专利名称：水稻稻瘟病抗性基因Pi15及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种水稻稻瘟病抗性基因Pi15的克隆及其应用。
背景技术：
植物在生长的过程中，常常受到多种病原物的侵害，而植物则采取多种防御策略以保护自身，避免受其侵袭。植物中一个最重要的防御机理就是能够识别专性致病微生物的存在并启动自身的防御应答系统。植物对病原菌的识别由抗病基因所介导。因此，抗病基因产物结构的分析与研究，是了解植物抗病机制的基础，对于植物病害的预防和控制也具有重要的指导意义。
迄今，已经从3种单子叶植物和5种双子叶植物中分离了40多个抗病基因。对这些抗病基因的结构和产物的研究发现，虽然寄主植物不同，所拮抗的病原物也有真菌、细菌、病毒和线虫等差异，但抗病基因的结构和产物却有许多共同的结构特征，如C-端存在富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat，LRR)，N-端存在核苷酸结合位点(nucleotidebinding site，NBS)，亮氨酸拉链(leucine zipper，LZ)，卷曲螺旋结构域(coiled-coil，CC)，跨膜结构域(transmembrane domain，TM)，蛋白激酶(protein kinase，PK)，以及果蝇Toll蛋白及哺乳动物白介素-1受体(Toll and interleukin-1 receptor，TIR)等。根据它们所编码蛋白的结构特征，可将抗病基因分为7类(Hammond-Kosack&Jones，1997；Dangl&Jones 2001；Iyer&McCouch 2004)。
第一类，毒素还原酶类抗病基因。如玉米抗病基因Hm1，它是第1个被克隆的植物抗病基因，它负责对真菌Cochliobolus carbonum小种1的抗性。Hm1编码的解毒酶能钝化病原真菌所产生的HC毒素，而HC毒素是真菌C.carbonum小种1产生的致病因子，它决定该病菌只能感染玉米的某些基因型(Johal等，1992)。第二类，NBS-LRR类抗病基因。它们编码的蛋白近N端为NBS，而近C端则由LRR组成。如RPS2(Bent等，1994)、RPM1(Grant等，1995)、I2(Simon等，1998)；RPP5(Parker等，1997)、N(Dodd等，2001)、L6(Lawrence等，1995)、Mla1(Zhou等，2001)、Mla6(Halterman等，2001)；水稻的抗病基因如Xa1(Yoshimura等，1998)、Pib(Wang等，1999)、Pita(Bryan等，2000)等。第三类，PK类抗病基因。如番茄Pto基因，其产物是一个位于细胞内的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，没有LRR结构域(Martin等，1993)。第四类，LRR-TM类抗病基因。番茄抗叶霉病不同生理小种的基因Cf-2(Dixon等，1996)、Cf-4(Thomas等，1997)、Cf-5(Dixon等，1998)、Cf-9(Jones等，1994)，以及甜菜抗胞囊线虫的基因Hs1pro-1(Cai等，1997)等。第五类，LRR-TM-PK类抗病基因，以水稻抗白叶枯病基因Xa21(Song等，1995)为代表。第六类，以拟南芥的RPW8为代表，其编码的蛋白仅含有完整的CC和NBS结构域(Xiao等，2001)。第七类，以水稻的xa5基因为代表，其编码的蛋白为一个转录因子(TFIIAγ)(Iyer&McCouch，2004)。
编码NBS-LRR类抗病蛋白的抗病基因是植物抗病基因中最大的一类抗病基因，根据NBS-LRR类抗病蛋白N末端的结构特点，又可将该类基因分为两大类TIR-NBS-LRR(TNL)和CC-NBS-LRR(CNL)(Meyers等，Pan等，2000；Cannon等，2002；Richly等，2002)。TNL类抗病基因主要发现在双子叶植物，至今还没在单子叶植物基因组中发现(Bai等，2002；Meyers等，2002)。目前在单子叶植物中鉴定到的抗病基因主要编码CNL类抗病蛋白，双子叶植物中也存在大量的CNL类抗病基因，相对而言，单子叶植物中的CNL类抗病基因比双子叶植物中的更丰富多样(Cannon等，2002)。
研究表明，NBS、CC、TIR结构域可能参与信号传导(Hammond-Kosack & Jones 1997)，尽管这类R蛋白不具有内在的激酶活性，但NBS可以激活激酶或G蛋白，NBS具有结合ATP或GTP以及水解酶活性(Traut，1994)。TIR结构可能参与植物抗病防卫反应下游的信号传导(Jones，1994)。最近的证据表明，亚麻的L族多样性选择也发生在TIR区域，这个区域与相应的LRR区域共进化形成特异性(Luck等，2000)。LRR结构域的功能主要涉及到蛋白质-蛋白质和与配体的相互作用(Jones & Jones，1996；Kajava，1998)，据推测是抗病基因产物直接和病原菌无毒基因编码的产物或间接产物相互作用的部位(Bent，1996；Baker等，1997)。Jia等(2000)通过酵母双杂交证明AVR-Pita编码的蛋白加工为一个176氨基酸的活性蛋白AVR-Pita176小种特异性的激发子，传递到植物细胞质特异地与Pita受体的LRD区域结合，从而激活细胞内Pita介导的防卫反应。当Pita中的Ala变为Ser后Av-rPita176不能与LRD结合，因而表现感病。这一结果直接证明了LRR结构域可能就是病原菌识别的区域；Pita与AvrPita的互作第一次从分子水平验证了水稻与稻瘟病菌的“基因对基因”关系。
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由病原真菌Magnapothe grisea Barr.(无性态Pyriculariagrisea Sacc.)引起的稻瘟病是对水稻生产危害最严重的病害之一，每年都造成严重的粮食损失。从环境保护与农业的可持续发展的观点来看，抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。但是，由于稻瘟病菌群体的多样性及易变性，加之人们缺乏对抗性基因的有效利用，以及对抗性机理缺乏充分的了解，以致抗病品种的感病化问题不但没有得到解决，反而因有效抗源基因的缺乏和抗病品种的短命化而成为育种学家最为棘手的问题。因此，发掘、鉴定和克隆抗病基因并合理地应用于抗病育种计划已成为农业科研中优先解决的重要问题。
随着分子生物学的快速发展，迄今，至少有80多个水稻稻瘟病主效抗性基因已经被报道，其中60个已经被分子定位。目前，除了水稻的第3染色体上还没有被鉴定到稻瘟病主效抗性基因之外，其余的11条染色体上均被鉴定到有主效抗性基因位点，并且有的染色体上含有多个稻瘟病抗性位点，而且有些基因位点的抗性基因是成簇存在的。值得指出的是，在众多被成功定位的抗性基因中，只有抗性基因Pib和Pita两个抗性基因被成功地克隆，它们分别位于水稻的第2染色体和第12染色体上。本发明申请提出之前还没有在水稻第1染色体上克隆稻瘟病抗性基因的报道。
克隆抗病基因是对水稻抗性机理研究的前提，揭示水稻抗稻瘟病的分子机理可以更好地控制和降低稻瘟病菌对水稻的危害。同时，对克隆的抗病基因的修饰和改造，可以人为地控制和增加植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。
发明内容
本发明的目的是分离克隆水稻品种GA25中携带的一个稻瘟病抗性基因和包含调控这个基因的启动子的DNA片段。
本发明的另一个目的是提供上述稻瘟病抗性基因所编码的蛋白质。
