一个能显著提高灰飞虱抗生性的水稻染色体片段及其ssr标记的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一个能显著提高灰飞虱抗生性的水稻染色体片段及其SSR标记，属于农业生物技术领域。所述的灰飞虱抗生性位点，命名为Qsbph4b，位于水稻4号染色体分子标记RM349与RM124之间。用分子标记RM349引物或者用分子标记RM124引物扩增水稻灰飞虱抗性鉴定材料，若分别能够扩增出146bp和217bp的扩增片段，则标志着水稻材料内存在灰飞虱抗生性位点Qsbph4b。采用本发明的染色体片段及其SSR标记来检测水稻灰飞虱抗生性水平，能极大地提高灰飞虱抗生性水稻的检测速度，提高水稻的产量和育种效率。
【专利说明】
一个能显著提高灰飞虱抗生性的水稻染色体片段及其SSR标记
技术领域
[0001]本发明涉及一个能显著提高灰飞虱抗生性的水稻染色体片段及其SSR标记，属于农业生物技术领域。
【背景技术】
[0002]水稻(Oryzasativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，产量与播种面积均居世界首位。水稻病虫害是制约水稻高产稳产的重要因素。稻飞虱是亚洲各国水稻生产上最重要的害虫之一，给水稻生产造成了严重的损害。目前，为害水稻的飞虱主要有褐飞虱(Nilaparvata Iugens)、灰飞虱(Laodelphax striatellus)和白背飞虱(Sogatellafurcifera)三种，其中灰飞虱发生最早，适应性最广，田间种群密度大，主要危害早、中稻秧田和分蘖期的稻苗或嫩穗。
[0003]灰飞風(Laodelphgax s tr iate I Ius )，属于同翅目(Homoptera)，飞風科(Delphacide)，在世界上主要分布于东亚、东南亚、非洲、欧洲等广大地区，在我国各主要稻区也分布广泛，长江中下游和华北地区发生较多。寄主是各种草坪禾草及水稻、小麦、大麦、甘蔗、看麦娘、李氏禾和双穗雀稗等多种禾本科植物，对农业危害很大。灰飞虱是典型的刺吸式口器害虫，除直接危害造成损失外，还能够传播水稻条纹叶枯病毒(rice stripevirus，RSV)、水稻黑条矮缩病毒(rice black streaked dwarf virus，RBSDV)及玉米粗缩病毒(maize rough dwarf virus，MRDV)等多种病害，自20世纪50年代以来灰飞虱逐渐发展成为亚洲水稻的主要害虫，给农业生产带来严重损失。
[0004]灰飞虱是温带昆虫，具有耐寒、耐饥饿的生物学特性，灰飞虱种群具有的强抗逆能力和多态现象增加了种群在各种环境条件下的存活机会，导致其适生范围范围非常广泛，普遍分布于东亚、东南亚、南亚的温带气候带。近几年全球气候变暖所致的暖冬和春季温度升高，有利于灰飞虱种群的安全越冬和迅速繁衍，使得灰飞虱的越冬虫源基数不断加大。轮作及种植方式的多样性，使得灰飞虱种群稻田、麦田、高粱地、田间杂草等互相转移的桥梁增多，增加了种群在全年各种环境下的存活机会。目前防治灰飞虱主要措施是农业防治，以使用化学药剂为主，导致灰飞虱对多种杀虫剂产生了抗药性，从而使这种单一的防治措施面临严峻的挑战，再加上灰飞虱的迀飞特性使得灰飞虱的杀灭非常困难。粳稻品种的推广与种植，导致水稻抗虫能力更加脆弱。近年来各地灰飞虱危害严重，田间群体密度很大。
[0005]在水稻生长前期，一般认为，灰飞虱的危害除了以成虫、若虫刺吸水稻汁液，引起植株黄叶、枯死，造成空秕率上升，千粒重下降，稻米品质降低外，主要是它能在水稻生长前期作为传毒媒介，传播水稻条纹叶枯病、水稻黑条矮缩病等，给农业生产造成较大损失。在水稻生长后期，灰飞虱一般以较大种群密度聚居于稻丛中上部，成虫、若虫均刺吸水稻茎杆和叶片汁液。在虫口密度大时，稻株因体内汁液大量丧失而枯黄。灰飞虱在叶片或穗子上排出大量蜜露，会影响水稻光合作用，还会滋生霉菌，引起稻粒霉烂。江苏农科院测定发现，灰飞虱危害严重植株比正常植株轻8.92克，株高降低33cm，穗长和每穗粒数分别降低5.49cm和28.5粒，半实率和不实率分别增加36.3%和3.20%，减产达41.5%。
