OsAGO18基因在提高水稻对水稻条纹叶枯病抗性中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及OsAGOIS基因在提高水稻对水稻条纹叶枯病抗性 中的应用。
【背景技术】
[0002] 水稻条纹叶枯病是由灰飞虱为媒介传播的，由水稻条纹病毒（Rice Stripe Virus，RSV)引起的病毒病，俗称水稻上的癌症。病株常枯孕穗或穗小畸形不实。水稻苗期 发病之初在心叶基部呈现断续的黄绿色或黄白色短条斑，以后病斑增大合并，扩展成与叶 脉平行的黄绿色条纹，条纹间仍保持绿色；拔节后发病在剑叶下部出现黄绿色条纹，各类型 稻均不枯心，但抽穗畸形，结实很少。
[0003] 水稻条纹病毒（Rice Stripe Virus, RSV)，属纤细病毒属（Tenuivirus)的代表种。 该病毒具有独特的基因组结构和编码策略，基因组共有四条单链RNA，其中RNA2、RNA3和 RNA4均采取双义编码策略，即在RM的正义链和互补链均有0RF，都可以编码蛋白。RNA2编 码NS2和NSvc2蛋白，其功能不详；RNA3编码外壳蛋白NCP和RNA沉默抑制子NS3 ;RNA4编 码的SP为病害特异蛋白，NSvc4为移动蛋白；RNAl只编码一个RdRP蛋白。水稻条纹病毒 (RSV)是严重危害我国水稻生产的主要病毒之一。由于对水稻病毒和寄主之间的相互作用 机制缺乏系统了解，因而长期以来，尚无法设计出一些能彻底控制病毒病危害的策略。自上 世纪七十年代中期以来，分子生物学快速发展，使人们对于病毒基因结构、病毒致病及植物 抗病机理等有了一定的了解，并启发了利用基因工程手段防治病毒病的一系列策略，如利 用外壳蛋白介导的抗性及利用转录后的基因沉默介导的抗性等。随着病毒全基因组序列的 分析完成、部分病毒重要功能基因的解析、水稻高效转基因技术的成熟应用与突变体库的 建成以及病毒与寄主相互作用机制，尤其是对转录后基因沉默机制的认识，为从转基因分 子水平鉴定病毒基因致病性和其与寄主分子相互作用，以及从基因工程水平实施高效抗病 育种提供了创新可能。
[0004] 突变体是研究功能基因组学的基础，是分离基因和鉴定基因功能的重要途径。自 20世纪70年代以来，全球建立了一系列的突变体库。随着水稻全基因组测序工作的完成， 水稻突变体已广泛应用于鉴定调控水稻形态和生理性状与基因的连锁分析及其相关基因 的克隆和功能研究。与水稻表达谱数据相结合，通过对植物抗病相关基因的突变体进行筛 选及转基因植物功能互补分析验证，是研究抗病相关基因及其作用的分子遗传机制的重要 途径。
[0005] RNA沉默是真核生物基因表达调控的一种非常重要的策略，也是植物抵抗病毒侵 染的一个方法。研究病毒和寄主之间在RNA沉默和RNA沉默的抑制对了解真核生物的基因 表达调控将有重要的推动作用。该技术目前已被国际研究领域公认并应用于抗病基因工程 育种以及功能基因研究。经典遗传学实验材料进行的RNA沉默实验显示了 RNA沉默的几 个特点：特异、高效、可扩散。与先前的正义或反义RNA技术相比，RNA沉默技术或人工构 建miRNA等对同源基因表达的抑制效应至少高10倍以上。如何快速、高效地构建目标基因 的反向重复序列，就成了当前利用RNA沉默机制获取对相关病毒免疫的工程植株的关键步 骤。
[0006] 在RNA沉默过程中包含了 3个主要元件：分别为DCLs、AGO和RDR，其在植物抗病 毒防御中都发挥重要作用。Dicer (DCLs)是一种III型内切核酸酶，可以特异性识别生物体 内的双链RNA，或单链RNA折叠形成的双链区域，产生长度为20?25nt的小RNA。所有的 Dicer都具有一个同源的核酶结构域：RNase III结构域。这个结构域可以切割双链RNA产 生duplex片段，切割产物一般具有5'磷酸集团及具有2个碱基突起的3'末端。大多数病 毒在侵染复制过程中都会产生dsRNA形式，而这种dsRNA又会被生物体内的Dicer (DCL2、 DCL3 和 DCL4 等）识别并切割生成 vsiRNA (virus-derived small interfering RNAs)，从 而阻断病毒的复制和转录过程。Argonaute (AGO)蛋白，一个RNA结合蛋白，大小在90? IOOkDa,是RNA沉默过程中的核心组分可以与siRNA，miRNA或piRNA结合，形成有活性的 RISC(RNA-induced silencing complexXRDR，RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RDR)，以RNA单链为模板合成dsRNA，在DCLs切割下产生small RNAs。