本发明的另一个目的是提供上述含有上述抗性基因的载体。
本发明的另一个目的是提供上述载体转化的转基因植物。
本发明的另一个目的是提供上述蛋白质在制备抗稻瘟病菌药物中的应用。
本发明的进一步目的是提供上述抗性基因产生的分子标记及其在选育对稻瘟病具有抗病性的水稻中的应用。
本发明涉及分离和应用一种包含Pi15基因的DNA片段，该片段赋予植物对稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)所引起的病害产生特异性的抗病反应。这一发明适用于对所有对该病原菌敏感的植物。这些植物包括单子叶植物和双子叶植物。其中，所述片段如序列表SEQ IDNO1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO1所示序列的亚片段。该DNA序列编码一种NBS-LRR类蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所列，结构如图6所示。本发明所示的DNA片段在水稻的叶片组织呈组成型表达。
所分离、克隆的Pi15抗性基因编码NBS-LRR蛋白。这种蛋白包含两个主要的结构域NBS和LRR区域，其中NBS结构域含有保守的kinase 1aIVGPVGFGKT，位于该多肽的第198-207个氨基酸残基；kinase 2aLIIIDS位于该多肽的第275-280个氨基酸残基；kinase3aSKIIVTTH位于该多肽的第303-310个氨基酸残基；GLPLGDPLFR位于该多肽第347-352个氨基酸残基；MHDMHN位于该多态第503-505个氨基酸残基；而该蛋白的C-末端的600-858个氨基酸残基为11个LRR重复，其亮氨酸含量为17.0％，紧跟LRR重复的是一段富含Ser的序列，长度为168个氨基酸残基。
Pi15基因中编码NBS或LRR的核苷酸片段可能具有独立的功能。将Pi15基因中编码不同结构域的片段与其他核酸片段重组，可构成嵌合基因或蛋白质，使之具有新的功能。对Pi15基因进行修饰或改造，可改变或增加基因的某种功能。例如，将该基因的LRR区域替换为其他抗性基因的结构域，或将该基因的NBS结构域进行定点突变，可能会导致基因抗性的丧失或基因的抗谱的改变。
本发明同样包括将Pi15抗性基因的主要结构部分有效连接上合适的调节序列所形成的嵌合基因，以及在基因组中包含这种基因的植物和这种植物的种子。如这种基因可以是天然的或是嵌合的。例如，将包含该基因的片段和一个组成型表达的启动子连接，该启动子可以在任何条件下和细胞发育的任何时期表达。这种组成型表达的启动子包括花椰菜花叶病毒35S的启动子等。另一方面，也可以将该基因和一个组织特异性表达的启动子或发育时期特异性表达的启动子或精确环境诱导的启动子连接，这些启动子称之为诱导型启动子。这样，环境的改变，发育时期的不同都可以改变该基因的表达，同样，也可以将该基因的表达限定在某一个组织内，使由该基因诱导的抗病反应得到人为的控制。其中环境条件包含病原菌的攻击、厌氧条件和光等，组织和发育时期包括叶、果实、种子和花等。
根据本发明提供的Pi15基因序列信息(SEQ ID NO1)，本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得与Pi15等同的基因(1)通过数据库检索获得；(2)以Pi15基因片段为探针筛选水稻或其它植物的基因组文库或cDNA文库获得；(3)根据Pi15基因序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从水稻或其它植物的基因组、mRNA和cDNA中获取；(4)在Pi15基因序列的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得该基因。
本发明提供的稻瘟病抗性基因P15具有重要的应用价值。应用之一是将所述的Pi15基因序列连接到任何一种植物转化载体，用任何一种转化方法将Pi15抗病基因导入水稻或其他植物细胞，可获得表达所述基因的转基因抗病品种，从而应用于生产。本发明所述的基因构建到植物转化载体中，可以对所述基因或其调控序列适当修饰，也可以在其转录起始密码子前用其它启动子取代所述基因原有的启动子，从而拓宽和增强植物对病原菌的抗性。
本发明提供的抗性基因的另一个应用是根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记，包括但不限于SNP(单核苷酸多态)、SSR(简单序列重复多态)、RFLP(限制性内切酶长度多态)、CAP(切割扩增片段多态)。用此标记可鉴定水稻或其它植物的抗性基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种的选择效率。
本发明具有如下有益效果将克隆的抗病基因转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用转化技术在植物中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的基因组中不良基因的连锁问题，并且可以缩短育种时间。抗病基因的克隆可以克服传统育种中不能在植物种间转移抗病基因的问题。
另外，本发明能够进一步提供或应用利用上述DNA片段获得的抗病的转基因植株和相应的种子，以及用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子。可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其他的植株。
图1为水稻稻瘟病抗性基因Pi15的图位克隆示意图；图2为水稻稻瘟病抗性基因Pi15的高解析度遗传及电子物理图谱；图3为Pi15候选区域的基因预测图；图4为水稻稻瘟病抗性基因Pi15的RNAi转化体的基于潮霉素基因片段的PCR检测结果图；图5a为水稻稻瘟病抗性基因Pi15 RNAi T0转化植株的抗性鉴定图；图5b为水稻稻瘟病抗性基因Pi15 RNAi T1转化植株的表达分析图；图6为水稻稻瘟病抗性基因Pi15抗感等位基因的基因结构图；图7为水稻稻瘟病抗性基因Pi15编码的氨基酸多肽序列结构图；图8为水稻稻瘟病抗性基因Pi15及其等位基因pi15表达特性的RT-PCR检测图；图9为分子标记CRG4鉴定亲本和感病植株的Pi15位点基因型结果图；其中，图2中a表示抗性基因Pi15基因的物理图谱，标记间的数字表示两个标记之间发生的重组事件；b表示构建Pi15基因物理图的重叠群，短水平线表示IRGSP公布的粳稻品种日本晴的BAC/PAC克隆，垂直线代表标记所在克隆的相对位置。c表示抗性基因Pi5和Pi3基因的物理图谱，标记间的数字表示两个标记之间发生的重组事件；图3中带斜线的箭头表示预测的候选基因；图4中泳道1为分子量标记DL2000；泳道2-8分别为抗性基因Pi15的RNAi转化苗S1，S2，S4，S5，S6，S7，R1的潮霉素抗性基因的PCR扩增产物；泳道9为受体Q3(GA25)的非转化体；泳道10为清水对照。
图5a中GA25为抗性基因Pi15的供体品种，表现为抗病；其余的为抗性基因Pi15的RNAi转化苗。其中GA25-S1，GA25-S2，GA25-S3和GA25-S4表现为感病；GA25-S5表现为中度抗病。
图5b中第1泳道为DL2000标准分子量；第2泳道为来基因组DNA的Actin基因扩增产物；第3-9泳道为来自cDNA的Actin基因扩增产物；第10-16泳道为来自cDNA的Pi15基因扩增产物。
图6中绿色方盒表示抗性基因Pi15的外显子，带斜线的方盒分别为5’和3’非翻译区，细线表示内含子。图6a为抗性基因Pi15的基因结构图；图6b为来自品种LTH的感病等位基因pi15的基因结构图；图6c为来自品种Q61的感病等位基因pi15的基因结构图。
