专利名称：水稻条纹叶枯病干扰病毒基因表达载体的构建方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及防治水稻条纹叶枯病技术领域，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。
背景技术：
近几年，水稻条纹叶枯病在我省及周边地区的水稻上连年猖獗，给江苏省的水稻生产和农民的经济利益造成了灾难性影响。该病最早于1897年在日本的关东发现，后在朝鲜、乌克兰、中国等地均有发生。目前它已分布于我国的16个省(市)，给我国的水稻生产造成了严重损失。该病于上世纪60年代前后始见于江苏省，70年代在苏南、苏中少数地区曾一度流行，以后几乎是销声匿迹。但自80年代末期以来，水稻条纹叶枯病在我省的发生有所加重。进入21世纪，该病的发生度和发生范围逐年扩大，已成为我省乃至长江淮河流域稻区水稻生产上最主要的病害。
对待灰飞虱及其传播的条纹叶枯病，一般贯彻“预防为主，综合治理”的植保方针，采用治虫防病结合生态调控等一系列措施。其基本策略包括让植物在生长过程中能“逃避”病虫害的袭击(如播种期、栽植期的调整)；使害虫不愿进入目标作物田(如对某些植物喷施拒避剂)；害虫在目标植物上不愿取食或取食为害量小(如对某种植物喷施植物保护剂或在某种植物田种植其它引诱植物)；害虫为害靶标植物后生长发育不良甚至死亡(如抗虫品种的利用)。
在RSV的生物学，病理学和分子生物学等方面，很多研究单位曾经作了大量研究工作，并推测RSV的外壳蛋白(coat protein，CP)和病害特异性蛋白(disease-specific protein，SP)等可能的致病相关蛋白。
RNAi现象发现以来，RNAi作为一种新的基因阻断技术，具有特异、有效的基因沉默效应，能够简单、高效地阻抑特定基因的表达，适用于低等动物及高等动物。它成为研究基因功能的一种有力工具。由于干扰载体pUCCRNAi可以方便用于目的基因RNAi干扰载体的构建，从而可以特异地使特定的目的基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此干扰载体pUCCRNAi可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。
发明内容
本发明目的在于构建一种可用于防治水稻条纹叶枯病的干扰病毒基因表达载体。
本发明先在干扰载体pUCCRNAi中插入两段水稻条纹叶枯病病毒七个基因的任一片段，得到RNA干扰载体重组质粒；然后将RNA干扰载体重组质粒与植物表达载体pCam23A连接转化，得到RNAi表达载体重组质粒；最后将RNAi表达载体重组质粒导入根癌农杆菌或大肠杆菌，得到水稻条纹叶枯病干扰病毒基因表达载体。
本发明是利用RNAi技术，改善了目前单一防治措施常常达不到预期效果，特别是防治面积小时防效更差的局面。此法可以大幅度节省人力、物力成本。同时能够有效解决困扰稻作生产的安全隐患，提高生产粮食的商品价值和食用品质，显著增加农民的种田收入，这对保障稻作的安全、稳定生产具有重要意义。使用无公害的生物农药能够在一定程度上避免抗虫抗病毒农药的泛滥使用，保护农田生态环境，降低农产品的农药残留，保护作为食用者的人体不受有毒物质侵害，为绿色农业提供有力的技术支持。
分别将七个基因片段整合入RNAi载体并进一步构建干扰病毒基因表达载体的步骤包括(1)构建RNA干扰载体重组质粒先将干扰载体pUCCRNAi经BglII和XhoI双酶切，与用内切酶BglII和XhoI双酶切的目的基因DNA片段连接转化后得到重组质粒，再将重组质粒分别经BamHI和SalI双酶切，与用内切酶BglII和XhoI双酶切的目的基因DNA片段连接，转化后得到RNA干扰载体重组质粒；(2)表达载体的构建与大肠杆菌导入用PstI酶切RNA干扰载体重组质粒，与用PstI酶切的植物表达载体pCam23A连接转化，得到RNAi表达载体重组质粒；(3)RNAi表达载体的根癌农杆菌导入采用DNA直接转化法将RNAi表达载体重组质粒导入根癌农杆菌或大肠杆菌。
本发明中，水稻条纹叶枯病病毒七个基因片段的克隆包括以下步骤(1)采用冷酚法提取水稻条纹叶枯病病毒的总RNA；(2)分别采用七对引物对水稻条纹叶枯病病毒的总RNA进行RT-PCR扩增后，分别回收相应的目的基因DNA片段；根据已经公布的水稻条纹叶枯病病毒基因组序列分别设计七对引物
