专利名称：水稻品种抗褐飞虱基因位点的分子标记方法
技术领域：
本发明提供了水稻品种Rathu Heenati抗褐飞虱基因位点的分子标记方法，属于分子遗传学领域，专用于水稻抗褐飞虱品种的选育与种质资源的利用。
二、技术背景水稻是我国的重要粮食作物。褐飞虱是一种水稻单食性害虫，属同翅目飞虱科。通过口针吸食水稻茎秆韧皮部汁液，为典型的刺吸式害虫。严重时引起稻株下部变黑、腐烂发臭、倒瘫，称之为“虱烧”，导致水稻减产或失收。目前，对褐飞虱的防治主要依赖于化学农药，但此措施不但增加了生产成本，且污染环境，因此，最为经济有效而不造成污染的防治措施是抗虫品种的应用。
迄今，已发现和鉴定了13个抗褐飞虱主基因。其中，显性基因6个，即Bph-1(Athwal et al.，1971)、Bph-3(Lakshiminarayana and Khush，1977)、Bph-6(Kabir and Khush，1988)、Bph-9(Ikeda et al.，1985；Nemoto et al.，1989a)、Bph-10(t)(Multain et al.，1994；Ishii et al.，1994)和Bph-13(t)(刘国庆等，2001)。隐性基因7个，即bph-2(Athwal et al.，1971)、bph-4(Lakshiminarayana and Khush，1977)、bph-5(Khush et al.，1985)和bph-7(Kabir and Khush，1988)、bph-8(Ikeda，1985；Nemoto et al.，1989a)、bph-11(t)和bph-12(t)(Hirabayashi and Ogawa，1999)。其他研究还进行了抗褐飞虱的分子定位研究，已鉴定了26个抗褐飞虱QTL，但真正用于育种的抗褐飞虱基因并不多。
国际水稻研究所自1973年先后选育了一系列分别携带Bph-1、bph-2和Bph-3等抗褐飞虱主基因的水稻品种，在种植这些品种的地区有效地控制了褐飞虱的暴发。然而，由于褐飞虱新生物型的产生，抗褐飞虱品种逐渐丧失抗性或面临抗性丧失的危险(Pathak and Khush，1979；Pathak and Saxena，1980；Heinrichs，1986；Saxena and Khan，1989；Heinrichs，1994；Gallagher et al.，1994)。我国也先后育成一系列含有抗褐飞虱基因Bph-1的品种(组合)，对褐飞虱的防治起了积极的作用。吕仲贤等(2002)对1986～2000年国家和浙江省育种攻关协作组提供的3328份水稻新品种(系)进行了抗褐飞虱鉴定和筛选，结果发现从“七五”、“八五”到“九五”抗虫品种鉴出率呈下降趋势，水稻抗褐飞虱育种未受到足够重视。目前，国内褐飞虱以生物型2为主，致害力强的孟加拉型生物型比例上升，原来带有Bph-1的抗虫品种，已逐渐失去抗性，因而迫切需要培育新的携带多个抗性基因的抗虫品种。
由于抗虫性鉴定的复杂性，利用常规育种手段往往难以有效地聚合不同的抗虫基因。而在找到与抗虫基因紧密连锁或共分离的分子标记的基础上，借助分子标记辅助选择(Marker-assisted selection，MAS)技术则可以有目的地进行抗虫基因和QTL的聚合，选育持久抗性品种，延缓抗虫品种的退化年限和防止褐飞虱新生物型的发生。
发明内容
技术问题本发明的目的是提供了水稻品种Rathu Heenati抗褐飞虱主效基因位点的分子标记方法，通过检测与这些抗褐飞虱主效基因位点连锁的分子标记，可以预测水稻植株的褐飞虱抗性，加快抗褐飞虱水稻的选择进度。
