一种与水稻抗条纹叶枯病基因位点紧密连锁的sts分子标记及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种与水稻抗条纹叶枯病基因位点紧密连锁的STS分子标记及应用，通过对水稻抗条纹叶枯病基因位点进行定位，根据定位结果设计一系列分子标记并进行多态性检测以及对抗病/感病品种进行鉴定筛选，得到一个与水稻抗条纹叶枯病基因位点qSTV11b紧密连锁的STS分子标记A14，该分子标记位于水稻第11染色体克隆AC136491.4上第80511碱基到80939碱基之间，与抗性基因表现高度紧密连锁，能准确有效区分抗病/感病品种或分离群体中纯合抗病/感病及杂合单株，而且操作简单、使用方便，可用于水稻条纹叶枯病抗性品种的选育及抗性基因资源的筛选。
【专利说明】一种与水稻抗条纹叶枯病基因位点紧密连锁的STS分子标记及应用
【技术领域】
[0001]本发明属分子遗传学领域，涉及一种与水稻抗条纹叶枯病基因位点紧密连锁的STS分子标记及应用，该分子标记可用于水稻条纹叶枯病抗性品种的选育及抗性基因资源的筛选。
【背景技术】
[0002]水稻条纹叶枯病(Rice Stripe Diease)是由水稻条纹病毒(Rice Stripe Virus,RSV)引起，是一种由灰飞虱刺吸传播的危害严重的水稻病毒病。该病主要发生在东亚的温带、亚热带地区。最早发现于日本的关东地区，之后在朝鲜、韩国、前苏联及我国均有发生。我国首见该病在1963年的苏南地区，之后迅速扩大到包括台湾在内的18个省市。近年来，据不完全统计，该病的发病面积已达4000万亩以上，尤以江苏省为代表的长江下游稻区为主。该病对我国粮食产量造成重大损失，极大威胁了我国的粮食安全。
[0003]经验表明，控制水稻条纹叶枯病最经济有效的方法是选用抗耐病品种。抗病资源的筛选及了解其遗传机理是选育抗病品种的基础。早年间学者们经鉴定发现的抗性品种的抗性主要由两对显性互补基因Stv-a和Stv-b，以及与Stv-b等位的不完全显性基因Stv-bi所控制。
[0004]Stv-a定位在水稻第6染色体；Stv_bi被定位在11染色体两个重叠克隆220B5和123A6之间，覆盖物理距离约286Kb (Kusaba，2003)。除此之外，其他一些对该病具有抗性的基因位点相继被报道，如Ikeda等(1982)在Kanto PL3中定位了一个与Stv_bi紧密连锁的抗性基因(Pinto，1999);Kazuo等(2002)在籼粳后代BLl中定位到一个新的与Stv_bi不连锁的不完全显性抗病基因；丁秀兰等在籼稻Dv85中检测到两个抗病QTL ；Meada等在日本陆稻品种Kanto72种检测到两个抗病QTL。
[0005]日本率先利用抗病基因Stv-bi育成第一个条纹叶枯病的抗性品种St.N0.1。之后，相继育出抗性品种中国31号、爱知6号、青空、月光、星光、葵风等。80年代，我国也育出一批抗性品种，如中作180、中作9和中作59等。针对江苏地区条纹叶枯病发病较重的情况，江苏省农科院较早致力于高抗条纹叶枯病粳稻品种的选育工作，先后育出一批优良品种，如镇稻88、镇稻99、徐稻3号、徐稻4号、盐粳5号、盐稻8号、扬粳9538等。
[0006]现有绝大部分抗性品种的抗性来源于籼稻品种Modan或Mudgo中位于第11染色体的单基因Stv-bi。然而对该病的抗性研究及抗病品种的选育不能单纯依靠这一个基因，在持久的选择压力下，该 基因存在对条纹叶枯病毒丧失抗性的可能性。因此，挖掘和利用新的对该病具优良抗性的基因对于该病的长期防治意义重大。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种与水稻抗条纹叶枯病基因位点紧密连锁的STS分子标记及应用，该分子标记位于水稻第11染色体克隆AC136491.4上第80511碱基到80939碱基之间，与抗性基因表现高度紧密连锁，能准确有效区分抗病/感病品种或分离群体中纯合抗病/感病及杂合单株，而且操作简单、使用方便。
[0008]为达到上述目的，本发明的技术方案是:
[0009]一种与水稻抗条纹叶枯病基因位点qSTVllb紧密连锁的STS分子标记，由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010]本发明的STS分子标记是通过以下步骤筛选得到的:
[0011]I)以抗病品种籼稻Dular为父本，意大利感病品种粳稻Balilia为母本杂交，F2代发生抗性分离，构建F2无性群体为作图群体，用于基因定位。
[0012]2)对作图群体进行人工接虫，通过田间调查进行抗性鉴定，根据田间调查结果，鉴定亲本及作图群体 对RSV的抗性。用SSR分子标记进行连锁分析并进行QTL检测，连续两年以株系发病率和病级指数为表型值，检测到位于11染色体上的两个QTLs，分别命名为qSTVllb和qSTVllc，同时将位点qSTVllb初步定位在微卫星标记RM287与RM209之间。