本发明的第二个目的在于，将水稻条纹叶枯病干扰病毒基因表达载体用于培育具有预防条纹叶枯病的水稻。
具体方法是将干扰病毒基因表达载体导入水稻根癌农杆菌。
上述培育方法包括以下步骤(1)水稻胚性愈伤组织的诱导取饱满无虫害的水稻成熟种子，去壳、消毒后，将成熟种子接种于诱导培养基25℃黑暗条件下培养2周诱导愈伤组织；(2)愈伤组织的农杆菌侵染及共培养挑选干燥后的愈伤组织，将其和农杆菌菌液按比例混合，浸泡20min，转移到共培养培养基上于25℃，暗培养2～3天；所述愈伤组织和农杆菌菌液的重量比为1∶10(3)抗性愈伤组织的筛选将共培养后的愈伤组织干燥处理后转移到筛选培养基上，筛选2次，每次2～3周；(4)抗性愈伤组织的分化挑选抗性愈伤组织，进行预分化2～3周后，再把带有绿点的抗性愈伤转到有分化培养基的三角瓶中进行分化。
本发明的第三个目的在于将水稻条纹叶枯病干扰病毒基因表达载体用于防治水稻条纹叶枯病。
向三叶期水稻茎杆注射或喷洒克隆有RNAi表达载体的大肠杆菌菌液，可起到防治水稻条纹叶枯病的作用。
采用DNA直接转化法将RNAi表达载体重组质粒导入大肠杆菌，可制成注射或喷洒液。
包括以下步骤(1)接种大肠杆菌单菌落于2mL含50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，28℃，220-250rpm震荡培养至OD600为0.8±0.05(此时菌体处于活跃的对数生长期)。
(2)吸取1mL培养菌液于2000mL含50ug/mL卡那酶素(kan)的LB液体培养基中放大培养，28℃，220-250rpm震荡培养至OD600为0.8±0.05此时菌体处于活跃的对数生长期)。
(3)5000rpm离心10分钟收集菌体，用500mlLB液体悬浮，加入100μMAS1mL以增强大肠杆菌活性，并加入利于大肠农杆菌菌液向水稻组织渗透的5ml吐温试剂。
图1为利用RNAi技术防治水稻条纹叶枯病技术流程图。
图2为感病水稻植株中目的基因CP基因片段的RT-PCR扩增电泳图谱。
图3为RNA干扰载体重组质粒的pst1酶切鉴定电泳图谱。
图4为重组质粒pCam23-目的的Pst1酶切鉴定电泳图谱。
图5为RT-PCR法检测水稻条纹叶枯病病毒RNA丰度电泳图谱。
图6分别为整合有七个方向相反目的基因片段的RNAi载体构建图。
具体实施例(一)目的基因片段的克隆，共分为三个步骤
1、根据已经公布的水稻条纹叶枯病病毒基因组序列分别设计七对引物
2、水稻条纹叶枯病病毒总RNA的提取选取不同时期水稻条纹叶枯病病株的幼穗和叶片约250mg，采用冷酚法提取水稻条纹叶枯病病毒总RNA。
3、七个目的基因片段的克隆及DNA片段的回收采用一步法试剂盒，以设计完成的七对引物对病株总RNA进行RT-PCR扩增(如图2所示)。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳(80V，1h)，TBE缓冲液体系。电泳染色后，长波紫外灯下切取目的条带，用QIAEXII Gel Extraction Kit(QIAGEN产品)回收DNA片段。
(二)RNAi表达载体的构建及导入根癌农杆菌共分为三个步骤1、干扰载体pUCCRNAi(附件1)的构建将干扰载体pUCCRNAi经BglII和XhoI双酶切，与用内切酶BglII和XhoI双酶切的目的基因片段连接转化后得到重组质粒。将所得重组质粒分别经BamHI和SalI双酶切，与用内切酶BglII和XhoI双酶切的目的基因片段连接，转化后得到RNA干扰载体重组质粒(如图2所示)。
2、表达载体的构建与大肠杆菌导入用PstI酶切已构建成功的RNA干扰载体重组质粒，与用PstI酶切的植物表达载体pCam23A连接转化得到RNAi表达载体重组质粒(如图3所示)。
3、RNAi表达载体的根癌农杆菌导入DNA直接转化法分别将克隆有7段水稻条纹叶枯病病毒基因片段的RNAi表达载体重组质粒导入根癌农杆菌。
(三)培育预防水稻条纹叶枯病水稻的转基因操作1、水稻胚性愈伤组织的诱导选取饱满无虫害的水稻成熟种子去壳后，消毒处理后，将成熟种子接种于诱导培养基25℃黑暗条件下培养2周诱导愈伤组织。
2、愈伤组织的农杆菌侵染及共培养挑选颜色新鲜呈淡黄色结构致密生长旺盛的颗粒状胚性愈伤组织在培养皿上适当干燥后，将愈伤组织和农杆菌菌液按1∶10重量比例混合，浸泡20min，转移到共培养培养基上于25℃，暗培养2～3天。
