷转录因子基因i C^F4与冷应答顺式元件的结合特性。
其中，A为结合前；B为结合后。
图3为RCBF4与AP2类转录因子保守的DNA结合域比对以后所作的二级结 构示意图
图4为RCBF4与AP2类转录因子保守的DNA结合域比对以后所作的进化树 图5拟南芥转化ACBi^基因后表现出耐冷性提高的实验 图6拟南芥转化7 GBi^基因后表现出耐盐性提高的实验。
具体实施例方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明， 一般具有本领域普通技术人员通常理解 的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为 了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述 的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
以下为所用到的生物材料
pLGA-265UPl(G彦nte， 1983);
pG221(由上海农科院生物中心提供)；根癌农杆菌EHA105 (Hood, Gelvin， 1993); LBA4404(Holtorf， et al. 1995); GV3101 ( Koncz and Schell, 1986); AGL-1 (Lazo, et al. 1991)(本实验室保存， 可向公众提供20年)
实施例l:冷应答顺式元件的全合成及鱼饵质粒构建
利用PCR将两个完全一样的顺式元件串联。在串联的顺式元件5'端加入 Iol酶切位点，3'端加入^m/ZI位点。串联后的顺式元件长度为107bp。 该顺式元j牛序歹U为ACCCTCGAGTCTAGAGTCGACATATGCCGCGGA
GCGGCCGCATGCATCCCGGGATCCTG。 ( SEQ ID NO.3 )
构建策略如图1，以pG221为出发质粒，pG221质粒是由带有/acZ报告 基因、URA选择标记和2u复制序列的大肠杆菌一酿酒酵母穿梭质粒 pLGA-265UPl改造而来，细菌/acZ报告基因由酿酒酵母Cyc/的基本启动子 控制，顺式元件的DNA片段作为鱼饵置于qyc/的基本启动子上游，调节/acZ 基因的表达。将顺式元件的DNA片段插入到质粒pG221中，替换其中的 CCAAT盒，构建用于酵母单杂交筛选的鱼饵质粒pLGcold。 实施例2:水稻cDNA库构建。
取15天苗龄的水稻幼苗，品种为IR36，经0'C低温处理8小时后，液氮 速冻，放置-70'C冰箱中保存以备提取总RNA。酵母表达载体质粒pPC86购 自Invitrogen公司；cDNA建库试剂盒SMART cDNA文库构建试剂盒为 Clontech公司产品；DNA柱回收试剂盒购置Amersham公司；总RNA抽提 采用QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini Kit提取；各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶均购自上海Takara公司。
水稻cDNA的合成及cDNA文库的构建按Clontech公司SMART cDNA Library Construction Kit说明书操作进行第一链合成。
以合成的cDNA第一链为模板，以GAL4 5'AAAGTCGACGGATGTT TAATACCACT和TAD4 5,AAAGCGGCCGCTTGATTGGAGACTTGACC为 引物，利用LD-PCR进行cDNA扩增，扩增条件为94°C预热1 min; 94°C, 30 s， 60°C， 30 s， 72°C, 3 min。共20个循环。PCR结束后，酚氯仿 抽提，再加入2倍体积的无水乙醇进行沉淀。沉淀用30^1水溶解，各加入lpl 和7W^I酶切消化，DNA柱回收大于400 bp的cDNA。将cDNA连接 到经上述酶切处理好的pPC86载体，连接产物利用电击仪高效转化DH5a感 受态中。
实施例3:水稻中与冷应答顺式元件DNA结合蛋白cDNA筛选 将鱼饵质粒转化酵母细胞 EGY48 ( MATa,his3 trpl ura3-521eu::pLeu2-LexA叩6)，转化子在无尿嘧啶的基本培养基上培养(Ito ,et al. 1983; Gietz，eta1.2006)。
