专利名称：：水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的分子标记方法
技术领域：
：本发明提供了水稻品种抗褐飞虱主基因5pW的分子标记方法，属于分子遗传学领域，专用于水稻抗褐飞虱品种的选育与种质资源的利用。二
背景技术：
：水稻是我国的重要粮食作物。褐飞虱是一种水稻单食性害虫，属同翅目飞虱科。通过口针吸食水稻茎秆韧皮部汁液，为典型的刺吸式害虫。严重时引起稻株下部变黑、腐烂发臭、倒瘫，称之为"虱烧"，导致水稻减产或失收。目前，对褐飞虱的防治主要依赖于化学农药，但此措施不但增加了生产成本，且污染环境，因此，最为经济有效而不造成污染的防治措施是抗虫品种的应用。迄今，已发现和鉴定了13个抗褐飞虱主基因。其中，显性基因6个，即^p/z-7(AthwalWa/"1971)、5p/-3(LakshiminarayanaandKhush，1977)、Bp/-6(KabirandKhush，1988)、5;/kP(IkedaWa/.，1985;NemotoWa/"1989a)、5;^-卿(Multani"1994;Ishii"a/"1994)和麟-卿(刘国庆等，2001)。隐性基因7个，艮卩6p/z-2(AthwalWa/"1971)、6p/z-4(LakshiminarayanaandKhush,1977)、6/^-5(Khush"a/.,1985)和6p/-7(KabirandKhush,1988)、6p/7-8(Ikeda,1985;NemotoWa/"1989a)、6;/z-"W和6p/z-"^(HirabayashiandOgawa,1999)。其他研究还进行了抗褐飞虱的QTL(quantitivetraitlocus，数量性状位点)定位研究，已鉴定了26个抗褐飞虱QTL。但真正用于水稻抗虫育种的抗褐飞虱基因并不多。国际水稻研究所自1973年先后选育了一系列分别携带B;^-h6如-2和5如-3等抗褐飞虱主基因的水稻品种，在种植这些品种的地区有效地控制了褐飞虱的暴发。然而，由于褐飞虱新生物型的产生，抗褐飞虱品种逐渐丧失抗性或面临抗性丧失的危险(PathakandKhush,1979;PathakandSaxena,1980;Heinrichs,1986;SaxenaandKhan,1989;Heinrichs,1994;GallagherWa/.,1994)。我国也先后育成一系列含有抗褐飞虱基因5/^-7的品种(组合)，对褐飞虱的防治起了积极的作用。吕仲贤等(2002)对1986-2000年国家和浙江省育种攻关协作组提供的3328份水稻新品种(系)进行了抗褐飞虱鉴定和筛选，结果发现从"七五"、"八五"到"九五"抗虫品种鉴出率呈下降趋势，水稻抗褐飞虱育种未受到足够重视。目前，国内褐飞虱以生物型2为主，致害力强的孟加拉型生物型比例上升，原来带有5p/7-7的抗虫品种，已逐渐失去抗性，因而迫切需要培育新的携带多个抗性基因的抗虫品种。由于抗虫性鉴定的复杂性，利用常规育种手段往往难以有效地聚合不同的抗虫基因。而在找到与抗虫基因紧密连锁或共分离的分子标记的基础上，借助分子标记辅助选择(Marker-assistedselection,MAS)技术则可以有目的地进行抗虫基因或QTL的聚合，选育持久抗性品种，延缓抗虫品种的退化年限和防止褐飞虱新生物型的发生。三
发明内容技术问题本发明的目的是提供了水稻品种RathuHeenati抗褐飞虱主基因的分子标记方法，通过检测与这些抗褐飞虱主基因连锁的分子标记，可以预测水稻植株的褐飞虱抗性，加快抗褐飞虱水稻的选择进度。技术方案水稻品种抗褐飞虱主基因的分子标记方法，水稻品种RathuHeenati对褐飞虱的抗性由一个主基因SpW控制，其特征在于用标记引物A4，左端序列AAGCAGCATAAACTGATTGA右端序列TCATCTTCTGAAAAAGCAAT或者用标记引物RM16533,左端序列TTTGCTTAGTCGGCAGATGTCC右端序歹UCATAAGAACGTACCTCCACTGATTCC或者用标记引物RH7841，左端序列TGCCAAGTATGTATGCCTAT右端序歹UTTTTAGAGACCGTGTCCTTG或者用标记引物RH786，左端序歹UTTTGAAGTTCTTTCCATCTGA右端序列AAATGTGCTATCTGGGGTAAA或者用标记引物RH007，左端序列CTTGCGTTCCGTAGGAGAAG右端序列TGAGTGTAACCCGAAGTGGC扩增水稻抗褐飞虱品种或育种材料DNA，如果用引物A4能够扩增出193bp的扩增片段，或用引物RM16533能够扩增出285bp的扩增片段，或用引物RH7841能够扩增出213bp的扩增片段，或用引物RH786能够扩增出176bp的扩增片段，或用引物RH007能够扩增出182bp的扩增片段，均标志着该水稻品种抗褐飞虱主基因5pW的存在，该主基因位于水稻第4染色体短臂上。