技术方案水稻品种Rathu Heenati对褐飞虱的抗性是由一个主效基因Bph3和两个微效QTL(Qbph3和Qbph10)共同控制，其特征在于用标记引物RM8213，左端引物序列 AGCCCAGTGATACAAAGATG右端引物序列 GCGAGGAGATACCAAGAAAG或者用标记引物RM5953，左端引物序列 AAACTTTCTGTGATGGTATC右端引物序列 ATCCTTGTCTAGAATTGACA用引物RM8213扩增水稻抗褐飞虱品种或育种材料DNA，如果能够扩增出168bp的扩增片段，用引物RM5953扩增水稻抗褐飞虱品种或育种材料DNA，如果能够扩增出195bp的扩增片段，则标志着水稻品种抗褐飞虱主效基因位点Qbph4(Bph3)的存在，其中该主效基因位点位于水稻的第4染色体短臂上，利用Windows QTLCartographer V2.0软件测得与褐飞虱抗性相关的LOD值为63.7，对褐飞虱抗性的贡献率83.9％；用标记引物RM3131左端引物序列 CTCTGCACCCTGTTCACATG右端引物序列 CCCAATGGAATATCAGGTGG用标记引物RM7左端引物序列 TTCGCCATGAAGTCTCTCG右端引物序列 CCTCCCATCATTTCGTTGTT用引物RM3131扩增水稻抗褐飞虱品种或育种材料DNA，如果能够扩增出141bp的扩增片段，用引物RM7扩增水稻抗褐飞虱品种或育种材料DNA，如果能够扩增出175bp的扩增片段，则标志着水稻品种抗褐飞虱基因位点Qbph3的存在，其中该基因位点位于水稻的第3染色体短臂上，利用Windows QTL Cartographer V2.0软件测得与褐飞虱抗性相关的LOD值为2.32，对褐飞虱抗性的贡献率6.5％；用标记引物RM484左端引物序列 TCTCCCTCCTCACCATTGTC右端引物序列 TGCTGCCCTCTCTCTCTCTC用标记引物RM496左端引物序列 GACATGCGAACAACGACATC右端引物序列 GCTGCGGCGCTGTTATAC用引物RM484扩增水稻抗褐飞虱品种或育种材料DNA，如果能够扩增出295bp的扩增片段，用引物RM496扩增水稻抗褐飞虱品种或育种材料DNA，如果能够扩增出265bp的扩增片段，则标志着水稻品种抗褐飞虱基因位点Qbph10的存在，其中该基因位点位于水稻的第10染色体短臂上，利用Windows QTLCartographer V2.0软件测得与褐飞虱抗性相关的LOD值为2.74，对褐飞虱抗性的贡献率10.1％；
筛选上述标记引物的过程如下(1)以抗褐飞虱品种Rathu Heenati(Ikeda和Kaneda 1981，Jpn J Breed，31(3)279-285)为母本，感褐飞虱粳稻品种02428(邹江石等，中国农业科学，1989，22(1)6-14)为父本，配制杂种，构建了包含156个单株的F2分离群体，每个F2单株通过自交获得相应的F2∶3家系。进行抗虫鉴定。
(2)用SDS法提取亲本、F1及F2群体各株系的DNA，采用简单重复序列标记SSR对两亲本进行多态性筛选，PCR在PTC-200(MJ Research Inc.)扩增仪上进行，扩增产物在8％(g/ml)聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，亲本间有多态的引物在F2群体中进行分析，PCR扩增程序同上，获取群体基因型资料；(3)根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建水稻的遗传图谱，所用软件为MAPMARKER/EXP3.0，用Kosambi函数将重组值转换为遗传距离。
(4)采用苗期接种进行抗虫性鉴定。褐飞虱为生物型1和生物型2混合种群。
(5)利用MAPMARKER/EXP3.0软件对各个分子标记的群体基因型资料和与其对应每个家系的褐飞虱抗性鉴定的抗虫级别进行连锁分析，并将Kosambi函数转换为遗传距离。利用Windows QTL Cartographer V2.0软件(Wang et al.，2003)复合区间作图法(Composite interval mapping，CIM)，以2cM为步长在全基因组范围内进行扫描。QTL的检测采用5％总体显著水平，相应LOD统计量的显著阈值用排列测验(Permutation test)(Churchill and Doerge，1994)方法进行估计，共重复抽样1000次。同时估计了各位点的加性效应和贡献率。