3、抗性愈伤组织的筛选将共培养后的愈伤组织取出放在有3层滤纸的灭菌培养皿中干燥2～3天，经干燥处理过的愈伤组织转移到筛选培养基上，筛选2次，每次2～3周。
4、抗性愈伤组织的分化挑选抗性愈伤组织，在含有1～2层无菌滤纸的培养皿上，25℃，光照条件下，干燥处理1天，然后把它转到含分化培养基的三角瓶上进行预分化2～3周，此时，抗性愈伤组织会大量的增殖，并有绿点产生。把带有绿点的抗性愈伤转到有分化培养基的三角瓶中进行分化。
(四)注射或喷洒大肠杆菌菌液的制取1、接种大肠杆菌单菌落于2mL含50ug/mL卡那酶素(kan)的LB液体培养基中，28℃，220-250rpm震荡培养至OD600为0.8±0.05。
2、吸取1mL培养菌液于2000mL含50ug/mL卡那酶素(kan)的LB液体培养基中，28℃，220-250rpm震荡培养至OD600为0.8±0.05。
3、5000rpm离心10分钟收集菌体，用500mlLB液体悬浮，加入100μMAS1ml，并加入5ml吐温。
4、用法在水稻三叶期时向茎杆注射或大田喷洒。
下面仅以水稻条纹叶枯病病毒七个基因中的一个基因——CP基因为实例说明本项发明的研制过程与技术依据。
实例1以C1、C2为引物对病株总RNA进行RT-PCR扩增，扩增得到990bp的目的条带，见图2。图2中M为分子量标记；P为正常水稻植株；1，2，3，4为感病水稻植株。
C15′cgctcgaggttcagtctagtcatctgcac3′C25′cgagatcttagaatgggtaccaacaagcc3′实例2RNA干扰载体重组质粒的获得采用Pst1酶切鉴定，酶切得到2.2kb的条带(图3)，这其中应该包括两个方向相反的目的基因片段和用于形成发卡结构的199bp的片段，酶切结果与预期相符，说明目的基因的RNA干扰载体重组质粒组装成功。图3中M为分子量标记；1，2，3，4，5，6为Pst1酶切目的基因RNA干扰载体重组质粒。
实例3重组质粒RNAi-目的采用Pst1酶切鉴定，酶切得到2.2kb的条带(图4)，这其中应该包括两个方向相反的目的基因片段和用于形成发卡结构的199bp的片段，酶切结果与预期相符，说明表达载体重组质粒构建成功。图4中M为分子量标记；1，2，3PST1酶切重组质粒pCam23-目的。
实例4利用转基因技术，通过愈伤诱导、侵染，共培养，筛选，分化等操作步骤得到转基因苗，通过田间接种鉴定，7个转基因RNAi水稻均表现出不同程度的抗性增加。如下表1表1 转基因品系的接虫传毒鉴定
实例5水稻三叶期茎杆注射或大田喷洒，喷洒方式与传统气雾喷洒方式相同，通过与未注射或未喷洒菌液的植株对照，每个处理分别随机调查处理植株100株，可以发现利用克隆有RNAi-目的片段载体的大肠杆菌防治水稻条纹叶枯病技术具有较明显的效果(见图5，表2，表3)。
图5中，ACTIN以ACTIN特异引物应用RT-PCR法把水稻RNA标定在同一丰度上；SP以SP特异引物应用RT-PCR法比较病毒RNA丰度；1，2，3，4，5未喷洒菌液植株；6，7，8，9，10喷洒菌液植株。由图5可得知喷洒菌液后水稻组织中病毒RNA丰度明显降低。
表2 两品种及对照田间发病情况统计(注射法)
表3 两品种及对照田间发病情况统计(喷洒法)
权利要求
1.水稻条纹叶枯病干扰病毒基因表达载体的构建方法，其特征在于先在干扰载体pUCCRNAi中插入两段水稻条纹叶枯病病毒七个基因的任一片段，得到RNA干扰载体重组质粒；然后将RNA干扰载体重组质粒与植物表达载体pCam23A连接转化，得到RNAi表达载体重组质粒；最后将RNAi表达载体重组质粒导入根癌农杆菌或大肠杆菌，得到水稻条纹叶枯病干扰病毒基因表达载体。
2.根据权利要求1所述的水稻条纹叶枯病干扰病毒基因表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤(1)构建RNA干扰载体重组质粒先将干扰载体pUCCRNAi经BglII和XhoI双酶切，与用内切酶BglII和XhoI双酶切的目的基因DNA片段连接转化后得到重组质粒，再将重组质粒分别经BamHI和SalI双酶切，与用内切酶BglII和XhoI双酶切的目的基因DNA片段连接，转化后得到RNA干扰载体重组质粒；(2)表达载体的构建与大肠杆菌导入用PstI酶切RNA干扰载体重组质粒，与用PstI酶切的植物表达载体pCam23A连接转化，得到RNAi表达载体重组质粒；(3)RNAi表达载体的根癌农杆菌导入采用DNA直接转化法将RNAi表达载体重组质粒导入根癌农杆菌或大肠杆菌。