有益效果本发明所提供的水稻品种抗褐飞虱主基因的分子标记方法，具有以下优点(1)通过本发明在国际上首次用SSR标记精细定位了水稻品种RathuHeenati中的抗褐飞虱的主基因S/^3。P)通过本发明分子标记定位的主基因位置明确，鉴定方便。通过检测这些与抗褐飞虱基因连锁的分子标记，即可以预测水稻植株的褐飞虱抗性，用于水稻品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有褐飞虱抗性，进而快速筛选抗病品种或品系用于水稻育种。主基因位点的检测方便快速，不受环境影响；(3)辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统育种方法中，首先要收集具有抗虫基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交，而且要对褐飞虱抗性进行单株选择。对水稻抗褐飞虱进行表型鉴定复杂，同时受环境影响，首先要获得虫源、伺养褐飞虱，此外要获得接种虫源和水稻秧苗同步，非常困难，表型鉴定的结果可靠性低。因此抗虫育种不仅费时，而且难度大，成本高。通过检测抗褐飞虱主基因位点，可以在苗期就鉴定出高抗褐飞虱的单株，淘汰其它植株，不仅节约生产成本而且大大提高抗褐飞虱水稻的选择效率。(4)同时可用于抗虫杂交品种的纯度鉴定和苗期快速鉴定。四图1水稻品种RathuHeenati抗褐飞虱基因在染色体上的分布。五具体实施例方式研究表明，抗褐飞虱基因资源主要存在于斯里兰卡和印度籼稻和野生稻种中(IkedaandVaughau，1991)。Athwal"a/.(1971)报道Mudgo、C022和MTU15携带同一抗褐飞虱基因5/7/^，ASD7携带一个隐性抗虫基因6p/7-2。AthwalandPathak(1972)报道MGL2含有抗虫基因5;/z-7，Ptbl8含有6;/z-2。MartinezandKhush(1974)报道IR747B2-6含有5;/7-7，Rl154-243和IR4-93含有LakshiminarayanaandKhush(1977)报道斯里兰卡抗虫品种RathuHeenati由一个与^p/z-7独立分离的显性基因B/^-3控制；而品种Babawee则由一个与Z);/-2独立分离的隐性基因6p/-4控制。SidhuandKhush(1978)报道携带B/^-3或Z)如-4的水稻品种对所有的褐飞虱生物型都表现抗性。泰国水稻品种Col.5Thailand和Col.llThailand,缅甸水稻品种ChinSaba由同一个与6如-2和6如一都不等位的隐性抗虫基因6p/-S控制(Ikeda，1985)。这些抗虫基因的鉴定和遗传研究为抗虫品种的培育提供了基础，其中S;^-7、6/^-2和5p/z-3已被应用到抗虫育种中。但是，由于抗虫性鉴定的复杂性，利用常规育种手段往往难以有效地聚合不同的抗虫基因。而在找到与抗虫基因紧密连锁或共分离的分子标记的基础上，借助分子标记辅助选择(Marker-assistedselection,MAS)技术则可以有目的地进行抗虫基因和QTL的聚合，选育持久抗性品种，延缓抗虫品种的退化年限和防止褐飞虱新生物型的发生。通过本发明抗虫水稻品种RathuHeenati抗褐飞虱主基因和微效基因位点的鉴定和分子标记的发现，特别抗褐飞虱主基因位点可用来指导抗褐飞虱水稻品种的选育工作，用与之连锁的分子标记对抗虫品种进行筛选，使不同抗虫主基因位点快速聚合在同一个植株中，从而大大提高育种效率。