[0006]目前使用化学药剂为主的灰飞虱防治导致灰飞虱对多种杀虫剂产生了抗药性，此夕卜，灰飞虱的迀飞特性及其传毒的瞬时性和持久性，致使防虫治病的效果不佳。生产上通常采用加大化学药剂的施用量来防虫治虫，导致灰飞虱天敌杀伤严重，严重伤害了田间生态平衡，从而使这种单一的防治措施面临严峻的挑战。利用品种自身的抗性一直被认为是防控灰飞虱危害最为经济有效的方法。目前生产上推广种植的粳稻品种大多感虫，因此，挖掘抗稻灰飞虱种质资源，选育高抗灰飞虱新品种，既能有效防止灰飞虱直接取食为害，也可以控制目前大爆发的条纹叶枯病、黑条矮缩病等病害，具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对常规水稻育种中灰飞虱抗生性鉴定稳定性、重复性较差及费时费力等缺点，提供了一个能显著提高灰飞虱抗生性的水稻染色体片段及其SSR标记，该SSR标记可以预测水稻植株对灰飞虱的抗生性，简化了选择方法，进而加快了水稻灰飞虱抗生性品种的育种进程。
[0008]本发明的目的可通过如下技术方案实现:
一个能显著提高灰飞虱抗生性的水稻染色体片段及其SSR标记，其特征在于:用分子标记RM349引物:SEQ ID N0.1/SEQ ID N0.2，或者用分子标记RMl24引物:SEQ ID N0.3/SEQID N0.4扩增水稻灰飞虱抗性鉴定材料，如果用分子标记RM349引物:SEQ ID N0.1/SEQ IDN0.2能够扩增出146bp的扩增片段，或用分子标记RM124引物:SEQ ID N0.3/SEQ ID N0.4能够扩增出217bp的扩增片段，则标志着水稻材料内存在灰飞虱抗生性位点Qsbph4b。
[0009]所述的水稻染色体片段及其SSR标记的定位方法包含以下步骤:
(1)以水稻灰飞虱高感品种武育粳3号为母本，灰飞虱高抗生性品种冷水红为父本，配制杂种Fl，构建了包含214个单株的F2分离群体，通过F2单株自交获得214个F2:3家系；
(2)对F2:3家系采用水稻灰飞虱抗生性鉴定，获得各家系的抗生性测验值；
(3)采用CTAB微量法提取亲本、Fl及F2:3定位群体单株的DNA;
(4 )用实验室已有的大体平均分布于水稻12条染色体的821对SSR引物(含128对自行合成引物)，对亲本、Fl及F2:3定位群体进行PCR扩增寻找两两之间同时具有稳定多态性的引物，用筛选到的204对多态性分子标记检测F2:3家系；
(5)根据定位群体各单株分子标记多态性检测结果，并结合其抗性表型参数，用Mapmaker/Exp3.0软件进行基因和分子标记位点的遗传连锁分析，利用Kosambi作图函数将交换率转换为遗传距离(CM);
(6)米用基于复合区间作图法软件WindowsQTL Cartographer V2.5检测水稻灰飞虱的抗生性QTL，LOD值的阈值定为2.5，在5%的总体显著水平下检测QTL，检测抗性QTL的数目及其在染色体上的位置；
(7)获得水稻灰飞虱高抗生性品种冷水红抗生性基因位点Qsbph4b，位于第4号染色体分子标记RM349引物与分子标记RM124引物之间，通过检测第4号染色体上该两个引物标记的带型数据，可以预测该植株灰飞虱的抗生性，大大提高灰飞虱抗生性水稻的选择效率。
[0010]所述的水稻灰飞虱抗生性鉴定的具体方案为:将催芽后的水稻种子播于直径为6cm、高15cm的无色透明玻璃杯中，每个品种5株，重复3次，待秧苗长至1.5_2.0叶，每杯接入1-2龄的灰飞虱若虫约25头，纱布封口，10天后统计每个杯子剩余的虫数，计算灰飞虱若虫的残存率，作为抗生性测验值。
[0011 ]所述的用CTAB微量法提取亲本、Fl及F2: 3定位群体单株的DNA的具体流程为:取
0.3-0.5g新鲜的水稻叶片，于液氮中研成粉;将冻粉转入预冷的离心管中，立即加入500yLDNA提取缓冲液，置65°C温浴20min ；加入700yL氯仿/异丙醇，轻缓颠倒离心管混匀，12000r/min离心1min;转移上清液至另一离心管中，加入600yL异丙醇，12000r/min离心5min;弃上清液，加入600yL的70%乙醇，12000r/min离心5min;弃70%乙醇，风干;加0.2mL TE，溶解后4°C保存。
[0012]所述的对亲本、Fl及F2:3定位群体进行PCR扩增的PCR反应体系为:总体积为1yL，1mM Tris-HCl pH 8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2,50μΜ dNTPs，0.2μΜ 引物，0.5U Taq 酶和20ng DNA模板;PCR扩增程序为:94°C预变性5min;94°C变性lmin，58°C退火复性lmin，72°C延伸1.5min，共35个循环;最后72°C保温1min;扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)银染检测。