(6)在Rathu Heenati中发现标记RM3131和RM7在LOD值为2.32时与抗褐飞虱基因位点Qbph3连锁，该位点对褐飞虱抗性的贡献率为6.5％，标记RM8213和RM5953在LOD值为63.7时与抗褐飞虱基因位点Qbph4连锁，该位点对褐飞虱抗性的贡献率为83.9％，为抗性主基因位点；标记RM484和RM496在LOD值为2.74时与抗褐飞虱基因位点Qbph10连锁，该位点对褐飞虱抗性的贡献率为10.1％，因此标记RM8213和RM5953即为获得的水稻品种Rathu Heenati抗褐飞虱主效基因位点Qbph4的分子标记。
有益效果 本发明所提供的水稻品种Rathu Heenati抗褐飞虱主效基因位点的分子标记方法，具有以下优点(1)通过本发明在国际上首次用SSR标记定位了水稻品种Rathu Heenati中的抗褐飞虱的主效基因位点和微效基因位点，其中主基因Qbph4(Bph3)对褐飞虱抗性的可解释率达83.9％，2个微效基因(Qbph3、Qbph10)控制抗性的贡献率分别为6.5％和10.1％。
(2)通过本发明分子标记定位的主效基因位点位置明确，鉴定方便。通过检测这些与抗褐飞虱基因位点连锁的分子标记，即可以预测水稻植株的褐飞虱抗性，用于水稻品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有褐飞虱抗性，进而快速筛选抗病品种或品系用于水稻育种。主效基因位点的检测方便快速，不受环境影响；(3)辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统育种方法中，首先要收集具有抗虫基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交，而且要对褐飞虱抗性进行单株选择。对水稻褐飞虱进行表型鉴定复杂，同时受环境影响，首先要获得虫源、饲养褐飞虱，此外要获得接种虫源和水稻秧苗同步，非常困难，表型鉴定的结果可靠性低。因此抗虫育种不仅费时，而且难度大，成本高。通过检测抗褐飞虱主效基因位点，可以在苗期就鉴定出高抗褐飞虱的单株，淘汰其它植株，不仅节约生产成本而且大大提高抗褐飞虱水稻的选择效率。
四
图1水稻品种Rathu Heenati抗褐飞虱基因在染色体上的分布。
五具体实施例方式
本发明的详细说明如下研究表明，抗褐飞虱基因资源主要存在于斯里兰卡和印度籼稻和野生稻种中(Ikeda and Vaughau，1991)。Athwal et al.(1971)报道Mudgo、CO22和MTU15携带同一抗褐飞虱基因Bph-1，ASD7携带一个隐性抗虫基因bph-2。Athwal andPathak(1972)报道MGL2含有抗虫基因Bph-1，Ptb18含有bph-2。Martinez andKhush(1974)报道IR747B2-6含有Bph-1，R1154-243和IR4-93含有bph-2。Lakshiminarayana and Khush(1977)报道斯里兰卡抗虫品种Rathu Heenati由一个与Bph-1独立分离的显性基因Bph-3控制；而品种Babawee则由一个与bph-2独立分离的隐性基因bph-4控制。Sidhu and Khush(1978)报道携带Bph-3或bph-4的水稻品种对所有的褐飞虱生物型都表现抗性。泰国水稻品种Col.5 Thailand和Col.11 Thailand，缅甸水稻品种Chin Saba由同一个与bph-2和bph-4都不等位的隐性抗虫基因bph-8控制(Ikeda，1985)。这些抗虫基因的鉴定和遗传研究为抗虫品种的培育提供了基础，其中Bph-1、bph-2和Bph-3已被应用到抗虫育种中。但是，由于抗虫性鉴定的复杂性，利用常规育种手段往往难以有效地聚合不同的抗虫基因。而在找到与抗虫基因紧密连锁或共分离的分子标记的基础上，借助分子标记辅助选择(Marker-assisted selection，MAS)技术则可以有目的地进行抗虫基因和QTL的聚合，选育持久抗性品种，延缓抗虫品种的退化年限和防止褐飞虱新生物型的发生。