3.根据权利要求1或2所述水稻条纹叶枯病干扰病毒基因表达载体的构建方法，其特征在于水稻条纹叶枯病病毒七个基因片段的克隆包括以下步骤(1)采用冷酚法提取水稻条纹叶枯病病毒的总RNA；(2)分别采用七对引物对水稻条纹叶枯病病毒的总RNA进行RT-PCR扩增后，分别回收相应的目的基因DNA片段；所述七对引物是引物一5′cgctcgaggtgccatcaaagacagaatag3′5′cgagatcttcactgactgaccaaccct3′引物二5′cgctcgagtttctccataaatataaaag3′5′cgagatctgaccaagacatagtcatcac3′引物三5′cgctcgagcaaccacccttatcacaaac3′5′cgagatctacagcaaacagaatacacct3′引物四5′cgctcgagtcgtctgtgggttctgtgg3′5′cgagatcttgacactaggaacggtaaagg3′引物五5′cgctcgaggttcagtctagtcatctgcac3′5′cgagatcttagaatgggtaccaacaagcc3′引物六5′cgctcgagagaatcgaagatgcaagaggta3′5′cgagatctactatgtcttgtgtagaagagg3′引物七5′cgctcgaggtgaaagcacctccaacagc3′5′cgagatctaggcccataggaaagcaact3′。
4.如权利要求1所述水稻条纹叶枯病干扰病毒基因表达载体，用于培育具有预防条纹叶枯病的水稻。
5.根据权利要求4所述培育方法，其特征在于将干扰病毒基因表达载体导入水稻根癌农杆菌。
6.根据权利要求5所述培育方法，其特征在于包括以下步骤(1)水稻胚性愈伤组织的诱导取饱满无虫害的水稻成熟种子，去壳、消毒后，将成熟种子接种于诱导培养基25℃黑暗条件下培养2周诱导愈伤组织；(2)愈伤组织的农杆菌侵染及共培养挑选干燥后的愈伤组织，将其和农杆菌菌液按比例混合，浸泡20min，转移到共培养培养基上于25℃，暗培养2～3天。(3)抗性愈伤组织的筛选将共培养后的愈伤组织干燥处理后转移到筛选培养基上，筛选2次，每次2～3周；(4)抗性愈伤组织的分化挑选抗性愈伤组织，进行预分化2～3周后，再把带有绿点的抗性愈伤转到有分化培养基的三角瓶中进行分化。
7.如权利要求1所述水稻条纹叶枯病干扰病毒基因表达载体，用于防治水稻条纹叶枯病。
8.根据权利要求7所述防治方法，其特征在于在水稻三叶期时向茎杆注射或喷洒克隆有RNAi表达载体的大肠杆菌。
9.根据权利要求8所述防治方法，其特征在于采用DNA直接转化法将RNAi表达载体重组质粒导入大肠杆菌，制成注射或喷洒液。
10.根据权利要求9所述防治方法，其特征在于制成注射或喷洒液包括以下步骤(1)接种大肠杆菌单菌落于2mL含50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，28℃，220-250rpm震荡培养至OD600为0.8±0.05；(2)吸取1mL培养菌液于2000mL含50ug/mL卡那酶素的LB液体培养基中放大培养，28℃，220～250rpm震荡培养至OD600为0.8±0.05；(3)5000rpm离心10分钟收集菌体，用500mlLB液体悬浮，加入100μM AS1mL和5mL吐温试剂。
全文摘要
水稻条纹叶枯病干扰病毒基因表达载体的构建方法及其用途，涉及防治水稻条纹叶枯病技术领域，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。先在干扰载体pUCCRNAi中插入两段水稻条纹叶枯病病毒七个基因的任一片段，得到RNA干扰载体重组质粒；然后将RNA干扰载体重组质粒与植物表达载体pCam23A连接转化，得到RNAi表达载体重组质粒；最后将RNAi表达载体重组质粒导入根癌农杆菌或大肠杆菌，得到水稻条纹叶枯病干扰病毒基因表达载体，该载体可用于培育具有预防条纹叶枯病的水稻，或防治水稻条纹叶枯病。
文档编号A01H4/00GK1807635SQ20061003826
公开日2006年7月26日 申请日期2006年2月14日 优先权日2006年2月14日
发明者梁国华 申请人:扬州大学