(一)RathuHeenati/02428F2群体构建及表型鉴定(1)以抗褐飞虱品种RathuHeenati(Ikeda和Kaneda腦，JpnJBreed,31(3):279-285)为母本，感褐飞虱粳稻品种02428(邹江石等，中国农业科学,1989，22(1):6—14)为父本，配制杂种，构建了包含156个单株的RathuHeenati/02428F2分离群体，每个F2单株通过自交获得相应的RathuHeenati/02428F2:3家系，进行抗虫鉴定。(2)采用苗期接种对亲本、Fl、F2:3进行抗虫性鉴定，褐飞虱为生物型1和生物型2混合种群(Sun,LH等2005)。为确保亲本、F！和F2:3群体中的每个家系生长一致，所有供试材料在播种前分别浸种催芽。每个家系(品种)分别取25粒种子播种于一个直径8.5cm、高9.0cm,盛满营养土的圆形塑料钵中(钵底部有一小孔，便于渗透吸水)，株距为2.5cm。各品种随机种植3钵。每28个塑料钵置于一个65cmx44cmxl4cm的塑料箱内(箱内保持水层2cm左右)。播种7天后间苗，淘汰病弱苗，保留到每钵20株，待苗长到两叶一心期时按10头/苗的比例接种2-3龄褐飞虱若虫，最后罩上尼龙纱网罩，当感虫品种TN1(Sun，LH等2005)全部死亡时，参照Athwal等(1971)、IRRI(1988)和Huang等(2001)的方法对每个单株进行0，1,3,5，7或9级的抗性评价(表l)，对亲本材料和群体的每个家系通过加权平均计算该家系的抗性级别，并根据抗性级别推测此单株基因型。表l本研究所用的抗感褐飞虱评价标准抗虫级别苗期受褐飞虱为害表现抗性水平0叶片无萎縮，植株健康抗(R)1一张叶片发黄抗(R)一张到二张叶片发黄或一张叶片萎縮中抗(MR)一到三张叶片萎縮或一张叶片枯萎中抗(MR)7三到四张叶片萎縮或二到四张叶片枯萎，植株仍活着感(S)9植株枯死感(S)(二)RathuHeenati/02428F2群体的分子标记分析(l)用SDS法提取亲本、及F2群体各株系的DNA。(2)SSR分析参照Chenetal.(1997)的程序。lO^tl反应体系包括10mMTris-HC1pH8.3,50mMKC1,1.5mMMgC12,50岸dNTPs,0.2pM引物，0.5UTaqpolymerase(TaKaRa，大连)禾卩20ngofDNA模板。扩增反应在PTC-200(MJResearchInc.)PCR仪上进行:94°C4min;94。C1min,55°C1min，72°C1.5min，35个循环；72°C7min。扩增产物用8%的非变性PAGE胶分离，通过银染显色，银染程序根据Sanguinettietal.(1994)的方法制定而成。扩增的DNA条带利用装有荧光灯的灯箱进行观察。记录结果，亲本间有多态的引物在F2群体中进行分析，获取群体基因型资料；(3)根据连锁交换规律，利用MAPMARKER/EXP3.0软件对各个分子标记的群体基因型资料构建水稻的遗传连锁图谱。(4)利用WindowsQTLCartographerV2.0软件(Wangetal.，2003)复合区间作图法(Compositeintervalmapping,CIM)，以2cM为步长在全基因组范围内进行扫描。QTL的检测采用5%总体显著水平，相应LOD统计量的显著阈值用排列测验(Permutationtest)(ChurchillandDoerge，1994)方法进行估计，共重复抽样1000次。同时估计了各位点的加性效应和贡献率。根据工具公共数据库中提供的粳稻品种日本晴和籼稻品种9311的基因组序列，利用PowerBlast分析软件，寻找籼、粳品种基因组序列中存在的插入/缺失位点，利用PrimerPremier5.0软件开发InDel标记。(三)结果与分析(1)抗性鉴定苗期集团抗性鉴定显示RathuHeenati、02428和的抗虫级别分别为0.3、8.1和1.1，表明RathuHeenati抗褐飞虱而02428感褐飞虱并且RathuHeenati的抗虫性由显性基因控制，156个F2:3家系对褐飞虱的抗虫级别频率分布呈连续分布，最小为O.l，最大为9.00，并在l、5和8三个位置出现3个明显的峰值。根据对褐飞虱的抗虫级别将F2:3家系分为抗虫、抗感分离和感虫三种表现型，而相应的F2单株的基因型则分别为记为RR(纯合抗虫)、Rr(杂合抗虫)和rr(纯合感虫)三种。F2群体对褐飞虱的抗感分离符合1:2:1的比例(义2=1.69,^o.m.2=5.99)(表2)。