专利名称：一种水稻条纹病毒的免疫检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水稻条纹病毒的免疫检测试剂盒及其在农业上的应用，属于农业科学技术领域。
背景技术：
水稻条纹病毒(RSV)引起的水稻条纹叶枯病最早于1897年在日本关东发现，后在朝鲜、乌克兰和中国均有发生。我国自1962年在江浙发现该病毒以来，已经在全国16个省、市、自治区流行。该病目前在云南、辽宁、北京、河南，山东、江苏、上海仍十分常见，特别是云南的宝山、楚雄、昆明，北京的双桥，河南原阳，山东济宁及江苏北部的姜堰、洪泽等地，发生更为普遍。
其持续暴发的主要原因是近几年的暖冬气候有利于传毒昆虫灰飞虱的越冬，灰飞虱毒源基数得以多年积累，加上易感病水稻品种大量种植。据不完全统计，仅2004年江苏省水稻条纹叶枯病发生面积就达2700万亩，占江苏省水稻面积的79％，专家预计2006后的五年内水稻条纹叶枯病仍将呈偏重发生趋势，预防工作刻不容缓。
而水稻条纹叶枯病是以灰飞虱传播的植物病毒病，一旦发病为害尚无药可治，故该病的防治应以控制灰飞虱为关键即“治虫防病”.而灰飞虱的带毒虫量是水稻条纹叶枯病发生流行的主要影响因子，因此建立一种快速灵敏检测灰飞虱带毒率的方法对于预测水稻条纹叶枯病的流行及病害防治等是十分必要的。目前国际上用于检测灰飞虱带毒率的方法包括ELISA、RT-PCR、Northern杂交等，但RT-PCR和Northern成本高，不适于大批量检测样品；周益军等制备RSV单抗用于病毒检测，以此为基础建立斑点免疫法的RSV检测方法具有快速灵敏、简单易行的特点，有望检测一种适合于我国基层农技人员应用的RSV检测技术，在早期开展对带毒虫的早期检测并及时预警，同时还可以应用于RSV、灰飞虱和植物寄主三者之间互作关系的基础领域的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种灰飞虱体内水稻条纹病毒的检测试剂盒。
本发明的水稻条纹病毒检测试剂盒包括1)RSV单克隆抗体RSV免疫小鼠获得单克隆抗体(1∶5000-20000)，每单位100ul；2)酶标二抗A辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG，其工作效价为1∶5000-10000，每单位100ul，用于检测灰飞虱携带的RSV；3)酶标二抗B碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗鼠IgG，其工作效价为1∶100000-300000，每单位100ul，用于检测植物组织携带的RSV；4)硝酸纤维素膜；5)样品处理液磷酸盐缓冲液(PBS)(0.01M，pH值7.5)；6)洗液磷酸盐吐温缓冲液(PBST)(1000ml 0.01M PBS中加0.5mlTween-20)；7)封闭液1％脱脂奶粉(0.01M PBST)或2％小牛血清蛋白(BSA)(0.01M PBST)；8)显色液A12mg 4-氯-1-萘酚、4ml无水乙醇、10ml 0.02M PBS(pH7.4)、7μl 30％H2O2临用前混合，用于检测灰飞虱携带的RSV；9)显色液BBCIP/NBT，用于检测植物组织携带的RSV；RSV检测试剂盒在室温下(4-25℃)使用方法为1)用纯净水将洗液稀释10倍至0.01M，配置封闭液备用。
2)硝酸纤维素膜(NC)膜用铅笔画0.25cm2左右的正方格。
3)单头灰飞虱或待测植物组织1克置0.2ml离心管中加2滴样品处理液，用牙签捣碎，取上清1小滴约3μL或用牙签重复3-4次点样于硝酸纤维素膜正方格中央，室温晾干。
4)将干燥的膜浸入封闭液中，室温1h。
5)在10ml封闭液加入一个单位的单抗，将膜取出浸入，室温放置3h。
6)取出膜，洗液洗3次，每次3-5min。