[0013]所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳的具体方法为:100ml8%凝胶工作液配方为:ddH2070ml，10*TBE 1ml，40%丙烯酰胺(19: l)20ml，TEMED 10ul，10%AP 100ul;其中，10*TBE是将108g Tris碱和55g硼酸先溶解于蒸馈水，加40ml 0.5mol/L EDTACPH 8.0)，再加ddifeO定容到100ml; 19:1(10ml)丙烯酰胺是将38g丙烯酰胺和2g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶解于ddH20，定容至100ml，过滤后4°C保存。
[0014]所述的扩增灰飞虱抗生性位点Qsbph4b的分子标记引物选自分子标记RM349引物:SEQ ID N0.1/SEQ ID N0.2和分子标记RM124引物:SEQ ID N0.3/SEQ ID N0.4。
[0015]所述的分子标记引物在水稻育种中的应用。
[0016]所述的分子标记引物在快速筛选灰飞虱高抗生性水稻品种或品系中的应用。
[0017]本发明所提供的能显著提高灰飞虱抗生性的水稻染色体片段及其SSR标记，具有抗性基因位点位置明确、鉴定方便等优点。本发明通过检测4号染色体上与水稻灰飞虱抗生性QTL紧密连锁的SSR标记，即可以预测水稻植株的灰飞虱抗生性水平，大大提高了灰飞虱抗生性水稻的选择效率，加快了育种进程。
【附图说明】
[0018]图1所示Qsbph4b在染色体上的位置。
[0019]图2应用Qsbph4b紧密连锁的SSR标记预测水稻植株灰飞虱抗生性的电泳图谱。M:Mark； 1:武育粳3号;2:冷水红;3:Fl; 4_13:灰飞虱感虫单株;14-23:灰飞虱抗生性单株。
【具体实施方式】
[0020]下面结合实施案例对本发明作进一步说明，而非限制本发明，实施例中所用方法如无特别说明均为常规技术方法。
[0021 ] 一、抗源的筛选与武育粳3号/冷水红F2群体构建:
多年的大田育种材料鉴定观察水稻品种冷水红对南方稻区大规模发生的害虫灰飞虱有较好的抗生性。冷水红，原产于河北省丰南县，是一种极为珍贵的优质米，被专家认定为是康熙皇帝“御田胭脂米”，当地人称它为“三伸腰”，又叫“黑谷子”。为准确鉴定冷水红对灰飞虱的抗生性水平，2012年正季于灰飞虱爆发时期从大田采集灰飞虱，进一步筛选2-3龄灰飞虱若虫进行抗生性实验。抗生性实验方法如下:将催芽后的冷水红和其它鉴定品种水稻种子分别播于直径为6cm、高15cm的无色透明玻璃杯中，每个品种5株，重复3次，待秧苗长至1.5-2.0叶，每杯接入1-2龄的灰飞虱若虫约25头，纱布封口，10天后统计每个杯子剩余的虫数，计算灰飞虱若虫的残存率，作为抗生性测验值。冷水红和感虫水稻品种武育粳3号的抗生性测验值均值分别为84.2%与27.5%，表明冷水红对灰飞虱具有极佳的抗生性。2012年以水稻灰飞虱高感品种武育粳3号为母本，灰飞虱高抗生性品种冷水红为父本，配制杂种Fl，构建了包含214个单株的F2分离群体，2013年秋季通过F2单株自交获得214个F2:3家系。
[0022]二、对F2:3家系采用水稻灰飞虱抗生性鉴定，获得各家系的抗生性测验值；
2014年，采用同步骤一的抗生性方法检测F2:3家系对灰飞虱的抗生性，获得各家系的抗生性测验值。
[0023]三、SSR标记分析:
(I)采用CTAB微量法提取亲本、Fl及F2:3定位群体单株的DNA;
(2 )用实验室已有的大体平均分布于水稻12条染色体的821对SSR引物(含128对自行合成引物)，对亲本、Fl及F2:3定位群体进行PCR扩增寻找两两之间同时具有稳定多态性的引物，用筛选到的204对多态性分子标记检测F2:3家系；
(3)CTAB微量法提取亲本、Fl及F2:3定位群体单株的DNA的具体流程为:取0.3-0.5g新鲜的水稻叶片，于液氮中研成粉;将冻粉转入预冷的离心管中，立即加入500yL DNA提取缓冲液，置65°C温浴20min;加入700yL氯仿/异丙醇，轻缓颠倒离心管混匀，12000r/min离心1min；转移上清液至另一离心管中，加入600yL异丙醇，12000r/min离心5min；弃上清液，加入600yL的70%乙醇，12000r/min离心5min ；弃70%乙醇，风干;加0.2mL TE，溶解后4°C保存；