图7中带下划线的字母为组成推定NBS的3个区域，以及GLPL区域和MHD区域；下部分独立列出的氨基酸残基为LRR区域和富含Ser序列。
图8第1泳道为DL2000标准分子量；第2，6，10泳道为抗性基因Pi15的RT-PCR扩增产物；第2，7，11泳道为来自品种LTH的感病等位基因pi15的RT-PCR产物；第4，8，12泳道为来自品种Q61的感病等位基因pi15的RT-PCR产物；第5，8，13泳道为来自Q1063的感病等位基因pi15的RT-PCR产物；第14泳道为来自基因组DNA的对照。
图9中Q13为感病亲本；GA25为抗病亲本；R1-R7为抗病个体；S1-S15为抗病个体；箭头所指为标记CRG4。
具体实施例方式
实施例1水稻稻瘟病抗性基因Pi15的遗传分析及初步定位本发明对由粳稻抗病品种GA25和3个籼稻感病品种AS20-1、IR36和Q61的杂交组合由来的3个F2群体，分别接种对双亲品种表现分明的非亲和性/亲和性反应的菌株CHL0416和CHL0670，结果表明这3个F2群体中抗病植株与感病植株的分离比都符合3R1S，由此推断GA25所表现的对上述3个接种菌株的抗性都是由一对显性基因控制的。对这3个F2群体对应的抗性基因进行连锁分析，结果表明它们受同一显性基因控制，因此构建了从这3个F2群体由来的，共76个抗病个体和504个感病个体组成的一个大作图群体。
利用RAPD(random amplified polymorpgic DNA，RAPD)和STS(sequence tagged site)分子标记技术，结合基于分离群体分析法(bulked-sgregant analysis，BSA)的隐性群体分析法(recessive-classanalysis，RCA)，对该目的基因进行了连锁分析。结果表明，目的基因Pi15，定位于第9染色体上约0.7cM的区间，其中RAPD标记BAPi15782和BAPi15486与Pi15紧密连锁，遗传距离分别为0.35cM和1.1cM。为了快速地确定Pi15基因在参考品种日本晴上的染色体区域，我们对RAPD标记BAPi15782和BAPi15486进行了克隆和测序，并利用生物信息学分析工具BLASTN进行同源性分析发现，RAPD标记BAPi15782位于第9染色体RGP PAC克隆AP005811上，其物理位置为52485-53000，RAPD标记BAPi15486着陆于第9染色体的BAC克隆AP005879上，其物理位置为79624-79106。
实施例2覆盖Pi15位点的电子重叠群的构建由于RAPD标记BAPi15782和BAPi15486与Pi15位点紧密连锁，因此，在RAPD标记实现了染色体着陆之后，以参考品种日本晴的基因组序列作为参考，构建了覆盖Pi15位点的重叠群，它是由BAC克隆AP005879、PAC克隆AP005593、AP005811和AP005700等4个克隆所构成的(图2)。
实施例3水稻稻瘟病抗性基因Pi15的精细定位为了进一步精细定位Pi15位点，我们根据已经构建的重叠群，在目的基因区域开发了基于PCR技术的标记。利用在线软件工具ORF Finder和BLASTP对该区域序列进行搜索，得到了9个具有LRR或NBS结构的ORF。然后，将这9个ORF作为CRG，在其各自的侧翼序列设计了9对特异性引物分别进行了PCR扩增。最初采用了rTaq DNA聚合酶均无法扩增出条带。经过摸索，我们采用鸡尾酒法，将Ex Taq和Probest Taq DNA聚合酶结合起来使用，较好地解决引物与模板DNA之间不匹配的问题，使各个CRG都得到了扩增。结果表明CRG1，CRG2，CRG3，CRG4，CRG5和CRG6等6个CRG标记表现较好的特异性(仅出现目标条带)，而另外的3个CRG标记则因其特异性不好而被弃用。在6个特异性好的CRG标记中，标记CRG1在抗感亲本间表现多态性；而标记CRG2，CRG3，CRG4、CRG5和CRG6则经酶切之后也表现良好的多态性(表1)。
另一方面，在BAPi15486和CRG6之间，存在着一个SSR标记RM7364，它位于RGP PAC克隆AP005593上。因此，SSR标记RM7364，连同以上6个多态性标记CRG1，CRG2，CRG3，CRG4，CRG5和CRG6一起，用于下一步的连锁分析(图2a)。
首先，我们用SSR标记RM7364和CRG标记CRG1对504个极端感病的F2个体进行了连锁分析。结果表明，Pi15位点与标记RM7364之间出现了6个重组体，遗传距离为0.6cM；而Pi15与标记CRG1之间发生了7个重组，遗传距离为0.7cM。由于在标记RM7364位点所检测到的重组体与在标记CRG1位点所检测到的重组体是完全不同的，据此可以判断，标记RM7364和CRG1分别位于Pi15位点的两侧，其中RM7364位于Pi15位点靠近着丝粒的一侧，而CRG1则位于Pi15位点靠近端粒的一侧。所以，在RM7364和CRG1之间的13个重组体被用于下一步的连锁分析(表2)。结果表明，在着丝粒一侧，CRG6与Pi15位点之间发生了5个重组，遗传距离为0.5cM(表2)；CRG5与Pi15位点之间发生了4个重组，遗传距离为0.4cM(表2)。而在端粒一侧，CRG2与Pi15位点的重组体减少为1个，遗传距离为0.1cM(表2)。利用CRG3和CRG4继续进行染色体步移，发现它们与Pi15位点完全共分离，亦即没有重组发生(表2)。因此说明，染色体步移已经完美地到达了终点(图2)。这也就意味着，Pi15位点被界定在CRG5和CRG2之间，其间的遗传距离为0.5cM。根据染色体步移的结果，可以推断，在6个被分析的CRG中，只有CRG3和CRG4可能是Pi15的候选基因。
根据Pi15和Pi5与锚定标记G103之间的遗传距离，Pan等(2003)已经整合了含Pi15，Pii，Pi5和Pi3的抗性基因簇的遗传图谱。由于美国加州大学戴维斯分校的P.C.Ronald研究组也已经构建了Pi5/Pi3的物理图谱(Jeon，2003)。因此，有必要将之整合到本研究构建的Pi15位点的电子物理图谱。通过Paiwise BLAST分析，将与Pi5连锁的5个标记着陆于重叠群上(图2c)。该图显示，尽管Pi15和Pi5/Pi3相对于G103之间的遗传距离是不一致的，但是，它们在物理位置上却是部分重叠的(图2a)。
实施例4目的基因区域的基因预测为了最大限度地保证候选目的基因不漏网，以Pi15基因位点最近的侧翼标记(产生最少重组体的标记)所界定的区域作为目的基因区域(图3)，利用测序品种日本晴的序列作为参考序列，通过3种基因注释软件进行了候选目的基因的预测分析。
根据Gramene软件工具的注释，目的基因区域含有6个基因，为了叙述的方便，将它们分别命名为R15-a，R15-b，R15-c，R15-d，R15-L1和R15-L2等6个基因。其中，R15-L1(位于50-56kb处)，为具有NBS-LRR结构的推定抗性基因，被标记CRG5所锚定；R15-L2(位于57-66kb处)为具有LRR和蛋白激酶(protein Kinase，PK)的推定抗性基因，被标记CRG4所锚定。由于CRG3和CRG4与Pi15位点完全共分离，且具有抗性基因的保守结构，所以R15-L1和R15-L2被确定为Pi15的候选基因(图3)。
另一方面，根据RiceGAAS和Softberry软件工具的预测，目的基因区域有6个基因，其中，R15-L3(位于50-64kb处)，为编码具有NBS-LRR区域的抗性蛋白基因。由于R15-L3包括了Gramene所注释的R15-L1和R15-L2所在的区域，且被CRG3和CRG4所共同锚定。因此，R15-L3也被确定为Pi15的候选基因(图3)。