7)取一个单位二抗A或B加入10ml封闭液中，将膜取出浸入，室温放置3h。
8)取出膜洗液洗3次，每次3min。
9)将膜浸入新配制的显色液A或B中，室温至显色(1-2h)。
10)显色后，用自来水冲洗，室温晾干。
11)根据方格内的颜色确定样品的带毒情况，呈兰紫色为带毒，无色为不带毒。
RSV检测试剂盒在实验室条件下(37℃)使用方法为1)用纯净水将洗液稀释10倍至0.01M，配置封闭液备用。
2)硝酸纤维素膜(NC)膜用铅笔画0.25cm2左右的正方格。
3)单头灰飞虱或待测植物组织1克置0.2ml离心管中加2滴样品处理液，用牙签捣碎，5000rpm离心3min，取上清3μL点于NC膜正方格内，室温凉干。
4)将干燥的膜浸入封闭液中，37℃摇床，30min。
5)在10ml封闭液加入一个单位的单抗，将膜取出浸入，37℃摇床，1-1.5h。
6)取出膜，洗液洗3次，每次3min。
7)取一个单位二抗A或B加入10ml封闭液中，将膜取出浸入，37℃摇床，1.5h-2h。
8)取出膜洗液洗3次，每次3min。
9)将膜浸入新配制的显色液A或B中，37℃摇床，30min。
10)显色后，用自来水冲洗，室温凉干。
11)根据方格内的颜色确定样品的带毒情况，呈兰紫色为带毒，无色为不带毒。
图1为DIBA法检测灰飞虱带毒率结果示意2为DIBA检测病叶和单头带毒灰飞虱结果示意图(A为病叶，B为单头无毒灰飞虱，a～e分别为不同单头带毒灰飞虱；1-11为不同稀释倍数处理，依次分别为100倍、200倍、400倍、800倍、1600倍、3200倍、6400倍、12800倍、25600倍、51200倍、102400倍和204800倍)图3为37℃下单抗孵育时间试验结果示意图(1-6分别表示样品在单抗中孵育0.5h，1h，1.5h，2h，2.5h，3h六种处理)图4为37℃下二抗孵育时间试验结果示意图(I-VI分别表示样品在二抗中孵育0.5h，1h，1.5h，2h，2.5h，3h六种处理)具体实施方法实施例1，对传播介体灰飞虱进行带毒情况检测，室温下的步骤为1)用纯净水将洗液稀释10倍至0.01M，配置封闭液备用。
2)硝酸纤维素膜(NC)膜用铅笔画0.25cm2左右的正方格。
3)单头灰飞虱置0.2ml离心管中加2滴样品处理液，用牙签捣碎，取上清1小滴约3μL点样于硝酸纤维素膜方格中央，室温晾干。
4)将干燥的膜浸入封闭液中，室温1h。
5)在10ml封闭液加入一个单位的单抗，将膜取出浸入，室温放置3h。
6)取出膜，洗液洗3次，每次3-5min。
7)取一个单位二抗A加入10ml封闭液中，将膜取出浸入，室温放置3h。
8)取出膜洗液洗3次，每次3min。
9)将膜浸入新配制的显色液A中，室温至显色(1-2h)。
10)显色后，用自来水冲洗，室温晾干。
11)试验结果如图1，根据方格内的颜色确定样品的带毒情况，呈兰紫色为带毒，无色为不带毒。
实施例2，样品稀释度试验单头灰飞虱及病叶从100倍开始，按倍比稀释成11个梯度，以无毒灰飞虱做同样稀释度为阴性对照。
结果表明，单头灰飞虱稀释到25600倍仍可见微弱的阳性反应，但稀释100倍阳性反应最强，常规检测多采用稀释100-200倍；病叶稀释到51200倍仍可见微弱的阳性反应，但稀释400倍目测效果较好，常规检测多采用稀释200-500倍(图2)。但最好采用新鲜发病叶片或采用检测植物组织的方法。
实施例3，抗体孵育时间试验单抗工作浓度1∶20000，37℃下分别孵育0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h(二抗使用浓度1∶2500，二抗孵育1.5h)，以确定改变单抗孵育时间对检测结果的影响。结果表明37℃孵育0.5h时，就可检测出阳性样品，孵育1h时的斑点颜色与孵育1.5h、2h、2.5h时基本没有区别，孵育3h时颜色略有下降(图3)。故确定单抗37℃孵育1～1.5h为最佳孵育时间。