通过本发明抗虫水稻品种Rathu Heenati褐飞虱抗性主基因位点和微效基因位点的鉴定和分子标记的发现，特别褐飞虱抗性主效基因位点可用来指导抗褐飞虱水稻品种的选育工作，用与之连锁的分子标记对抗虫品种进行筛选，使不同抗虫主效基因位点快速聚合在同一个植株中，从而大大提高育种效率。
材料与方法(一)Rathu Heenati/02428 F2群体构建及表型鉴定(1)以抗褐飞虱品种Rathu Heenati(Ikeda和Kaneda 1981，Jpn J Breed，31(3)279-285)为母本，感褐飞虱粳稻品种02428(邹江石等，中国农业科学，1989，22(1)6-14)为父本，配制杂种，构建了包含156个单株的RathuHeenati/02428 F2分离群体，每个F2单株通过自交获得相应的Rathu Heenati/02428F2∶3家系。
(2)采用苗期接种对亲本、F1、F2∶3进行抗虫性鉴定。为确保亲本、F1和F2∶3群体中的每个家系生长一致，所有供试材料在播种前分别浸种催芽。每个家系(品种)分别取25粒种子播种于一个直径8.5cm、高9.0cm，盛满营养土的圆形塑料钵中(钵底部有一小孔，便于渗透吸水)，株距为2.5cm。各品种随机种植3钵。每28个塑料钵置于一个65cm×44cm×14cm的塑料箱内(箱内保持水层2cm左右)。播种7天后间苗，淘汰病弱苗，保留到每钵20株，待苗长到两叶一心期时按10头/苗的比例接种2-3龄褐飞虱若虫，最后罩上尼龙纱网罩，当感虫品种TN1全部死亡时，参照Athwal等(1971)、IRRI(1988)和Huang等(2001)的方法对每个单株进行0，1，3，5，7或9级的抗性评价(表1)，对亲本材料和群体的每个家系通过加权平均计算该家系的抗性级别，并根据抗性级别推测此单株基因型。
表1 本研究所用的抗感褐飞虱评价标准
(二)Rathu Heenati/02428 F2群体的分子标记分析(1)用SDS法提取亲本、F1及F2群体各株系的DNA。
(2)SSR分析参照Chen et al.(1997)的程序。10μl反应体系包括10mM Tris-HCl pH 8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，50μM dNTPs，0.2μM引物，0.5U Taqpolymerase(TaKaRa，大连)和20ng of DNA模板。扩增反应在PTC-200(MJResearch Inc.)PCR仪上进行94℃ 4min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1.5min，35个循环；72℃ 7min。扩增产物用8％的非变性PAGE胶分离，通过银染显色，银染程序根据Sanguinetti et al.(1994)的方法制定而成。扩增的DNA条带利用装有荧光灯的灯箱进行观察。记录结果，亲本间有多态的引物在F2群体中进行分析，获取群体基因型资料；(3)根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建水稻的遗传图谱，所用软件为MAPMAKER/EXP3.0，最小LOD值设为3，获得连锁图谱；(4)利用Windows QTL Cartographer V2.0软件(Wang et al.，2003)复合区间作图法(Composite interval mapping，CIM)，以2cM为步长在全基因组范围内进行扫描。QTL的检测采用5％总体显著水平，相应LOD统计量的显著阈值用排列测验(Permutation test)(Churchill and Doerge，1994)方法进行估计，共重复抽样1000次。同时估计了各位点的加性效应和贡献率。利用MAPMAKER/3.0分析软件进行褐飞虱抗性与SSR标记的分离分析。并将Kosambi函数转换为遗传距离(cM)。