综上所述，以日本晴的序列为参考，在候选区域有3个基因被确定为Pi15的候选基因，它们是R15-L1、R15-L2和R15-L3。其中，候选基因R15-L3包括了2个候选基因R15-L1和R15-2。
实施例5候选目的基因的确认为了确认基因预测的结果，在候选基因的外显子区域设计了特异性引物来进行RT-PCR扩增分析。具体而言，将基因组DNA作为对照，以区分来自基因组DNA还是cDNA的PCR产物；选择actin为阳性内参照，以检测RNA反转录成cDNA的质量。由于候选基因R15-L3所在区域已经包括了R15-L1和R15-L2两个基因，所以我们设计了一对引物，正向引物位于R15-L1的外显子上，反向引物位于R15-L2的外显子上，对候选基因R15-L3进行了RT-PCR，并将扩增产物进行了克隆和测序。结果表明，该扩增产物为预期大小1100bp，为目的基因的序列，说明RiceGAAS和Softberry软件工具的预测结果是正确的，R15-L3为抗性基因Pi15的候选基因。
实施例6Pi15基因全长cDNA的获得以及基因结构的推导采用移步法对Pi15抗、感等位基因的DNA序列进行了测定。利用5’和3’RACE反应，获得了Pi15抗、感等位基因的全长cDNA并对其进行了测序。序列比对结果表明，抗性基因Pi15全长cDNA为3505bp，编码区为3078bp，含有5个外显子，大小分别为314bp，1151bp，1317bp，160bp和137bp，并且含有4个内含子，大小分别为976bp，198bp，454bp和862bp，5’和3’非翻译区分别为144bp和296bp(图6)。
来自LTH的感病等位基因pi15全长cDNA为3655bp，含有4个外显子，大小分别为314bp，2662bp，160bp和137bp，并且含有3个内含子，大小分别为971bp，442bp和862bp(图6)，其中，第2个外显子上存在的“TAA”导致翻译提前终止。
来自Q61的感病等位基因pi15全长cDNA为2511bp，含有5个外显子，大小分别为314bp，1147bp，510bp，243bp，320bp和137bp，并且含有5个内含子，大小分别为971bp，198bp，563bp，443bp和862bp(图6)，其中，第3个外显子上存在的“TGA”导致翻译提前终止。
由此说明，mRNA的不同剪切方式导致了感病品种中蛋白翻译的提前终止，从而导致了抗感表型的差异。
实施例7Pi15基因的过表达分析根据Pi15基因的全长cDNA序列设计1对引物(分别包括含有Kpn I和Sal I酶切位点)，对GA25的cDNA进行了扩增，获得Pi15完整的编码区，并将其克隆至双元载体pCAMBIA1300S中，然后，导入了农杆菌菌株EHA105。将高度感病品种Q1063成熟种子在诱导培养基上诱导愈伤组织。把含有目的基因转化载体的EHA105在YM琼脂培养基28℃培养1天，收集在含有100μmol/L的乙酰丁香酮的MB液体培养基。将水稻愈伤组织浸入菌液20分钟，吸干菌液后转移到MB琼脂培养基培养。转移愈伤组织至含有50mg/L潮霉素的培养基培养，每14天继代1次，继代2次。抗性筛选后，转入再生培养基分化出转化苗，分别获得了转化苗140株。抗性鉴定结果显示候选基因R15-L3在感病品种Q1063遗传背景下表现了与抗性基因供体GA25相同的抗性，表明抗性基因Pi15已经被成功地克隆了。
实施例8Pi15基因的RNAi分析将上述R15-L3的RT-PCR产物克隆至双元载体pCAMBIA1300RS中，导入了农杆菌菌株EHA105。将抗病品种GA25成熟种子在诱导培养基上诱导愈伤组织。把含有目的基因转化载体的EHA105在YM琼脂培养基28℃培养1天，收集在含有100μmol/L的乙酰丁香酮的MB液体培养基。将水稻愈伤组织浸入菌液20分钟，吸干菌液后转移到MB琼脂培养基培养。转移愈伤组织至含有50mg/L潮霉素的培养基培养，每14天继代1次，继代2次。抗性筛选后，转入再生培养基分化出转化苗，分别获得了转化苗60株。抗性鉴定结果显示转化植株丧失了抗性基因供体GA25的抗性(图5a)，也表明抗性基因Pi15已经被成功地克隆了。
对转化植株进行了潮霉素基因的PCR鉴定(图4)。检测结果证明目的基因片段已经导入这些转化体。对这些T1转化植株的表达分析发现，感病植株中Pi15基因的表达量低于抗病植株(图5b)。
实施例9Pi37抗性蛋白的结构Pi15基因编码的蛋白序列如序列表中SEQ ID NO2所示。所分离、克隆的Pi15抗性基因编码NBS-LRR蛋白。这种蛋白包含两个主要的结构域NBS和LRR区域，其中NBS结构域含有保守的kinase 1aIVGPVGFGKT，位于该多肽的第198-207个氨基酸残基；kinase 2aLIIIDS位于该多肽的第275-280个氨基酸残基kinase 3aSKIIVTTH位于该多肽的第303-310个氨基酸残基GLPLGDPLFR位于该多肽第347-352个氨基酸残基MHDMHN位于该多态第503-505个氨基酸残基；而该蛋白的C-末端的600-858个氨基酸残基为11个LRR重复，其亮氨酸含量为17.0％，紧跟LRR重复的是一段富含Ser的序列，长度为168个氨基酸残基(图7)。
实施例10Pi15基因的表达特性分析用RT-PCR对Pi15基因的表达模式进行了分析。从抗病品种GA25和感病品种LHT，Q61和Q1063的叶片中提取总RNA，利用反转录试剂盒SuperScriptTMReverse Transcriptase II进行反转录cDNA第一条链的合成。RT-PCR引物为L2RTF5’-CCAGCAGTTTAAGATCAG-3’和L2RTR5’-GGTGAAGCTGTGCTGCAATTTC-3’。PCR反应为94℃预变性4min；接下来是35个循环，循环程序如下94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min；最后72℃延伸7min，温度降到4℃即完成扩增。实验结果表明，抗性品种和感病品种的接种前后的叶片组织的RNA反转录模板均能扩增出特异的片段，说明Pi15及其等位基因pi15均能在叶片组织中表达，即属于组成型表达的基因(图8)。
实施例11Pi15基因序列在分子标记辅助选择育种中的应用利用本发明提供的Pi15基因序列信息可以产生分子标记，用于鉴定Pi15位点上具有的各种基因型即Pi15Pi15、Pi15pi15和pi15pi15的植株，可在分子标记辅助选择育种过程中加以应用(表1；图9)。
实施例12抗性基因Pi15的抗性特征抗性基因Pi15对分离自泰国、日本和中国的稻瘟病菌株的反应型，明显地与Piz，Pizt，Piz5和Pikm等主要抗病基因的不一样，因此，Pi15可以作为这些高度抗病基因的补充，广泛地应用于抗病育种计划中(表3)。
表1在靶区域开发的Pi15候选抗性基因(candidate resistatance gene，CRG)标记
aF正向引物；R反向引物；bA＝2％琼脂糖凝胶；B＝6％聚丙烯酰胺凝胶。
表2 13个目的基因侧翼的重组体在靶区域7个标记位点的基因型分析
aS基因型为感病亲本纯合型；H基因型为双亲的杂合型；bA重组体I275，I285，I356和I379；B重组体I55；C重组体I93；D重组体I182，I230，I260，I261，I410和I528；E重组体I393。
表3抗性基因Pi15对来自日本、泰国和中国的10个稻瘟病菌菌株的抗谱分析
a，Isolates selected from Japan，Thailand，and China were tested in respectivecountry in 1996，1998，and 2001.