确定单抗使用浓度1∶20000，且37℃下孵育1.5h；二抗使用浓度1∶2500，37℃下分别孵育0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h，以确定改变二抗孵育时间对检测结果的影响。结果表明37℃孵育0.5h时，基本检测不出阳性样品，孵育1h时的斑点颜色较浅，孵育1.5h可明显检测出阳性样品，孵育2h，2.5h，3h时颜色较深且显色程度基本相同(图4)，故确定二抗37℃孵育1.5h-2h为最佳孵育时间。
实施例4，试剂盒保存期试验试剂盒保存条件为4℃，经过6个月的测定，应用试剂盒可获得明显的检测结果。考虑到试剂盒中单抗和二抗的温度适应性，要求试剂盒在运输时必须采用低温运输方式。
本发明主要服务于水稻条纹病毒在水稻及带毒昆虫的快速准确检测，可使基层及检疫部门及时对病害进行预测预报预警并制定总体防治策略，即可防治高带毒率的灰飞虱的进一步扩散取食成灾，又可减少盲目用药造成的农本增加和环境污染的加重。同时该项技术在病毒与传毒介体的互作关系、品种的抗性鉴定及抗性遗传分析、疑是病例的诊断等方面也具有很大的应用价值。鉴于国内还没有一种适于基层农技部门使用及拥有自主知识产权的水稻条纹病毒的检测试剂盒，本发明可以说是对当前国内现状的一个及时填补。
上述实施不以任何形式限定本发明。
权利要求
1.一种用于检测水稻条纹病毒的免疫检测试剂盒，其特征在于包含水稻条纹病毒特异性单克隆抗体和酶标二抗。
2.根据权利要求1所述的水稻条纹病毒的免疫检测试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括硝酸纤维素膜、样品处理液、封闭液、洗液和显色液。
3.根据权利要求1或2所述的水稻条纹病毒的免疫检测试剂盒，其特征在于所述水稻条纹病毒的鼠源的单克隆抗体。
4.根据权利要求1或2所述的水稻条纹病毒的免疫检测试剂盒，其特征在于所述二抗为辣根过氧化酶(HRP)或碱性磷酸酯酶(AP)标记的羊抗鼠IgG血清制剂。
5.根据权利要求1或2所述的水稻条纹病毒的免疫检测试剂盒，其特征在于所述洗液为含有0.5％的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1或2所述的水稻条纹病毒的免疫检测试剂盒，其特征在于所述显色液为4-氯-1-萘酚、无水乙醇、PBS(pH7.4)和30％H2O2的混合液或BCIP/NBT。
7.根据权利要求1或2所述的水稻条纹病毒的免疫检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒在实验室和非实验室条件下均可使用。
8.根据权利要求1或2所述的水稻条纹病毒的免疫检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒可在4℃以下条件保存6个月。
全文摘要
本发明公开了一种水稻条纹病毒的免疫检测试剂盒及其使用方法。利用水稻条纹病毒(RSV)特异性单克隆抗体建立了一种斑点免疫(DIPA)检测方法，以该方法建成了水稻条纹病毒的检测试剂盒，其主要试剂均以工作液或浓缩液形式提供，具有使用方便、操作简单、检测快速灵敏、结果准确可靠等特点。该试剂盒可在非实验室条件下快速检测出传播介体灰飞虱或植物寄主中是否携带有RSV，其可以应用于RSV、灰飞虱和植物寄主三者之间互作关系的研究，也可直接推广到基层农技单位以开展病害的预测预报、疑是病例的诊断等方面，以便及时采取措施控制灾情，减少损失。
文档编号G01N33/569GK1828304SQ20061003818
公开日2006年9月6日 申请日期2006年2月9日 优先权日2006年2月9日
发明者周益军, 周彤, 程兆榜, 熊如意, 刘海建 申请人:江苏省农业科学院