表2RathuHeenati/02428F2分离群体156个单株对褐飞虱抗感分离比例F2基因型a)F2个体数W相应F2:3家系表现型^RR44RS<2Rr702￡RS<7rr42RS27~a)RR，纯合抗虫；Rr，杂合抗虫；rr，纯合感虫b)lRR:2Rr:lrr适合性测验值x2为1.69(x2o.o5,2=5.99);c)本栏为抗虫级别值域；RS,ResistanceScore(抗虫级别)(2)连锁分析连锁分析将RathuHeenati中的抗褐飞虱基因Bph3定位在RM8213和RM5953之间，与两标记分别相距3.6cM和3.2cM(图1)，该位点对褐飞虱抗性的贡献率为83.9%，为抗性主基因位点。标记RM8213条带为168bp，RM8213引物左端序列AGCCCAGTGATACAAAGATG和右端序列GCGAGGAGATACCAAGAAAG;标记RM5953条带为195bp，RM5953引物左端序列AAACTTTCTGTGATGGTATC和右端序列ATCCTTGTCTAGAATTGACA。结果显示抗性分离与两个SSR标记RM5953和RM8213的基因型值分离存在显著相关，进一步证明该抗褐飞虱基因与这两个标记的紧密连锁，该主基因位于水稻第4染色体短臂上。(3)精确定位为进一步精细定位主基因的位点，提高选择效率，以抗褐飞虱品种RathuHeenati为母本，感褐飞虱粳稻品种02428为父本，配制杂种，构建了包含5687个单株的F2分离群体，从中筛选标记RM8213和RM5953发生交换的单株，获得的交换单株通过自交获得相应的F2:3家系，进行抗虫鉴定。根据工具公共数据库中提供的粳稻品种日本晴和籼稻品种9311的基因组序列，利用PowerBlast分析软件，寻找籼、粳品种基因组序列中存在的插入/缺失位点，利用PrimerPremier5.0软件开发InDel标记，构建了RM8213和RM5953之间的饱和连锁图谱，结合表型鉴定结果将^o力J定位在两分子标记A4和RM16533之间(图1)。从上述5687株F2中随即挑选250株，对该区间的3个Indel标记RH784、RH786和RH007的选择效率进行评估，结果表明这三个标记的选择效率均达到97%左右(表3)。即用标记引物A4，左端序列AAGCAGCATAAACTGATTGA右端序列TCATCTTCTGAAAAAGCAAT或者用标记引物RM16533,左端序列TTTGCTTAGTCGGCAGATGTCC右端序列CATAAGAACGTACCTCCACTGATTCC或者用标记引物RH7841左端序列TGCCAAGTATGTATGCCTAT右端序列TTTTAGAGACCGTGTCCTTG或者用标记引物RH786左端序歹UTTTGAAGTTCTTTCCATCTGA右端序列AAATGTGCTATCTGGGGTAAA或者用标记引物RH007左端序列CTTGCGTTCCGTAGGAGAAG右端序列TGAGTGTAACCCGAAGTGGC扩增水稻抗褐飞虱品种或育种材料DNA，如果用引物A4能够扩增出193bp的扩增片段，或用引物RM16533能够扩增出285bp的扩增片段，或用引物RH7841能够扩增出213bp的扩增片段，或用引物RH786能够扩增出176bp的扩增片段，或用引物RH007能够扩增出182bp的扩增片段，均标志着该水稻品种抗褐飞虱主基因5;W的存在，该主基因位于水稻第4染色体短臂上。表3F2群体的抗虫指数按RH784、RH786和RH007标记的基因型进行分类<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>1/1表示02428的基因型，2/2表示RathuHeenati的基因型，1/2表示杂种基因型通过上述分子标记鉴定主基因位点来预测水稻植株抗性，预计可迅速提高我国水稻抗褐飞虱品种的育种进程。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>tgccaagtatgtatgcctat<210>6<211>20<212>DNA<213>人工合成<220><221>标记引物RH7841右端<222>(1)..(20)<223><400>6ttttagagaccgtgtccttg<210>7<211>21<212>DNA<213>人工合成<220><221>标记引物RH786左端<222>(1)..