b，R，resistant，S，susceptible.
c，NT，not tested.
水稻稻瘟病抗性基因Pi15及其应用序列表SEQUENCE LISTING<110>华南农业大学<120>水稻稻瘟病抗性基因Pi15及其应用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>3505<212>Full length cDNA<213>稻属水稻(Orysa sativa L.)<220>
<221>5’UTR<222>(1)..(143)<220>
<221>exon<222>(144)..(3221)<220>
<221>3’UTR<222>(3222)..(3505)<400>1TCGACGATTC GACTGGAGCA CGGGACACTG ACATGGACTG AAGGAGTAGA AAACCTTCTC 60TCTTCTCGTT CTCCTATTTC ACAAATCACA ACCGGATTGC TTTCTTCCTT CCTCCGGTCT 120GGTCCCCAAC CTCCGCGGCA GCC ATG GTT GGC GCC GAG ATG CTT GTG GCC GCG 173Met Val Gly Ala Glu Met Leu Val Ala Ala5 10GCG GTG AGC CAG GTC GCC CGG AAG ATC MAC GAC ATC GTG GGG GTC GCG 221Ala Val Ser Gln Val Ala Arg Lys Ile Asn Asp Ile Val Gly Vsl Ala15 20 25CAG GGC GAG GTG AAG CTG TGC TGC AAT TTC AGC GAC GAT TTG GAG GGC 269Gln Gly Glu Val Lys Leu Cys Cys Asn Phe Ser Asp Asp Leu Glu Gly30 35 40ATC AAG GAT ACC CTT GTG TAC CTG GAA ACC TTG CTG AAA AAT GCG GAG 317Ile Lys Asp Thr Leu Val Tyr Leu Glu Thr Leu Leu Lys Asn Ala Glu45 50 55AAT AAC TCC TTC GGA AGC GAC AGG GCC AAC CTG CGC CAC TGG CTT GGC 365Asn Asn Ser Phe Gly Ser Asp Arg Ala Asn Leu Arg His Trp Leu Gly60 65 70CAG ATC AAG TCC CTG GCT TAC GAT ATC GAA GAT ATC GTT GAT GGG TAC 413Gln Ile Lys Ser Leu Ala Tyr Asp Ile Glu Asp Ile Val Asp Gly Tyr75 80 85 90TAC TCT TCC AAG GAG CAG TTC GAT GGG GGC AGC TAT GCA CAG AAG GGG 461Tyr Ser Ser Lys Glu Gln Phe Asp Gly Gly Ser Tyr Ala Gln Lys Gly95 100 105TCA TTA TTC TGC TCG CTA TCC AAT CCA ATG CTT CTG AAA GGT AGC ATG 509Ser Leu Phe Cys Ser Leu Ser Asn Pro Met Leu Leu Lys Gly Ser Met110 115 120GTT TAT AAG ATG AAA TCC AAG AGA GAG ATG CTA CAG CAA AGC CAA CAG 557Val Tyr Lys Met Lys Ser Lys Arg Glu Met Leu Gln Gln Ser Gln Gln125 130 135TTG CCC AAT CAG TAT CAT TTC CTT TCA TAT ATC AAT TCA GCT GTG CAT 605Leu Pro Asn Gln Tyr His Phe Leu Ser Tyr Ile Asn Ser Ala Val His140 145 150TAT TTT GAG GAG AAG CAA ACA ACA TCA TAC AGA AAT ACT GAC ATT GCA 653
水稻稻瘟病抗性基因Pi15及其应用序列表Tyr Phe Glu Glu Lys Gln Thr Thr Ser Tyr Arg Asn Thr Asp Ile Ala155 160 165 170ATT GTC GGG AGG GAT GCT GAT TTG GAT CAT CTC ATG GAT CTT TTA ATG 701Ile Val Gly Arg Asp Ala Asp Leu Asp His Leu Met Asp Leu Leu Met175 180 185CAA AAC AGC GCT GAA GAG CTT TGT ATT ATA CCC ATA GTT GGG CCT GTA 749Gln Asn Ser Ala Glu Glu Leu Cys Ile Ile Pro Ile Val Gly Pro Val190 195 200GGT TTT GGA AAG ACA AGC CTT GCA CAG TTA GTT TTC AAT GAT ACA AGA 797Gly Phe Gly Lys Thr Ser Leu Ala Gln Leu Val Phe Asn Asp Thr Arg205 210 215ACA GAG GTA TTC AGC TTT AGG ATA TGG GTT CAT GTT TCC ATG GGT AAT 845Thr Glu Val Phe Ser Phe Arg Ile Trp Val His Val Ser Met Gly Asn220 225 230ATC AAC CTT GAA AAA ATT GGG AGA GAT ATA GTT TCA CAA ACT ACA GAA 893Ile Asn Leu Glu Lys Ile Gly Arg Asp Ile Val Ser Gln Thr Thr Glu235 240 245 250AAA ATT GAG GGA AAT ATG CAG CTG CAG TCA ATC AAG AAT GCT GTT CAG 941Lys Ile Glu Gly Asn Met Gln Leu Gln Ser Ile Lys Asn Ala Val Gln255 260 265CGT GTG CTA AAT AAA TAT AGT TGC TTG ATC ATA ATA GAC AGC CTT TGG 989Arg Val Leu Asn Lys Tyr Ser Cys Leu Ile Ile Ile Asp Ser Leu Trp270 275 280GGA AAG GAT GAA GAA GTG AAT GAA TTG AAG CAG ATG TTG CTT ACA GGT 1037Gly Lys Asp Glu Glu Val Asn Glu Leu Lys Gln Met Leu Leu Thr Gly285 290 295AGA CAC ACA GAA AGC AAG ATC ATA GTG ACC ACT CAT AGC AAT AAA GTA 1085Arg His Thr Glu Ser Lys Ile Ile Val Thr Thr His Ser Asn Lys Val300 305 310GCT AAG CTG ATT TCC ACC GTT CCA CTG TAC AAG TTG GCA GCT TTA TCT 1133Ala Lys Leu Ile Ser Thr Val Pro Leu Tyr Lys Leu Ala Ala Leu Ser315 320 325 330GAG GAT GAT TGT TTA AAA ATA TTC TCT CAA AGG GCA ATG ACA GGT CCG 1181Glu Asp Asp Cys Leu Lys Ile Phe Ser Gln Arg Ala Met Thr Gly Pro335 340 345GGT GAC CCG TTG TTC AGG GAA TAT GGA GAA GAA ATC GTT AGA AGG TGT 1229Gly Asp Pro Leu Phe Arg Glu Tyr Gly Glu Glu Ile Val Arg Arg Cys350 355 360GAA GGC ACA CCC TTG GTA GCC AAT TTT CTC GGT TCT GTG GTG AAT GCT 1277Glu Gly Thr Pro Leu Val Ala Asn Phe Leu Gly Ser Val Val Asn Ala365 370 375CAA CGA CAA AGG CGT GAG ATT TGG CAA