最新的研 究结果揭示，病毒和宿主RDRs合成的dsRNA作为主要的切割底物，以及源于R Vaistijand Jones DR6介导产生的dsRNA所产生的次级siRNAs具有更加有效的抗病毒反应。然而，这 可能不是普遍现象，其结果可能取决于对特定的病毒。在病毒与寄主的长期进化过程中， RNA沉默（RNA silencing)成为植物抵抗病毒侵染的一种保守的防御机制。而作为相互竞 争的另一方，病毒也不会坐以待毙，现在认为绝大多数的病毒都会编码一种抑制基因沉默 的蛋白因子（VSR)，这种蛋白因子通过各种不同的方式作用于RNA沉默通路的不同位点从 而抑制RNA沉默对病毒的切割。
[0007] 在水稻病毒的研究中，最新的研究显示在miRNA水平上水稻矮缩病毒（Rice dwarf virus, RDV)和水稻条纹病毒（Rice stripe virus, RSV)可能在致病机制上存在很大差异， RDV侵染水稻后对水稻miRNA影响并不明显，而RSV决然相反，它不但极大的影响了水稻 miRNA的变化，而且还诱导了大量HiiRNAi" (miRNA star)和新的Phased MicroRNAs的产生， 并且这些miRNA#和Phased MicroRNAs在RSV侵染条件下能够有效调控其靶基因的变化， 这些新的发现则告诉我们dsRNA病毒和ssRNA病毒在致病机制上存在明显差异，并且水稻 miRNA参与了 RSV的抗病毒防御防御（Du et al.，2011)。
[0008] Solexa测序技术是深度测序技术中的一种，属于第二代测序技术，它们的兴起与 发展为基因组与RNA研究提供了非常好的工具，通过该技术可以高通量测定核苷酸的序 列，此方法不仅在小RNA测序中得到广泛应用，而且在研究基因组甲基化，转绿组和基因组 重测序中也占据绝对优势。深度测序技术可以揭示RSV和水稻互作过程中的许多信息，t匕 如水稻RNA沉默相关蛋白在抗病防御中的作用。在深度测序前需要构建小RNA库和mRNA 库，首先提取分别提取感染RSV的水稻和健康水稻组织中的总RNA，分别构建mRNA和小RNA 库，在其两端接上接头，进行逆转录和PCR。得到的cDNA进行深度高通量测序。
[0009] 随着高通量分子生物学技术的广泛应用，它带给我们将是海量的数据信息，这些 信息的分析必需依靠强大的生物信息学平台的支撑。水稻基因组和RSV基因组均已经测序 完成，这为我们后续的生物信息学分析提供了很好的数据平台。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一种OsAGOIS蛋白及其编码基因在调控植物抗水稻条纹叶 枯病中的应用。
[0011] 本发明所提供的应用，具体为如下A或B :
[0012] A:蛋白质在如下al)或a2)中的应用：
[0013] al)调控植物对水稻条纹叶枯病的抗性；
[0014] a2)选育对水稻条纹叶枯病抗性增强的植物品种；
[0015] 所述蛋白质由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成或由序列表中序列4所示的 氨基酸序列组成。
[0016] B :蛋白质的编码基因或含有所述编码基因的重组载体，在如下al)或a2)中的应 用：
[0017] al)调控植物对水稻条纹叶枯病的抗性；
[0018] a2)选育对水稻条纹叶枯病抗性增强的植物品种；
[0019] 所述蛋白质由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成或由序列表中序列4所示的 氨基酸序列组成。
[0020] 其中，由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成蛋白质命名为0sAG018蛋白（编码 基因为序列1，命名为0sAG018基因)，由序列表中序列4所不的氣基酸序列组成蛋白质则为 在0sAG018蛋白的N端连接了 MYC标签后得到的融合蛋白（编码基因为序列3)。
[0021] 在本发明中，以上所有al)中的所述调控植物对水稻条纹叶枯病的抗性均具体体 现在：促进所述蛋白质或其编码基因的表达，则所述植物对水稻条纹叶枯病抗性增强。以上 所有a2)中的所述选育对水稻条纹叶枯病抗性增强的植物品种的方法，均具体可包括将所 述蛋白质或其编码基因的表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。
[0022] 本发明的再一个目的是提供一种培育对水稻条纹叶枯病抗性增强的转基因植物 的方法。
[0023] 本发明所提供的培育对