专利名称：水稻主效抗条纹叶枯病位点的分子标记方法
技术领域：
本发明提供了水稻条纹叶枯病抗性主效基因位点qSTV11可育种利用的分子标记方法，属于分子遗传学领域，专用于水稻条纹叶枯病抗性品种的选育与种质资源的利用。
二、技术背景水稻条纹叶枯病是由水稻条纹病毒引起的病毒病，其传毒介体主要是灰飞虱。近年随着免耕、稻套麦、麦套稻等轻型栽培技术以及感病高产品种的推广应用，加速了水稻条纹叶枯病的媒介灰飞虱带毒群体的扩大和危害。灰飞虱的刺吸时间短、持久传毒等特性，使治虫防病十分困难，使我国水稻条纹叶枯病的发生逐年加重。特别在江苏省已成为有史以来罕见的重大爆发性病害，全省病害的重发区包括苏北和苏中的淮安、连云港、宿迁、盐城、泰州、扬州、建湖等地区以及南通的局部地区，而镇江、徐州、南京等地区也呈加重趋势。重病区发病面积占水稻种植面积的90％以上，重灾区的漏防田块病穴率高达90％、病株率达70％以上，有的田块基本失收，造成了巨大的经济损失(魏太云等，植物病理学报.2003，33(3)284-285)。目前生产上主要结合耕作制度调整、栽培技术改进，适期治虫防病，但效果不佳，并且污染环境。最经济有效的方法仍是选用优良抗病品种，利用品种自身的抗性达到主动防治的目的。因此，培育高抗条纹叶枯病新品种具有重要的理论及现实意义。由于条纹叶枯病表型鉴定十分困难，培育抗条纹叶枯病水稻品种的进程异常缓慢，利用分子标记辅助选择方法可以有效解决这一难题。
发明内容
技术问题本发明的目的是提供水稻条纹叶枯病抗性主效基因位点qSTV11的可育种利用的分子标记方法，通过检测与该位点紧密连锁的分子标记，可以预测水稻植株对条纹叶枯病的抗性，加快抗条纹叶枯病水稻品种的选择进度。
技术方案水稻条纹叶枯病抗性主效基因位点的分子标记方法，其特征在于用标记引物BJ11-8，左端引物序列 TTGACGCCCAGAAGAGGTA
右端引物序列 AAGCGAAGAGCGAAAGAAA扩增水稻条纹叶枯病抗性或育种材料DNA，如果能够扩增出约130bp的扩增片段，则标志着水稻条纹叶枯病抗性位点qSTV11的存在，其中该主效基因位点位于水稻第11染色体，利用SAS软件测得与条纹叶枯病抗性不相关的概率P值为0.001，对条纹叶枯病抗性的贡献率35.79％；筛选上述标记引物的过程如下(1)利用Nipponbare/Kasalath//Nipponbare回交重组自交系群体，分别采用集团接种、强迫饲毒和田间鉴定的方法鉴定两个亲本和98个家系对条纹叶枯病的抗性，获得病情指数比率；(2)利用Yano提供的分子数据，采用QTL Cartographer 2.0软件，在三种接种鉴定条件下在第11染色体RFLP标记区间S2260-G257都检测到水稻条纹叶枯病抗性基因位点qSTV11，从而确定了可供分析利用的第11染色体RFLP标记的分子数据；(3)用SDS法提取回交重组自交系群体各株系的DNA，采用在标记区间S2260-G257设计的SSR引物筛选亲本间的多态性，PCR在PTC-200 PCR仪上进行，扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在重组自交系群体中进行分析，获取群体基因型资料；(4)将第11染色体RFLP标记的分子数据与步骤(3)得到的分子数据综合起来，利用MAPMARKER/EXP3.0软件重新构建第11染色体的连锁图谱，再利用QTLCartographer 2.0软件分析该位点；(5)利用SAS软件对各个家系的分子标记基因型资料和相应的每个家系的病情指数比率进行连锁分析，单向方差分析测得与条纹叶枯病抗性不相关的概率P值为0.001，P＜0.05的分子标记即与一个主效基因位点连锁，条纹叶枯病抗性位点的位置由分子标记的染色体位置确定在Kasalath中发现P＝0.001的BJ11-8标记和主效抗条纹叶枯病基因位点qSTV11紧密连锁(表2)，标记BJ11-8即为获得的水稻条纹叶枯病抗性主效基因位点qSTV11的分子标记。
有益效果本课题组利用Nipponbare/Kasalath//Nipponbare回交重组自交系群体，采用集团接种、田间鉴定和强迫饲毒的鉴定方法，在第11染色体标记区间S2260-G257均能检测到1个主效QTL，表明该QTL在不同的环境条件下都能稳定表达。然而，由于与该QTL紧密连锁的S2260和G257均为RFLP标记，难以用于辅助选择育种，因此筛选与该位点紧密连锁的SSR标记，无疑可以加速标记辅助选择技术在条纹叶枯病抗性品种选育过程中的利用。