GCT GCA AAG GAT AAA GAA ATG 1325Gln Arg Gln Arg Arg Glu Ile Trp Gln Ala Ala Lys Asp Lys Glu Met380 385 390TGG AAG ATA GAG GAA GAT TAT CCC CAA GAC AAA ACT TCA CCA CTA TTT 1373Trp Lys Ile Glu Glu Asp Tyr Pro Gln Asp Lys Thr Ser Pro Leu Phe395 400 405 410CCA TCA TTC AAG ATA ATA TAT TAT AAT ATG CCC CAT GAG CTA AGA TTA 1421Pro Ser Phe Lys Ile Ile Tyr Tyr Asn Met Pro His Glu Leu Arg Leu415 420 425TGC TTT GTA TAT TGT TCA ATC TTC CCT AAA GGA ACT GTT ATA GAA AAG 1469Cys Phe Val Tyr Cys Ser Ile Phe Pro Lys Gly Thr Val Ile Glu Lys430 435 440AAG AAA CTT ATT CAG CAA TGG ATT GCA CTT GAC ATG ATT GAG TCC AAA 1517Leu Ile Gln Gln Trp Ile Lys Lys Ala Leu Asp Met Ile Glu Ser Lys445 450 455
水稻稻瘟病抗性基因Pi15及其应用序列表CAT GGA ACC TTG CCA CTT GAT GTA ACT GCG GAG AAA TAT ATT GAT GAA 1565His Gly Thr Leu Pro Leu Asp Val Thr Ala Glu Lys Tyr Ile Asp Glu460 465 470CTT AAA GCA ATC TAT TTC CTT CAA GTT TTA GAG CGG TCT CAG AAT GAT 1613Leu Lys Ala Ile Tyr Phe Leu Gln Val Leu Glu Arg Ser Gln Asn Asp475 480 485 490GCA GAA AGA TCC AGT GCT TCT GAG GAA ATG CTT CGC ATG CAT AAC TTG 1661Ala Glu Arg Ser Ser Ala Ser Glu Glu Met Leu Arg Met His Asn Leu495 500 505GCT CAT GAT CTT GCT AGA TCG GTT GCT GGT GAA GAT ATC CTT GTT ATT 1709Ala His Asp Leu Ala Arg Ser Val Ala Gly Glu Asp Ile Leu Val Ile510 515 520TTA GAT GCC GAG AAC GAG CGC AAC GCC AGA TAT TGC GAT TAC CGT TAT 1757Leu Asp Ala Glu Asn Glu Arg Asn Ala Arg Tyr Cys Asp Tyr Arg Tyr525 530 535GCA CAG GTG TCT GCT TCT AGT TTA GAG CCA ATC GAT CGC AAG GCA TGG 1805Ala Gln Val Ser Ala Ser Ser Leu Glu Pro Ile Asp Arg Lys Ala Trp540 545 550CCT TCC AAG GCA AGG TCA CTA ATT TTC AAG AAT AGT GGT GCG GAC TTT 1853Pro Ser Lys Ala Arg Ser Leu Ile Phe Lys Asn Ser Gly Ala Asp Phe555 560 565 570GAG CGT GTC AGT GAA GTT CTT TCA GTG AAC AAA TAC CTG CGT GTT TTG 1901Glu Arg Val Ser Glu Val Leu Ser Val Asn Lys Tyr Leu Arg Val Leu575 580 585GAT CTC AGT GGA TGT TGT GTT CAA GAT ATT CCA TCT CCT ATC TTT CAG 1949Asp Leu Ser Gly Cys Cys Val Gln Asp Ile Pro Ser Pro Ile Phe Gln590 595 600CTG AAA CAA TTG AGA TAC CTC GAC GTT TCA TCT TTA TCT ATT ACA GCA 1997Leu Lys Gln Leu Arg Tyr Leu Asp Val Ser Ser Leu Ser Ile Thr Ala605 610 615CTC CCT CTG CAA ATT AGT AGC TTT CAT AAG TTA CAA ATG TTG GAT CTT 2045Leu Pro Leu Gln Ile Ser Ser Phe His Lys Leu Gln Met Leu Asp Leu620 625 630TCA GAA ACT GAA CTA ACA GAG TTG CCA CCC TTT ATA AGC AAC TTA AAA 2093Ser Glu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Pro Pro Phe Ile Ser Asn Leu Lys635 640 645 650GGA CTG AAT TAT TTG AAT CTC CAA GGT TGC CAG AAA CTT CAA CGA TTG 2141Gly Leu Asn Tyr Leu Asn Leu Gln Gly Cys Gln Lys Leu Gln Arg Leu655 660 665AAT AGC CTT CAT TTG TTG CAT GAT CTA CAT TAC CTA AAC TTG TCA TGC 2189Asn Ser Leu His Leu Leu His Asp Leu His Tyr Leu Asn Leu Ser Cys670 675 680TGC CCT GAA GTT ACT AGT TTT CCT GAA TCT ATT GAA AAT CTG ACC AAA 2237Cys Pro Glu Val Thr Ser Phe Pro Glu Ser Ile Glu Asn Leu Thr Lys685 690 695CTC CGT TTC TTG AAT CTT TCT GGA TGC TCT AAG CTT TCA ACA TTA CCT 2285Leu Arg Phe Leu Asn Leu Ser Gly Cys Ser Lys Leu Ser Thr Leu Pro700 705 710ATC AGA TTT TTG GAA TCA TTT GCT AGC CTC TGT TCT TTG GTA GAT CTT 2333Ile Arg Phe Leu Glu Ser Phe Ala Ser Leu Cys Ser Leu Val Asp Leu715 720 725 730AAC TTA AGT GGC TTT GAA TTC CAA ATG TTG CCC GAC TTT TTT GGC AAC 2381Asn Leu Ser Gly Phe Glu Phe Gln Met Leu Pro Asp Phe Phe Gly Asn735 740 745ATA TAT TCA CTT CAG TAT TTA AAT CTG TCA AAA TGT TTG AAA CTT GAG 2429Ile Tyr Ser Leu Gln Tyr Leu Asn Leu Ser Lys Cys Leu Lys Leu Glu