制备含鱼饵质粒的酵母感受态细胞，每次将50pg含水稻cDNA库的 pPC86质粒DNA转化到感受态酵母细胞中，在不含尿嘧啶和色氨酸的SC培 养基上培养，从而选择带有鱼饵质粒和插入有水稻cDNA的pPC86质粒的酵 母转化子。3(TC培养48小时后，利用硝酸纤维素膜将生长的转化子影印到含 有X-gal的平板上进行显色反应(如图2，图中B显示，结合后出现蓝色菌落)， 挑取蓝色的酵母菌落。
实施例4:酵母阳性克隆中带水稻cDNA的pPC86质粒的鉴定 为了排除初筛得到的蓝色酵母中存在的假阳性现象，抽提每一个酵母阳 性菌落的DNA，用电击法将酵母DNA转化到大肠杆菌MC8菌株(氨基酸缺 陷型thi-，trp-, ura-，leu-,his-)细胞中(Qin, et al. 2007)，先在含氨苄青霉素的 2YT平板上培养，然后影印到不含色氨酸的M9培养基上培养。由于pPC86 质粒上带有编码TRP合成酶的标记基因，因此在不含色氨酸的平板上生长的 细菌为含有插入水稻cDNA的pPC86载体。从大肠杆菌MC8菌株中抽提质 粒DNA，将其转化含有鱼饵质粒的酵母菌株EGY48，转化子置于X-gal平板 上进行显色反应，挑选能重复变蓝色的酵母菌落。
水稻转录因子cDNA的核苷酸顺序测定，推测氨基酸顺序和功能分析。 抽提确认为阳性菌落的酵母菌株DNA，转化大肠杆菌DH5oc，抽提其中的质 粒(含有插入水稻cDNA的pPC86载体)，利用pPC86载体上的通用引物进行序列测定。根据DNA测序结果，到数据库NCBI里进行序列比对，发现这 个基因跟CBF/DREB类转录因子同源关系最近，因此我们将其归入CBF类转录 因子，因这个基因是从水稻中克隆出来的，因此将其命名为沉SW 。 RCBF4 与AP2类转录因子保守的DNA结合域比对以后所作的二级结构示意图及进化 树如图3和图4。最终获得与冷应答顺式元件结合的转录因子基因RCBF4， 氨基酸顺序为SEQ IDN0.2。
实施例5:转录因子基因7 C万i^植物表达载体构建
首先通过PCR方法将i C^^基因扩增，并在基因的两端加入BamM和 ^cl酶切位点，将PCR片段回收，进行T/A克隆和序列测定，获得含有i CBi^ 基因片段的质粒pRCBF4。抽提pRCBF4质粒，分别用5amM和5WcI进行 双酶切，分别回收DNA片段，通过T4DNA连接酶将AC57^基因与含有双 35S启动子的植物表达载体pCAMBIA1301质粒连接(Ohta,etal. 1990)，酶切 鉴定和序列测定获得了含有目的基因i C^i^的重组质粒pCAM RCBF4。该 表达载体还包含Gt/S报告基因和潮霉素抗性标记基因。
实施例6:农杆菌培养和植物转化 农杆菌菌株为根癌农杆菌EHA105， LBA4404， GV3101， AGL-1菌株。质粒 pCAM RCBF4经电击法导入农杆菌中。挑取单菌到25 ml YEB培养基(50mg/1 利福平)培养过夜，取5ml菌液转接到100mlYEB培养基(50mg/1利福平)， 培养至OD600 = 0.7-0.8，菌液冰上放置10 min， 5000 rpm离心10 min ， 4°C ， 收集菌体，加入100ml无菌双蒸水清洗两次。加入4mll0y。甘油悬浮菌体， 转到50 ml离心管。5500 rpm离心10 min ， 4°C 。收集菌体，加入500 pl 10°/。 甘油悬浮菌体，转到1.5ml离心管。取70nl感受态细胞，加入lpl重组质粒 pCAM RCBF4。用去头的枪头混匀，转到O.lcm电击杯中。电击参数200 Q， 1.7 KV， 2.5F，电击后立即加入800nlSOC培养液。培养1小时后，取 100pl涂抗性板筛选转化子，28'C培养。
植物转化采用蘸花法将含目的质粒的不伺菌株的农杆菌单菌落接种在5 ml含各菌株相对应抗生素的LB培养基中28'C培养2天。取5 ml菌液转到500 ml的液体LB培养基中28'C培养16-24 h (OD=1.5-2.0).液体可以在4'C 保存30天。室温下离心收集菌体，4000 g离心10min。用等体积5%的新鲜 蔗糖溶液悬浮。加入0.02y。的Silwet-77混匀后置于烧杯中。转化时将拟南芥 倒置后浸入菌液中约10 s，莲座和花序都要侵染，侵染后使吸附于植株上的 菌液空气干燥3-5秒，用保鲜膜罩住拟南芥，以保持湿润环境，水平放置22'C 下避光培养，24 h后去掉保鲜膜直立培养。每个菌株用300 ml转化，转2-3 盆。隔7天后再转化1次。转化后不要放置在高温和强光下，揭开保鲜膜后 要保持一定湿度，再生长1个月后收种子。利用50 pg/mL潮霉素进行转化 植株筛选。