(三)结果与分析苗期集团抗性鉴定显示Rathu Heenati、02428和F1的抗虫级别分别为0.3、8.1和1.1，表明Rathu Heenati抗褐飞虱而02428感褐飞虱并且Rathu Heenati的抗虫性由显性基因控制，156个F2∶3家系对褐飞虱的抗虫级别频率分布呈连续分布，最小为0.1，最大为9.00，并在1、5和8三个位置出现3个明显的峰值。根据对褐飞虱的抗虫级别将F2∶3家系分为抗虫、抗感分离和感虫三种表现型，而相应的F2单株的基因型则分别为记为RR(纯合抗虫)、Rr(杂合抗虫)和rr(纯合感虫)三种。F2群体对褐飞虱的抗感分离符合1∶2∶1的比例(x2＝1.69，x20.05，2＝5.99)(表2)。
表2 Rathu Heenati/02428 F2分离群体156个单株对褐飞虱抗感分离比例
a)RR，纯合抗虫；Rr，杂合抗虫；rr，纯合感虫b)1RR∶2Rr∶1rr适合性测验值x2为1.69(x20.05，2＝5.99)；c)本栏为抗虫级别值域；RS，Resistance Score(抗虫级别)对F2群体的抗褐飞虱QTLs进行定位，检测到3个QTL，分别位于第3、4和10染色体上(表3和图1)。第3染色体上检测到的QTL(Qbph3)位于标记RM313和RM7之间，LOD值为2.32，贡献率为6.5％；第4染色体上检测到的QTL(Qbph4)位于标记RM8213和RM5953之间，LOD值为63.7，贡献率为83.9％；第10染色体上检测到的QTL(Qbph10)位于标记RM484和RM496之间，LOD值为2.74，贡献率为10.1％。
表3 在Rathu Heenati/02428的F2群体检测到的抗褐飞虱QTL位点
a)QTL对表型变异的贡献率其中Qbph4 LOD值和贡献率都很大，是一个主效QTL。与以前的研究结果比较表明该QTL与Bbh3是等位的。连锁分析将Rathu Heenati中的抗褐飞虱基因Bph3定位在RM8213和RM5953之间，与两标记分别相距3.6cM和3.2cM(图1)。表4结果显示抗性分离与两个SSR标记RM5953和RM8213的基因型值分离存在显著相关，进一步证明该抗褐飞虱基因与这两个标记的紧密连锁。
表4 F2群体的抗虫指数按RM5953和RM8213标记的基因型进行分类
a)1/1表示02428的基因型，2/2表示Rathu Heenati的基因型，1/2表示杂种基因型通过上述分子标记鉴定主基因位点来预测水稻植株抗性，预计可迅速提高我国水稻抗褐飞虱品种的育种进程。
权利要求
1.水稻品种Rathu Heenati抗褐飞虱基因位点的分子标记方法，水稻品种RathuHeenati对褐飞虱的抗性是由一个主效基因Bph3和两个微效基因QTL共同控制，其特征在于用标记引物RM8213，左端引物序列 AGCCCAGTGATACAAAGATG右端引物序列 GCGAGGAGATACCAAGAAAG或者用标记引物RM5953，左端引物序列 AAACTTTCTGTGATGGTATC右端引物序列 ATCCTTGTCTAGAATTGACA扩增水稻抗褐飞虱品种或育种材料DNA，如果用引物RM8213能够扩增出168bp的扩增片段，或用引物RM5953能够扩增出195bp的扩增片段，均标志着水稻品种抗褐飞虱主效基因位点Qbph4(Bph3)的存在，其中该主效基因位点位于水稻的第4染色体短臂上，利用Windows QTL Cartographer V2.0软件测得与褐飞虱抗性相关的LOD值为63.7，对褐飞虱抗性的贡献率83.9％。
2.根据权利要求1所述水稻品种Rathu Heenati抗褐飞虱基因位点的分子标记方法，其特征在于用标记引物RM3131左端引物序列 CTCTGCACCCTGTTCACATG右端引物序列 CCCAATGGAATATCAGGTGG或用标记引物RM7左端引物序列 TTCGCCATGAAGTCTCTCG右端引物序列 CCTCCCATCATTTCGTTGTT扩增水稻抗褐飞虱品种或育种材料DNA，如果用引物RM3131能够扩增出141bp的扩增片段，或用引物RM7能够扩增出175bp的扩增片段，均标志着水稻品种抗褐飞虱基因位点Qbph3的存在，其中该基因位点位于水稻的第3染色体短臂上，利用Windows QTL Cartographer V2.0软件测得与褐飞虱抗性相关的LOD值为2.32，对褐飞虱抗性的贡献率6.5％。