水稻稻瘟病抗性基因Pi15及其应用序列表750 755 760GTA TTA CCA CAA TCT TTT GGC CAA CTT GCA TAT CTG AAA AGC CTA AAT 2477Val Leu Pro Gln Ser Phe Gly Gln Leu Ala Tyr Leu Lys Ser Leu Asn765 770 775CCT TCA TAT TGT TCT GAT CTT AAA CTG CTG GAA TCC TTT GAA TGC CTT 2525Pro Ser Tyr Cys Ser Asp Leu Lys Leu Leu Glu Ser Phe Glu Cys Leu780 785 790ACC TCT CTT CGG TTT TTG AAT CTC TCG AAC TGC TCT AGG CTT GAA TAT 2573Thr Ser Leu Arg Phe Leu Asn Leu Ser Asn Cys Ser Arg Leu Glu Tyr795 800 805 810TTG CCG TCG TGC TTT GAC AAG CTT AAT AAT TTA GAG TCT CTG AAT TTA 2621Leu Pro Ser Cys Phe Asp Lys Leu Asn Asn Leu Glu Ser Leu Asn Leu815 820 825TCA CAA TGT CTT GGA CTT AAA GCA CTA CCT GAA TCA CTT CAA AAC CTT 2669Ser Gln Cys Leu Gly Leu Lys Ala Leu Pro Glu Ser Leu Gln Asn Leu830 835 840AAA AAT CTT CAG CTT GAT GTT TCT GGG TGT CAG GAT TGT ATA GTA CAA 2717Lys Asn Leu Gln Leu Asp Val Ser Gly Cys Gln Asp Cys Ile Val Gln845 850 855TCC TTT TCT CTA AGT ACC AGA AGT TCC CAG TCC TGC CAA CGG TCG GAG 2765Ser Phe Ser Leu Ser Thr Arg Ser Ser Gln Ser Cys Gln Arg Ser Glu860 865 870AAA GCT GAG CAG GTC AGA TCA AGA AAC AGT GAA ATT TCA GAG ATC ACT 2813Lys Ala Glu Gln Val Arg Ser Arg Asn Ser Glu Ile Ser Glu Ile Thr875 880 885 890TAT GAG GAA CCT GCT GAG ATT GAA CTT TTA AAG AAT AAC CCA AGT AAA 2861Tyr Glu Glu Pro Ala Glu Ile Glu Leu Leu Lys Asn Asn Pro Ser Lys895 900 905GAT TTG GCC TCC ATC TCA CAC CTA AAT GAG GAT AGA ATT GAG GAG CCT 2909Asp Leu Ala Ser Ile Ser His Leu Asn Glu Asp Arg Ile Glu Glu Pro910 915 920GAA GTT GTC ACT GAG CCA AGT GCA ACT AGA GGT ATG GTA CAA CAG ATT 2957Gln Ile Pro Gly Asn Gln Leu Ser Ser Pro Ser Ser His Leu Ser Ser925 930 935CCA GGA AAC CAG CTC TCA TCG CCT TCA TCT CAT CTT TCT TCC TTT GCA 3005Phe Ala Glu Val Val Thr Glu Pro Ser Ala Thr Arg Gly Met Val Gln940 945 950TCA AGC TCA GCG CCA TTT GCA TCC TCC TCT TCG GAC ACC TCA ACA AGT 3053Ser Ser Ser Ala Pro Phe Ala Ser Ser Ser Ser Asp Thr Ser Thr Ser955 960 965 970GAG CAT CCA GTG CCT AAT GAA GAG GCG GCA GCT TTG ACA GTT CCT CGG 3101Glu His Pro Val Pro Asn Glu Glu Ala Ala Ala Leu Thr Val Pro Arg975 980 985TCC AAC GAG AAA TGC GAC AAC ACT CCC ATG CCG GTA AAA GAT GGC CTG 3149Ser Asn Glu Lys Cys Asp Asn Thr Pro Met Pro Val Lys Asp Gly Leu990 995 1000ATA TCT GAA GAT GAT GCA CCG GTA CAT CTG CAT CAG AAG CCC CTG CAG 3197Ile Ser Glu Asp Asp Ala Pro Val His Leu His Gln Lys Pro Leu Gln1005 10101015GCG ACA GCC ATG GCA GCC ATA TGA CTGACCTGT AATCCTACAA3240Ala Thr Ala Met Ala Ala Ile ***1020 1026GAAGCCAACT GAAGATTCAT ATGTGGACTG AGTGAAATTA TGAAAGTTAT TGGAATAAAT 3300TGTTGCTCTG TATGTGAGAG CAACCTTCAG TCCGTTAGCC TGGTTCCTTT TAGTAGTGTT 3360CTACTATTGG GAGATCTTCA TCAACATTTT ACATGAAACG TAATGTAATG AACCTCTGTT 3420
水稻稻瘟病抗性基因Pi15及其应用序列表AATTGTTAAT TGTCAGAGCT CTAGTTTTTT GTGGTATAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 3480AACACTGTCA TGCCGTTACG TAGCG 3505<210>2<211>1026<212>NBS-LRR<213>稻属水稻(Orysa sativa L.)<400>2Met Val Gly Ala Glu Met Leu Val Ala Ala Ala Val Ser Gln Val Ala Arg Lys6 12 18Ile Asn Asp Ile Val Gly Val Ala Gln Gly Glu Val Lys Leu Cys Cys Asn Phe24 30 36Ser Asp Asp Leu Glu Gly Ile Lys Asp Thr Leu Val Tyr Leu Glu Thr Leu Leu42 48 54Lys Asn Ala Glu Asn Asn Ser Phe Gly Ser Asp Arg Ala Asn Leu Arg His Trp60 66 72Leu Gly Gln Ile Lys Ser Leu Ala Tyr Asp Ile Glu Asp Ile Val Asp Gly Tyr78 84 90Tyr Ser Ser Lys Glu Gln Phe Asp Gly Gly Ser Tyr Ala Gln Lys Gly Ser Leu96 102 108Phe Cys Ser Leu Ser Asn Pro Met Leu Leu Lys Gly Ser Met Val Tyr Lys Met114 120 126Lys Ser Lys Arg Glu Met Leu Gln Gln Ser Gln Gln Leu Pro Asn Gln Tyr His132 138 144Phe Leu Ser Tyr Ile Asn Ser Ala Val His Tyr Phe Glu Glu Lys Gln Thr Thr150 156 162Ser Tyr Arg Asn Thr Asp Ile Ala Ile Val Gly Arg Asp Ala Asp Leu Asp His168 174 180Leu Met Asp Leu Leu Met Gln Asn Ser Ala Glu Glu Leu Cys Ile Ile Pro Ile186 192 198Val Gly Pro Val Gly Phe Gly Lys Thr Ser Leu Ala Gln Leu Val Phe Asn Asp204 210 216Thr Arg Thr Glu Val Phe Ser Phe Arg Ile Trp Val His Val Ser Met Gly Asn222 228 234Ile Asn Leu Glu Lys Ile Gly Arg Asp Ile Val Ser Gln Thr Thr Glu Lys Ile240 246 252Glu Gly Asn Met Gln Leu Gln Ser Ile Lys Asn Ala Val Gln Arg Val Leu Asn258 264 270Lys Tyr Ser Cys Leu Ile Ile Ile Asp Ser Leu Trp Gly Lys Asp Glu Glu Val276 282 288Asn Glu Leu Lys Gln Met Leu Leu Thr Gly Arg His Thr Glu Ser Lys Ile Ile294 300 306Val Thr Thr His Ser Asn Lys Val Ala Lys Leu Ile Ser Thr Val Pro Leu Tyr312 318 324Lys Leu Ala Ala Leu Ser Glu Asp