(4)对亲本、FI及F2:3定位群体进行PCR扩增的PCR反应体系为:总体积为10μL，1mMTris-HCl pH 8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，50μΜ dNTPs，0.2μΜ引物，0.5U Taq 酶和 20ngDNA模板;PCR扩增程序为:94 °C预变性5min ； 94 °C变性Imin，55 V退火复性Imin，72 °C延伸1.5min，共35个循环;最后72°C保温1min;扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)银染检测；
(5)聚丙烯酰胺凝胶电泳的具体方法为:10ml8%凝胶工作液配方为:ddH20 70ml，10*TBE 1ml，40%丙烯酰胺(19:1 )20ml，TEMED 10ul ,10% AP 100ul;其中，10*TBE是将 108gTris碱和55g硼酸先溶解于蒸馏水，加40ml 0.5mol/L EDTA(PH为8.0)，再加ddH20定容到1000ml; 19:1(10ml)丙烯酰胺是将38g丙烯酰胺和2g N，，N亚甲双丙烯酰胺溶解于ddH20，定容至100ml，过滤后4°C保存。
[0024]四、抗性QTL定位:
(1)根据定位群体各单株分子标记多态性检测结果，并结合其抗性表型参数，用Mapmaker/Exp3.0软件进行基因和分子标记位点的遗传连锁分析，利用Kosambi作图函数将交换率转换为遗传距离(CM);
(2)米用基于复合区间作图法软件WindowsQTL Cartographer V2.5检测水稻灰飞虱的抗生性QTL，LOD值的阈值定为2.5，在5%的总体显著水平下检测QTL，检测抗性QTL的数目及其在染色体上的位置；
(3)在4号染色体上检测到I个水稻灰飞虱抗性QTL，LOD值为3.12,贡献率为18.6%，命名为Qsbph4b，位于第4号染色体分子标记RM349引物与分子标记RMl 24引物之间。
[0025]五、通过检测第4号染色体上该两个引物标记的带型数据，预测植株对灰飞虱抗生性水平:
用分子标记RM349引物或者用分子标记RM124引物扩增水稻灰飞虱抗性鉴定材料，如果用分子标记RM349引物能够扩增出146bp的扩增片段，或用分子标记RM124引物能够扩增出217bp的扩增片段(如图2)，则标志着水稻材料内存在灰飞虱抗生性位点Qsbph4b，通过检测Qsbph4b的存在可以预测该植株对水稻灰飞虱的抗生性水平，大大提高灰飞虱抗生性水稻的选择效率。
[0026]上述实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
【主权项】
1.一个能显著提高灰飞虱抗生性的水稻染色体片段及其SSR标记，其特征在于:用分子标记RM349引物:SEQ ID N0.1/SEQ ID N0.2，或者用分子标记RMl24引物:SEQ ID N0.3/SEQID N0.4扩增水稻灰飞虱抗性鉴定材料，如果用分子标记RM349引物:SEQ ID N0.1/SEQ IDN0.2能够扩增出146bp的扩增片段，或用分子标记RM124引物:SEQ ID N0.3/SEQ ID N0.4能够扩增出217bp的扩增片段，则标志着水稻材料内存在灰飞虱抗生性位点Qsbph4b。2.根据权利要求1所述的能显著提高灰飞虱抗生性的水稻染色体片段及其SSR标记，其特征在于所述的水稻染色体片段及其SSR标记的定位方法包含以下步骤: (1)以水稻灰飞虱高感品种武育粳3号为母本，灰飞虱高抗生性品种冷水红为父本，配制杂种Fl，构建了包含214个单株的F2分离群体，通过F2单株自交获得214个F2:3家系； (2)对F2:3家系采用水稻灰飞虱抗生性鉴定，获得各家系的抗生性测验值； (3)采用CTAB微量法提取亲本、Fl及F2:3定位群体单株的DNA; (4)用实验室已有的大体平均分布于水稻12条染色体的821对SSR引物(含128对自行合成引物)，对亲本、Fl及F2:3定位群体进行PCR扩增寻找两两之间同时具有稳定多态性的引物，用筛选到的204对多态性分子标记检测F2:3家系； (5)根据定位群体各单株分子标记多态性检测结果，并结合其抗性表型参数，用Mapmaker/Exp3.0软件进行基因和分子标记位点的遗传连锁分析，利用Kosambi作图函数将交换率转换为遗传距离(CM); (6)米用基于复合区间作图法软件WindowsQTL Cartographer V2.5检测水稻灰飞虱的抗生性QTL，LOD值的阈值定为2.5，在5%的总体显著水平下检测QTL，检测抗性QTL的数目及其在染色体上的位置； (7)获得水稻灰飞虱高抗生性品种冷水红抗生性基因位点Qsbph4b，位于第4号染色体分子标记RM349引物与分子标记RM124引物之间，通过检测第4号染色体上该两个引物标记的带型数据，可以预测该植株灰飞虱的抗生性，大大提高灰飞虱抗生性水稻的选择效率。