[0013]其中，连锁分析的过程为:提取定位群体的水稻基因组DNA，然后以该DNA作为模板，根据分子标记设计引物并合成，之后进行PCR扩增反应，扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，分析试验结果，获得数据。
[0014]提取DNA采用CTAB法，参照Murray等(1980)提出的方法进行。
[0015]设计引物:利用Gramene网站上(http://www.gramene.0rg)提供的微卫星序列搜索工具SSRIT，找出目标BAC序列中的微卫星序列，用Primer Premier5.0对微卫星的侧翼序列设计出上下游引物对。
[0016]PCR 反应体系:Tris-HCl (pH=8.3)，IOmmoI/L ；KC1, 50mmol/L ；MgCl2,2.5mmol/L ；Taq 酶，1.5U ;dNTP，4nmol ;引物，IOpmol ;模版 DNA，20ng。
[0017]PCR 反应程序:94°C预变性 4min ;94°C变性 Imin ；50°C _60°C退火 Imin ;72°C延伸1.5min ；32 个循环；72°C延伸 IOmin0
[0018]QTL检测:利用软件QTL Cartographer v2.0，以株系发病率和病级指数作为抗病性表型值，以L0D=2.5作为阈值，采用复合区间作图法进行抗水稻条纹叶枯病QTL的定位分析。
[0019]3)根据初步定位结果，利用F3分离群体和回交群体为作图群体对该连锁抗病位点进一步定位。根据初步定位结果，设计新分子标记，利用这些分子标记进行多态性检测，根据结果进行连锁分析，过程同步骤2)，进一步将qSTVllb定位在标记RM1355与标记STS11-31之间269.6Kb区域，遗传距离分别为0.6cM和0.4cM。
[0020]其中，F3分离群体由基因型杂合的F2株系收获的种子种植获得，回交群体为由基因杂合的F2无性株系与感病亲本Balilla回交得到的回交一代BC1F1群体。
[0021]新分子标记的设计过程为:利用http://shenghuan.shtu.edu.cn/上水稻DNA多态性数据库中的关于InDels的信息，再通过提供目的InDels IObp序列差异)两侧各20bp的序列及其位置，在相应的BAC上找到其两侧的基因组序列，然后根据这些序列通过软件Primer Premier5.0设计引物。
[0022]4)用BC4F2纯合单株的自交种，种植所得BC4F3代构建作图群体，通过人工接种及田间抗性调查分析，利用步骤3)中新设计的分子标记进行连锁分析，过程同步骤2)。筛选出在抗病及感病未本间具多态性的分子标记。
[0023]5)继续构建含qSTVllb的一系列染色体片段的渐渗系为作图群体，通过人工接种及田间抗性调查分析，利用步骤4)筛选出的分子标记进行连锁分析，过程同步骤2)，最终将该位点定位于A17和A38之间，物理距离为47.86Kb。
[0024]大量实验表明，其中一个STS标记A14与抗性基因表现高度紧密连锁，能准确有效区分抗病/感病品种或分离群体中纯合抗病/感病及杂合单株，而且操作简单、使用方便。
[0025]本发明中的株系发病率即发病株数比总株数；病级指数，参照Washio抗性鉴定标准，调查每株接种苗病级，分别将各级株数代入以下公式计算每株系病级指数。
[0026]病级指数=(100XA+80XB+60XBt+40XCr+20XC+5XD)/ 测试秧苗总株数。
[0027]本发明在连锁分析时所用的SSR分子标记是在Gramene网站上获得的。
[0028]本发明在PCR扩增反应中用到的Taq酶和dNTP均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，用到的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0029]本发明的分子标记可用于检测水稻品种、品系或育种材料的抗病性。用所述的STS标记扩增水稻品种、品系或育种材料的DNA，电泳检测结果中若只出现一条368bp的条带，则表明为纯合抗病植株，存在抗性位点qSTVllb，抗水稻条纹叶枯病；结果中若只出现一条429bp的条带，则表明为纯合感病植株，不存在该抗性位点，不抗水稻条纹叶枯病；结果中若出现368bp和429bp两条带，则表明为杂合植株，存在该抗性位点，抗水稻条纹叶枯病。
[0030]本发明所开发的STS分子标记检测结果准确、可靠，PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳即可快速检测，实验步骤简单、方便、快捷。该标记可用于水稻条纹叶枯病抗性品种的分子标记辅助选育及抗性基因资源的筛选，结合田间表现，不仅提高抗性品种选育的准确性，同时大大缩短了育种年限，避免了大量人力的浪费。
[0031]目前绝大部分抗性品种的抗性基因来源均是Stv-bi，然而仅仅依靠这一个基因，在持久的选择压力下，条纹叶枯病毒容易产生抗耐性，导致品种抗性的降低甚至丧失。本发明发现并定位了一个新的抗性位点，即qSTVllb，为今后水稻抗条纹叶枯病新品种的培育提供了另外一个抗性基因来源，对于该病的长期防治具有重大意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1是水稻11染色体上抗条纹叶枯病位点qSTVllb示意图。