Asp Cys Leu Lys Ile Phe Ser Gln Arg Ala330 336 342Met Thr Gly Pro Gly Asp Pro Leu Phe Arg Glu Tyr Gly Glu Glu Ile Val Arg348 354 360Arg Cys Glu Gly Thr Pro Leu Val Ala Asn Phe Leu Gly Ser Val Val Asn Ala366 372 378Gln Arg Gln Arg Arg Glu Ile Trp Gln Ala Ala Lys Asp Lys Glu Met Trp Lys384 390 396Ile Glu Glu Asp Tyr Pro Gln Asp Lys Thr Ser Pro Leu Phe Pro Ser Phe Lys402 408 414Ile Ile Tyr Tyr Asn Met Pro His Glu Leu Arg Leu Cys Phe Val Tyr Cys Ser420 426 432Ile Phe Pro Lys Gly Thr Val Ile Glu Lys Lys Lys Leu Ile Gln Gln Trp Ile438 444 450Ala Leu Asp Met Ile Glu Ser Lys His Gly Thr Leu Pro Leu Asp Val Thr Ala456 462 468Glu Lys Tyr Ile Asp Glu Leu Lys Ala Ile Tyr Phe Leu Gln Val Leu Glu Arg474 480 486Ser Gln Asn Asp Ala Glu Arg Ser Ser Ala Ser Glu Glu Met Leu Arg Met His492 498 504Asn Leu Ala His Asp Leu Ala Arg Ser Val Ala Gly Glu Asp Ile Leu Val Ile510 516 522Leu Asp Ala Glu Asn Glu Arg Asn Ala Arg Tyr Cys Asp Tyr Arg Tyr Ala Gln528 534 540
水稻稻瘟病抗性基因Pil5及其应用序列表Val Ser Ala Ser Ser Leu Glu Pro Ile Asp Arg Lys Ala Trp Pro Ser Lys Ala546 552 558Arg Ser Leu Ile Phe Lys Asn Ser Gly Ala Asp Phe Glu Arg Val Ser Glu Val564 570 576Leu Ser Val Asn Lys Tyr Leu Arg Val Leu Asp Leu Ser Gly Cys Cys Val Gln582 588 594Asp Ile Pro Ser Pro Ile Phe Gln Leu Lys Gln Leu Arg Tyr Leu Asp Val Ser600 606 612Ser Leu Ser Ile Thr Ala Leu Pro Leu Gln Ile Ser Ser Phe His Lys Leu Gln618 624 630Met Leu Asp Leu Ser Glu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Pro Pro Phe Ile Ser Asn636 642 648Leu Lys Gly Leu Asn Tyr Leu Asn Leu Gln Gly Cys Gln Lys Leu Gln Arg Leu654 660 666Asn Ser Leu His Leu Leu His Asp Leu His Tyr Leu Asn Leu Ser Cys Cys Pro672 678 684Glu Val Thr Ser Phe Pro Glu Ser Ile Glu Asn Leu Thr Lys Leu Arg Phe Leu690 696 702Asn Leu Ser Gly Cys Ser Lys Leu Ser Thr Leu Pro Ile Arg Phe Leu Glu Ser708 714 720Phe Ala Ser Leu Cys Ser Leu Val Asp Leu Asn Leu Ser Gly Phe Glu Phe Gln726 732 738Met Leu Pro Asp Phe Phe Gly Asn Ile Tyr Ser Leu Gln Tyr Leu Asn Leu Ser744 750 756Lys Cys Leu Lys Leu Glu Val Leu Pro Gln Ser Phe Gly Gln Leu Ala Tyr Leu762 768 774Lys Ser Leu Asn Pro Ser Tyr Cys Ser Asp Leu Lys Leu Leu Glu Ser Phe Glu780 786 792Cys Leu Thr Ser Leu Arg Phe Leu Asn Leu Ser Asn Cys Ser Arg Leu Glu Tyr798 804 810Leu Pro Ser Cys Phe Asp Lys Leu Asn Asn Leu Glu Ser Leu Asn Leu Ser Gln816 822 828Cys Leu Gly Leu Lys Ala Leu Pro Glu Ser Leu Gln Asn Leu Lys Asn Leu Gln834 840 846Leu Asp Val Ser Gly Cys Gln Asp Cys Ile Val Gln Ser Phe Ser Leu Ser Thr852 858 864Arg Ser Ser Gln Ser Cys Gln Arg Ser Glu Lys Ala Glu Gln Val Arg Ser Arg870 876 882Asn Ser Glu Ile Ser Glu Ile Thr Tyr Glu Glu Pro Ala Glu Ile Glu Leu Leu888 894 900Lys Asn Asn Pro Ser Lys Asp Leu Ala Ser Ile Ser His Leu Asn Glu Asp Arg906 912 918Ile Glu Glu Pro Glu Val Val Thr Glu Pro Ser Ala Thr Arg Gly Met Val Gln924 930 936Gln Ile Pro Gly Asn Gln Leu Ser Ser Pro Ser Ser His Leu Ser Ser Phe Ala942 948 954Ser Ser Ser Ala Pro Phe Ala Ser Ser Ser Ser Asp Thr Ser Thr Ser Glu His960 966 972Pro Val Pro Asn Glu Glu Ala Ala Ala Leu Thr Val Pro Arg Ser Asn Glu Lys978 984 990Cys Asp Asn Thr Pro Met Pro Val Lys Asp Gly Leu Ile Ser Glu Asp Asp Ala99610021008Pro Val His Leu His Gln Lys Pro Leu Gln Ala Thr Ala Met Ala Ala Ile ***1014 1020102权利要求
1.一种水稻稻瘟病抗性基因Pi15编码的蛋白质，其特征是其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，或该序列替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征是氨基酸序列如SEQ IDNO2所示。
3.编码权利要求1所述蛋白质的水稻稻瘟病抗性基因Pi15的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的水稻稻瘟病抗性基因Pi15，其核苷酸序列如SEQ IDNO1所示。
5.一种含有权利要求3或4所述基因的载体。
6.权利要求5所述载体转化的转基因植物。
7.权利要求3或4所述基因产生的分子标记。
8.权利要求1或2所述蛋白质在制备抗稻瘟病菌药物中的应用。
9.权利要求7所述分子标记在选育对稻瘟病具有抗病性的水稻中的应用。
全文摘要
本发明公开了一个水稻稻瘟病新抗性基因Pi15的核苷酸序列及其编码的氨基酸多肽序列与应用。该基因属于nonTIR－NBS－LRR抗性基因家族的成员，为一个组成型表达的基因。本发明还涉及了用该基因转化水稻或其它植物培育抗病品种以及根据该基因序列产生的分子标记在育种中的应用。
文档编号C12N15/29GK101050232SQ200710027178
公开日2007年10月10日 申请日期2007年3月16日 优先权日2007年3月16日
发明者潘庆华, 林菲, 王玲 申请人:华南农业大学