3.根据权利要求1或2所述水稻品种Rathu Heenati抗褐飞虱基因位点的分子标记方法，其特征在于用标记引物RM484左端引物序列 TCTCCCTCCTCACCATTGTC右端引物序列 TGCTGCCCTCTCTCTCTCTC或用标记引物RM496左端引物序列 GACATGCGAACAACGACATC右端引物序列 GCTGCGGCGCTGTTATAC扩增水稻抗褐飞虱品种或育种材料DNA，如果用引物RM484能够扩增出295bp的扩增片段，或用引物RM496能够扩增出265bp的扩增片段，均标志着水稻品种抗褐飞虱基因位点Qbph10的存在，其中该基因位点位于水稻的第10染色体短臂上，利用Windows QTL Cartographer V2.0软件测得与褐飞虱抗性相关的LOD值为2.74，对褐飞虱抗性的贡献率10.1％。
4.根据权利要求1所述的水稻品种Rathu Heenati抗褐飞虱基因位点的分子标记方法，其特征在于，筛选上述主效基因位点标记引物的过程如下(1)以抗褐飞虱品种Rathu Heenati为母本，感褐飞虱粳稻品种02428为父本，配制杂种，构建了包含156个单株的F2分离群体，每个F2单株通过自交获得相应的F2:3家系，进行抗虫鉴定；(2)用SDS法提取亲本、F1及F2群体各株系的DNA，采用简单重复序列标记SSR对两亲本进行多态性筛选，PCR在PTC-200扩增仪上进行，扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，亲本间有多态的引物在F2群体中进行分析，PCR扩增程序同上，获取群体基因型资料；(3)根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建水稻的遗传图谱，所用软件为MAPMARKER/EXP3.0，用Kosambi函数将重组值转换为遗传距离。(4)采用苗期接种进行抗虫性鉴定。褐飞虱为生物型1和生物型2混合种群。(5)利用MAPMARKER/EXP3.0软件对各个分子标记的群体基因型资料和相应家系的褐飞虱抗性鉴定的抗虫级别进行连锁分析，并将Kosambi函数转换为遗传距离。利用Windows QTL Cartographer V2.0软件复合区间作图法，以2cM为步长在全基因组范围内进行扫描。QTL的检测采用5％总体显著水平，相应LOD统计量的显著阈值用排列测验方法进行估计，共重复抽样1000次。同时估计了各位点的加性效应和贡献率。(6)在Rathu Heenati中发现标记RM3131和RM7在LOD值为2.32时与抗褐飞虱基因位点Qbph3连锁，该位点对褐飞虱抗性的贡献率为6.5％，标记RM8213和RM5953在LOD值为63.7时与抗褐飞虱基因位点Qbph4连锁，该位点对褐飞虱抗性的贡献率为83.9％，为抗性主基因位点；标记RM484和RM496在LOD值为2.74时与抗褐飞虱基因位点Qbph10连锁，该位点对褐飞虱抗性的贡献率为10.1％，因此标记RM8213和RM5953即为获得的水稻品种Rathu Heenati抗褐飞虱主效基因位点Qbph4的分子标记。
全文摘要
本发明涉及水稻品种Rathu Heenati抗褐飞虱主效基因位点的分子标记方法，属于分子遗传学领域。对水稻抗虫品种Rathu Heenati(♀)与感虫品种02428(♂)杂交获得的F
文档编号C12N15/11GK1896281SQ200610085399
公开日2007年1月17日 申请日期2006年6月13日 优先权日2006年6月13日
发明者万建民, 江玲, 孙立宏, 刘裕强, 陈亮明, 刘世家, 刘喜, 王春明, 程遐年, 翟虎渠 申请人:南京农业大学