3.根据权利要求2所述的能显著提高灰飞虱抗生性的水稻染色体片段及其SSR标记，其特征在于所述的水稻灰飞虱抗生性鉴定的具体方案为:将催芽后的水稻种子播于直径为6cm、高15cm的无色透明玻璃杯中，每个品种5株，重复3次，待秧苗长至1.5_2.0叶，每杯接入1-2龄的灰飞虱若虫约25头，纱布封口，10天后统计每个杯子剩余的虫数，计算灰飞虱若虫的残存率，作为抗生性测验值。4.根据权利要求2所述的能显著提高灰飞虱抗生性的水稻染色体片段及其SSR标记，其特征在于所述的用CTAB微量法提取亲本、Fl及F2: 3定位群体单株的DNA的具体流程为:取0.3-0.5g新鲜的水稻叶片，于液氮中研成粉;将冻粉转入预冷的离心管中，立即加入500yLDNA提取缓冲液，置65°C温浴20min ；加入700yL氯仿/异丙醇，轻缓颠倒离心管混匀，12000r/min离心1min;转移上清液至另一离心管中，加入600yL异丙醇，12000r/min离心5min;弃上清液，加入600yL的70%乙醇，12000r/min离心5min;弃70%乙醇，风干;加0.2mL TE，溶解后4°C保存。5.根据权利要求2所述的能显著提高灰飞虱抗生性的水稻染色体片段及其SSR标记，其特征在于所述的对亲本、Fl及F2:3定位群体进行PCR扩增的PCR反应体系为:总体积为1yL，1mM Tris-HCl pH 8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2,50μΜ dNTPs，0.2μΜ 引物，0.5U Taq 酶和20ng DNA模板;PCR扩增程序为:94°C预变性5min;94°C变性lmin，58°C退火复性lmin，72°C延伸1.5min，共35个循环;最后72°C保温1min;扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)银染检测。6.根据权利要求5所述的能显著提高灰飞虱抗生性的水稻染色体片段及其SSR标记，其特征在于所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳的具体方法为:100ml 8%凝胶工作液配方为:ddH2070ml，10*TBE 1ml，40%丙烯酰胺(19: l)20ml，TEMED 10ul，10%AP 100ul;其中，10*TBE是将108g Tris碱和55g硼酸先溶解于蒸馈水，加40ml 0.5mol/L EDTACPH 8.0)，再加ddifeO定容到100ml; 19:1(10ml)丙烯酰胺是将38g丙烯酰胺和2g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶解于ddH20，定容至100ml，过滤后4°C保存。7.根据权利要求1所述的能显著提高灰飞虱抗生性的水稻染色体片段及其SSR标记，其特征在于所述的扩增灰飞虱抗生性位点Qsbph4b的分子标记引物选自分子标记RM349引物:SEQ ID N0.1/SEQ ID N0.2和分子标记RM124引物:SEQ ID N0.3/SEQ ID N0.4。8.根据权利要求7所述的能显著提高灰飞虱抗生性的水稻染色体片段及其SSR标记，其特征在于所述的分子标记引物在水稻育种中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的分子标记引物在快速筛选灰飞虱高抗生性水稻品种或品系中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK105838817SQ201610384674
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】王纪芝
【申请人】王纪芝