(21)<223><400>7tttgaagttctttccatctga<210>8<211>21<212>DNA<213>人工合成<220><221>标记引物RH786右端<222>(1)..(21)<223><400>8aaatgtgctatctggggtaaa<210>9<211>20<212>DNA<213>人工合成<220><221>标记弓I物RH007左端<222>(1)..(20)<223><400>9cttgcgttccgtaggagaag<210>10<211>20<212>DNA<213>人工合成<220><221>标记引物RH007右端<222>(1)..(20)<223><400>10tgagtgtaacccgaagtggc<210>11<211>20<212>DNA<213>人工合成<220><221>RM8213引物左端说明书第9/10页2020212120<222>(1),,(20)<223><400>11agcccagtgatacaaagatg<210>12<211>20<212>DNA<213>人工合成<220><221>RM8213引物右端<222>(1)..(20)<223><400>12gcgaggagataccaagaaag<210>13<211>20<212>DNA<213>人工合成<220><221>RM5953引物左端<222>(1)..(20)<223><400>13aaactttctgtgatggtatc<210>14<211>20<212>DNA<213>人工合成<220><221>RM5953引物右端<222>(1)..(20)<223><400>14atccttgtctagaattgaca权利要求1、水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的分子标记方法，水稻品种RathuHeenati对褐飞虱的抗性由一个主基因Bph3控制，其特征在于用标记引物A4左端序列AAGCAGCATAAACTGATTGA右端序列TCATCTTCTGAAAAAGCAAT或者用标记引物RM16533左端序列TTTGCTTAGTCGGCAGATGTCC右端序列CATAAGAACGTACCTCCACTGATTCC或者用标记引物RH7841左端序列TGCCAAGTATGTATGCCTAT右端序列TTTTAGAGACCGTGTCCTTG或者用标记引物RH786左端序列TTTGAAGTTCTTTCCATCTGA右端序列AAATGTGCTATCTGGGGTAAA或者用标记引物RH007左端序列CTTGCGTTCCGTAGGAGAAG右端序列TGAGTGTAACCCGAAGTGGC扩增水稻抗褐飞虱品种或育种材料DNA，如果用引物A4能够扩增出193bp的扩增片段，或用引物RM16533能够扩增出285bp的扩增片段，或用引物RH7841能够扩增出213bp的扩增片段，或用引物RH786能够扩增出176bp的扩增片段，或用引物RH007能够扩增出182bp的扩增片段，均标志着水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的存在，该主基因位于水稻第4染色体短臂上。全文摘要本发明涉及水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的分子标记方法，属于遗传育种
技术领域：
。对水稻抗虫品种RathuHeenati(♀)与感虫品种02428(♂)杂交获得的F<sub>2</sub>各单株的基因型和F<sub>2:3</sub>各家系的抗褐飞虱的抗性级别进行遗传连锁分析，获得抗虫品种RathuHeenati抗褐飞虱主基因Bph3。将该基因定位在分子标记A4和RM16533之间，且该区间的3个Indel标记RH784、RH786和RH007的选择效率均在97％左右。通过抗褐飞虱主基因的分子标记来检测抗虫品种RathuHeenati及其衍生品种(系)中是否含有该主基因，可预测其对褐飞虱的抗性水平，大大提高抗褐飞虱水稻的选择效率。文档编号C12Q1/68GK101418349SQ20081024372公开日2009年4月29日申请日期2008年12月12日优先权日2008年12月12日发明者万建民,俊何,喜刘,刘世家,刘裕强,寒吴,玲江,陈亮明申请人:南京农业大学