本发明所提供水稻条纹叶枯病抗性主效基因位点qSTV11的可育种利用分子标记方法，具有以下优点
通过本发明分子标记在国际上首次获得定位了水稻品种Kasalath抗条纹叶枯病的主效基因位点，可解释35.79％的条纹叶枯病抗性。水稻条纹叶枯病抗性的研究十分困难，对水稻条纹叶枯病抗性位点的精确定位工作居于同领域前列；通过本发明分子标记定位的主效基因位点位置明确，鉴定方便。通过检测与该位点紧密连锁的分子标记，即可以预测水稻植株的条纹叶枯病抗性，用于水稻品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有抗条纹叶枯病，进而快速筛选抗病品种或品系用于水稻育种。主效基因位点的检测方便快速，不受环境影响；辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统育种方法中，首先要收集具有抗病基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交，而且要对条纹叶枯病抗性进行单株选择。条纹叶枯病的抗性受环境条件的影响很大，表型鉴定的结果可靠性偏低。因此抗病育种不仅费时，而且难度大，成本高。通过检测条纹叶枯病抗性主效基因位点，在苗期就可以鉴定出高抗条纹叶枯病的单株，淘汰其它植株，不仅节约生产成本而且大大提高抗条纹叶枯病水稻品种的选择效率。
四
图1水稻主效抗条纹叶枯病位点qSTV11可育种利用分子标记BJ11-8的指纹图谱。泳道1Marker；2抗病亲本Kasalath；3感病亲本日本晴；6、8、14、18、21、33、41泳道为抗病株系；其余泳道为感病株系。
五具体实施例方式
本发明的详细说明如下研究表明，在水稻第11染色体上相同位置存在一个控制条纹叶枯病抗性的稳定表达的主效基因位点。Maeda H等(1999)利用密阳23/秋光的重组自交系群体检测到在第11染色体上XNpb202～C1172标记之间的XNpb257附近存在抗条纹叶枯病的QTL，贡献率达17.36％，其抗性基因效应来自密阳23；Hayano-Saito等(1998)利用Modan的抗性后代Asanohikari与感病粳稻Koshihikari杂交所得的F2群体，将源于籼稻Modan的抗条纹叶枯病基因Stv-bi定位在第11染色体上的XNpb220与XNpb257标记之间。本课题组曾利用Kinmaze(粳)/DV85(籼)重组自交系群体检测到qStv11，来自抗性亲本DV85，贡献率高达30.9％，位于标记XNpb202～C1172之间。通过本发明水稻品种Kasalath抗条纹叶枯病主效基因位点的分子标记方法，在第11染色体上存在稳定主效的抗条纹叶枯病QTL qStv11可用来指导水稻抗条纹叶枯病品种的选育工作，用与之连锁的分子标记BJ11-8对抗病品种进行筛选，实现分子标记辅助选择育种，从而大大提高育种效率。
材料与方法
(一)亲本及Nipponbare/Kasalath//Nipponbare。该群体通过由Nipponbare(公知公用材料，Theor Appl Genet，1998，96997～1003)母本与Kasalath(公知公用材料，Theor Appl Genet，1998，96997～1003)父本杂交，所得Nipponbare/Kasalath F1再与Nipponbare父本回交，获得Nipponbare/Kasalath//Nipponbare BC1F1，然后由BC1F1通过单粒传法得到。包含98个家系的回交重组自交系群体的表型鉴定田间鉴定选用条纹叶枯病重发区江苏姜堰娄庄镇田间试验地。为保证获得虫源，选用四周为麦田的地块种植待鉴定的材料。当地灰飞虱的带毒率为39％。2004年5月10日(麦收前3周)播种。每个家系播50粒，均匀撒播1行，行长180cm，行距10cm。6月5日间苗，淘汰弱苗，各株系保留30～35株，株距5～6cm。注意水肥管理，不喷洒任何杀虫剂，以保证迁入充足的虫源。2次重复。2004年6月29日(播种后7周，麦收后4周)参照Washio(Bull Chugoku Agr Exp Sta.Series，1968，1639～197)的抗性鉴定标准，调查田间发病情况。