[0033]图2和图3是利用本发明的STS分子标记A14对表3中材料进行抗性基因的检测结果；1_20材料顺序如表3。
【具体实施方式】
[0034]以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。
[0035]实施例1初步定位
[0036]材料:Balilla/DularF2无性系群体，两年间均使用226个株系；养于网室秧池内的灰飞虱，繁殖到实验所需虫量；抗性对照品种IR36 ;感病对照品种武育粳3号。
[0037]I)人工接虫及抗性调查分析 [0038]将室内培养的Balilla/DularF2无性系群体幼苗、两个亲本及F1幼苗炼苗后分两个重复移入小盆，盖上纱网，每个重复均放置抗性对照品种IR36及感性对照品种武育粳3号。待活棵后，按每株3头虫量向小盆内接入2-3龄灰飞虱若虫，每天赶虫三次。接种三天后，移去纱网，喷洒杀虫剂。将秧苗置于温室，常规管理，待4周后植株症状稳定后观察秧苗发病情况，确定株系发病率及每株接种苗病级指数。
[0039]2) DNA 提取
[0040]a)将约0.1克的水稻叶片放置于2mL离心管中，液氮冷冻后用竹签捣成粉末；[0041 ] b)加入 700 μ L 经 65 °C 预热的 2 X CTAB 提取缓冲液(1.4mol/LNaCl，IOOmmoI/LTris-Cl, 20mmol/LEDTA, pH8.0),充分混匀后置于 65°C水浴 30min，每隔 5min 混匀一次；
[0042]c)水浴完毕后，在每个离心管中加入700μ L氯仿，上下颠倒充分混匀，抽提5min ；
[0043]d) 1000Orpm,离心 8min ；
[0044]e)取上清500 μ L移入1.5mL离心管中；
[0045]f)加入500 μ L预先冷冻的异丙醇，混匀后冰上静置30min ；
[0046]g) 12000rpm,离心 5min ；
[0047]h)弃上清，DNA沉淀用70%的酒精洗涤2次；
[0048]i)弃尽洗涤液，DNA沉淀风干后溶于50 μ L的灭菌双蒸水中，于_20°C保存备用。
[0049]3)用SSR标记进行连锁分析
[0050]利用Gramene网站上(http://www.gramene.0rg)提供的微卫星序列搜索工具SSRIT,找出目标BAC序列中的微卫星序列，用Primer Premier5.0对微卫星的侧翼序列设计出扩增长度为200-700bp左右的上下游引物对，进行多态性检测，选出在抗病及感病亲本中间有多态性的标记对群体进行连锁分析。
[0051]PCR 反应体系:Tris-HCl (pH=8.3)，IOmmoI/L ；KC1, 50mmol/L ；MgCl2,2.5mmol/L ；Taq 酶，1.5U ;dNTP，4nmol ;引物，IOpmol ;模版 DNA，20ng。
[0052]反应程序:94°C 预变性 4min ;94°C 变性 Imin ；50°C _60°C 退火 Imin ;72°C 延伸
1.5min ；32 个循环；72°C延伸 IOmin0
[0053]3%琼脂糖凝胶电泳检测，120V,电泳120min。
[0054]4) QTL 检测
[0055] 利用软件QTL Cartographer v2.0,连续两年对株系发病率和病级指数作为抗病性表型值，以L0D=2.5作为阈值，采用复合区间作图法进行抗水稻条纹叶枯病QTL的定位分析，在两年都检测到2个QTLs，将位点qSTVllb初步定位在微卫星标记RM287与RM209之间，见表1、表2。表1为连续两年(1Y、2Y)以发病率为表型值检测抗水稻条纹叶枯病QTL的位置和特征，表2为连续两年(1Υ、2Υ)以病级指数为表型值抗水稻条纹叶枯病QTL的位置和特征。
[0056]表1
[0057]
【权利要求】
1.一种与水稻抗条纹叶枯病基因位点紧密连锁的STS分子标记，由上游引物和下游引物组成，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.如权利要求1所述的STS分子标记的应用，其特征在于，用所述的STS分子标记扩增水稻品种、品系或育种材料的DNA，电泳检测结果中若只出现一条368bp的条带，则表明存在抗性位点qSTVllb，为纯合抗病植株，抗水稻条纹叶枯病；结果中若只出现一条429bp的条带，则表明为纯合感病植株，不存在抗性位点qSTVllb，不抗水稻条纹叶枯病；结果中若出现368bp和429bp两条带，则表明存在抗性位点qSTVl Ib，为杂合抗病植株，抗水稻条纹叶枯 病。
【文档编号】C12Q1/68GK104004751SQ201410138338
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年4月8日 优先权日:2014年4月8日
【发明者】吴书俊, 闫影, 曹黎明, 万常照, 赵志鹏 申请人:上海市农业科学院