实施例7:转录因子基因WCSi^转化植物后的抗逆分析 将转基因拟南芥自交纯合3代，获得3个纯合转化株系(8217-l，-2，-4)的种 子。播种后，幼苗生长10-20天，转入4'C低温驯化24h，然后转入一20'C处 理30min，然后再移置到正常温度，观察植物的耐冷效果。如图5所示，正 常温度下生长的野生型和转基因拟南芥在长势和长相上没有明显差别，而在 -2(TC生长30 min后转入正常温度生长时,野生型对照和转化株系的表现都有 不同程度的死亡和复活，但存活率明显不同,野生型只有33.3%，而转化株系 表现58.3-75%的存活率。结果表示转基因系植株提高了耐冷能力。
将转基因拟南芥T3代纯合种子分别铺在含有OmM NaCl、 75mM NaCl、 lOOmMNaCl的培养基上，每天统计萌发率，观察植物的耐高盐效果。如图6 所示，在无外加NaCl的情况下,野生型和转基因系的萌发率没有差别，在5 天后均达到95%以上。在75mMNaCl浓度下，野生型与转基因系的萌发率则 表现明显差别，野生型5天后萌发率仅40%,而转基因系为65-80%, 10天后 野生型为60%，转基因系为90%以上。100mMNaCl浓度下，野生型5天后 萌发率仅20%，而转基因系为38-52%， 10天后野生型为50%,转基因系为 90%。可见转基因系植株明显提高了耐盐能力。SEQUENCE LISTING 〈110〉扬州大学
〈120〉一种水稻耐冷相关转录因子基因及其应用 <160〉3
<210>1
<211〉762
<212〉DNA
〈213>水稻(O，爐-vo! L.)
<400〉1
atgg卿卿acaccgccgccagcgggc犯
tcgtcgccgaagcggccggcggggcgaacc
cgtggggtgcgatggcgtgggtgcgcgggg
agccgcggtgaccgtttxtgg由ggcacg
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aaaggatcgttgtgcctgcg aasaaatccc600
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犯t3tc犯gtctttctgcta720
3g762
〈210〉2
〈211>254
〈212>PRT
〈213〉水稻(C^ya rf/va L.) 〈400〉2<formula>formula see original document page 13</formula>Leu Thr Met lie Thr His His Leu Phe Gin Trp Arg Arg 241 245 250
<210〉3 〈211>107 <212〉DNA <213〉人工序列
〈400〉1
accctcgagt ctagagtcga catatgccgc ggatatctag aggccgacct gatggccgac 60 ctgatggccg atcgatccat ggcggccgca tgcatcccgg gatcctg 10权利要求
1、一种水稻耐冷相关转录因子基因，其特征在于，它具有SEQ ID NO.1的碱基序列。
2、 一种由权利要求l所述的转录因子基因编码的蛋白质，其特征在于， 它具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
3、 权利要求1所述的转录因子基因用于植物转化，提高植物的耐冷和耐 高盐的能力。
全文摘要
本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及一种与水稻耐冷相关的基因及其应用。所说的水稻耐冷相关转录因子基因，它具有SEQ ID NO.1的碱基序列。该转录因子基因RCBF4能用于植物转化，提高植物的耐冷和耐高盐的能力。该抗逆基因来自植物本身，对环境影响较小。
文档编号C07K14/415GK101429511SQ200810243070
公开日2009年5月13日 申请日期2008年11月28日 优先权日2008年11月28日
发明者姚泉洪, 扬 张, 彭日荷, 洪义欢, 熊爱生, 陈建民 申请人:扬州大学