强迫饲毒将亲本和98个家系浸种催芽，分别播于直径5.8cm、高6.0cm，盛满营养土的圆形塑料钵中(钵底有一小孔，便于渗透吸水)。置65cm×44cm×14cm的塑料周转箱内(保持水层约2cm)，另加抗病和感病对照各2钵。每钵播种20～25粒露白发芽种子，接虫前4天间苗，淘汰病、弱苗，每钵保留10棵整齐一致的健苗用于接虫。2次重复。
当秧苗长至1.5～2.0叶时，进行接种灰飞虱鉴定。灰飞虱带毒率为40％左右。每钵罩以透明罩，顶端纱布封口，按每苗5头灰飞虱计算需虫量，接入2～3龄带毒灰飞虱。每天趋虫2次，使被测稻苗均匀受毒。48h后，移走全部灰飞虱，令接种后的苗于自然光照条件下生长发病。注意水肥管理。3～4周后，待病情发展稳定，参照Washio(Bull Chugoku Agr Exp Sta.Series，1968，1639～197)的抗性鉴定标准进行调查。
集团接种将两个亲本及98个株系的种子浸种催芽后，每个品种1行，随机播种于65cm×44cm×14cm的塑料周转箱内，每行20粒；当秧苗长至1.5-2.0叶时进行接虫鉴定，接虫前2天间苗，淘汰病弱苗，每个品种保留10株左右生长一致的幼苗，用于抗病性鉴定，重复两次。鉴定时，将周转箱放入防虫网内，按每株5头2-3龄灰飞虱若虫计算所需虫量(灰飞虱带毒率为40％左右)，将其均匀接入周转箱内，每天驱赶虫2次，72h后喷洒杀虫剂杀死接入苗箱中的灰飞虱，30天后观察秧苗发病情况。
按病害发生严重程度，根据Washio等(Bull Chugoku Agr Exp Sta.Series，1968，1639～197)的抗性鉴定标准，将各苗分成A、B、Bt、Cr、C和D等级别，统计各家系中不同级别的株数，按下列公式计算病情指数。
为排除环境的影响，再将每个株系的病情指数与感病对照品种的病情指数相比，再乘以100，计算出病情指数比率。
(二)重组自交系群体的分子标记分析利用Yano博士(Lin，S Y，T Sasaki，M Yano.Theor Appl Genet，1998，96997-1003)提供的分子数据，采用QTL Cartographer 2.0软件，利用复合区间作图法分析对抗水稻条纹叶枯病的QTL。在整个水稻染色体组中每隔2cM对QTL存在的可能性进行扫描，以LOD＝2.9(P＝0.05)作为阈值判断QTL的存在，在三种接种鉴定条件下在第11染色体RFLP标记区间S2260-G257都检测到水稻条纹叶枯病抗性基因位点qSTV11，从而确定了可供分析利用的第11染色体RFLP标记的分子数据；(三)与QTL紧密连锁的SSR标记分析取Nipponbare/Kasalath//Nipponbare回交重组自交系群体(BIL群体)、亲本及各家系的种子20粒，浸种催芽后播于一个6×10cm的塑料小钵子，大约两叶时剪取所有幼叶，保存于-80℃冰箱，根据Dellaporta等(Plant Mol Biol Rep，1983，119-21)的方法提取DNA。
(1)采用在标记区间S2260-G257设计的22对SSR引物筛选亲本间的多态性，PCR在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行，扩增产物在8％g/ml聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在重组自交系群体中进行分析，SSR分析参照Chen et al.(1997)的程序。10μl反应体系包括10mM Tris-HCl pH 8.3，50mM KCl，1.5mMMgCl2，50μM dNTPs，0.2μM引物，0.5U Taq聚合酶(TaKaRa，大连)和20ng ofDNA样品(作模板)。扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行94℃ 4min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1.5min，35个循环；72℃ 7min。扩增产物用8％的非变性PAGE胶分离，通过银染显色，银染程序根据Sanguinetti et al.(1994)的方法。扩增的DNA条带利用装有荧光灯的灯箱进行观察。记录结果，用亲本间有多态的标记分析F2群体各单株的标记基因型，获取F2群体各单株的基因型资料；将有多态的SSR引物的分子数据与第11染色体的RFLP标记的分子数据联合起来，利用MAPMARKER/EXP3.0软件，重新构建第11染色体的连锁图谱。再利用QTL Cartographer 2.0软件分析该位点。
利用SAS GLM程序对各个分子标记的群体基因型资料和与其对应每个家系的病情指数比率进行连锁分析，进一步验证其连锁关系。
(三)结果与分析
单向方差分析测得与条纹叶枯病抗性不相关的概率P值和位点对条纹叶枯病抗性的贡献率R2(表2)，P＜0.05的分子标记即与一个主效基因位点连锁。所得分子标记在群体中的基因型按亲本Kasalath和Nipponbare的基因型分类，如果基因型与Kasalath相同的株系表型为抗，则该标记定位的抗病主效基因位点来自Kasalath在Kasalath中发现P＝0.001的BJ11-8标记与条纹叶枯病抗性主效基因位点紧密连锁，即获得水稻Kasalath抗条纹叶枯病主效基因位点qSTV11的分子标记。
通过上述分子标记鉴定主效基因位点来预测水稻植株抗性，预计可迅速提高我国水稻条纹叶枯病抗性品种的育种进程。
表1.标记引物的序列及扩增片段大小
表2.水稻Kasalath抗条纹叶枯病主效基因位点的单向方差分析
P表示与条纹叶枯病抗性不相关的概率，P＜0.05表该标记与条纹叶枯病抗性紧密连锁R2位点对条纹叶枯病抗性的贡献率，值越大，表明与条纹叶枯病抗性越相关
权利要求
1.水稻条纹叶枯病抗性主效基因位点的分子标记方法，其特征在于用标记引物BJ11-8，左端引物序列 TTGACGCCCAGAAGAGGTA右端引物序列 AAGCGAAGAGCGAAAGAAA扩增水稻条纹叶枯病抗性或育种材料DNA，如果能够扩增出约130bp的扩增片段，则标志着水稻条纹叶枯病抗性基因位点qSTV11的存在，其中该主效基因位点位于水稻第11染色体，利用SAS软件测得与条纹叶枯病抗性不相关的概率P值为0.001，对条纹叶枯病抗性的贡献率35.79％。
2.根据权利要求1所述水稻条纹叶枯病抗性主效基因位点的分子标记方法，其特征在于，筛选上述标记引物的过程如下(1)利用Nipponbare/Kasalath//Nipponbare回交重组自交系群体，分别采用集团接种、强迫饲毒和田间鉴定的方法鉴定两个亲本和98个家系对条纹叶枯病的抗性，获得病情指数比率；(2)利用Yano提供的分子数据，采用QTL Cartographer 2.0软件，在三种接种鉴定条件下在第11染色体RFLP标记区间S2260-G257都检测到水稻条纹叶枯病抗性基因位点qSTV11，从而确定了可供分析利用的第11染色体RFLP标记的分子数据；(3)用SDS法提取回交重组自交系群体各株系的DNA，采用在标记区间S2260-G257设计的SSR引物筛选亲本间的多态性，PCR在PTC-200 PCR仪上进行，扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在重组自交系群体中进行分析，获取群体基因型资料；(4)将第11染色体RFLP标记的分子数据与步骤(3)得到的分子数据综合起来，利用MAPMARKER/EXP3.0软件重新构建第11染色体的连锁图谱，再利用QTLCartographer 2.0软件分析该位点；(5)利用SAS软件对各个分子标记的群体基因型资料和与其对应的每个家系的病情指数比率进行连锁分析，单向方差分析测得与条纹叶枯病抗性不相关的概率P值0.001，P＜0.05的分子标记即与一个主效基因位点连锁，条纹叶枯病抗性位点的位置由分子标记的染色体位置确定在Kasalath中发现P＝0.001的BJ11-8标记和主效抗条纹叶枯病基因位点qSTV11紧密连锁，标记BJ11-8即为获得的水稻条纹叶枯病抗性主效基因位点qSTV11的分子标记。
全文摘要
本发明涉及水稻条纹叶枯病抗性主效基因位点的分子标记方法，属于分子遗传学领域。对水稻品种Nipponbare(♀)与Kasalath(♂)杂交，再用Nipponbare回交获得的回交重组自交系的各家系的基因型和各家系的病情指数比率进行遗传连锁分析，获得Kasalath抗条纹叶枯病主效基因位点qSTVll的可育种利用的分子标记BJ11－8。利用分子标记BJ11－8来检测Kasalath及其衍生品种(系)中是否含有该主效基因位点，可预测其条纹叶枯病抗性水平，显著提高抗条纹叶枯病水稻品种的选择效率。
文档编号C12N15/11GK1896283SQ20061008540
公开日2007年1月17日 申请日期2006年6月13日 优先权日2006年6月13日
发明者万建民, 孙黛珍, 江玲, 张迎信, 陈亮明, 刘世家, 刘喜, 王春明, 程遐年, 翟虎渠 申请人:南京农业大学