专利名称：水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPi39及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPi39的分离、克隆与应用。
背景技术：
由稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)引起的稻瘟病是世界水稻生产上最具毁灭性的病害之一，而且该菌还能够侵染麦类、谷类等50多种禾本科植物。稻瘟病菌菌株能否在特定品种上生长是由该病原菌菌株的无毒基因的产物和寄主抗病基因产物之间的互作决定的。因此，无毒基因产物结构的分析与研究，是了解病原菌小种和寄主品种专化性互作的生化基础，对于植物病害的预防和控制也具有重要的指导意义。
稻瘟病菌与水稻的相互关系是符合“基因对基因”假说的(Flor，1947；Silue et al.，2000；Bryan et al.，2000；Orbach et al.2000)，也就是说，抗病品种的感病化是由于原来与抗病品种所持的抗病基因对应的、稻瘟病菌所具有的无毒基因向致病性方向发生了突变而导致的(Kiyosawa 1966；Joosten et al.，1994；Zeigler et al.，1994；Bryan et al.，2000；Orbach et al.2000)。因此，要想从根本上解决抗病品种的感病化问题，就必须把焦点集中在抗病基因和无毒基因上，以分子生物学手段为先导，结合植物遗传育种学、植物病理学、以及微生物学的基础理论与技术来深入研究它们各自的作用机制，以及两者之间的相互作用。毋庸置疑，这些研究一旦获得突破，将使人们深刻地了解植物与病原菌之间存在的基因对基因关系的实质，继而为稻瘟病的防治提供全新的理论与途径(de Wit，1992；Bryan et al.，2000；Orbach et al.2000)。
迄今，已克隆的5个稻瘟病菌无毒基因根据其功能可以分为两类。
第一类无毒基因编码种间特异性的激发子。这一类包括了对弯叶画眉草表现非致病特异性的PWL(pathogenicity on weeping lovegrass)基因家族。在这个基因家族中，PWL2首先通过染色体步移的方法被克隆到，该基因起着阻止稻瘟病菌株侵染弯叶画眉草(Eragrostiscurvula)的作用(Sweigard et al.，1995)。用PWL2转化对弯叶画眉草有致病性的野生型菌株，转化子失去对弯叶画眉草的致病性，却完全保留了对其它寄主的致病性。这说明PWL2尽管是一个决定寄主范围的基因，但其功能与经典定义的无毒基因是一样的。PWL2编码富含甘氨酸的亲水性蛋白，内含一个信号肽。研究还发现PWL2等位基因在遗传上不稳定，经常会产生对弯叶画眉草有致病性的自发突变体，而且PWL2位点在不同地理来源的水稻菌株中有高度的多态性，这也从基因水平上证明了稻瘟菌无毒基因的变异性。Kang等(1995)进一步研究了PWL基因家族PWL1、PWL3和PWL4的结构和功能。它们与PWL2在氨基酸水平上分别有75％、51％和57％的同源性，但是不在同一位点上。PWL1是从龙爪稷菌株上分离的，与PWL2功能同源，阻止病菌对弯叶画眉草的致病性；PWL3和PWL4在自然情况下是无功能的，但将PWL4置于PWL1或PWL2的启动子之后，就成为有功能的基因，这些结果表明了PWL是一个快速进化的基因家族。
稻瘟菌中第二类无毒基因为通常意义上的无毒基因，即编码品种特异性(专化性)的激发子。这一类基因包括AVR-Pita(以前称AVR2-YAMO)，ACE1和AVR1-CO39。AVR-Pita是与水稻抗病基因Pita特异互作的无毒基因。AVR-Pita编码一个金属蛋白酶，尽管尚无直接的生化依据，但改变该金属蛋白酶结构域中的一个氨基酸，它就不能与抗病基因Pita互作(Jia et al.，2000)。功能分析表明，AVR-Pita176直接与水稻细胞内的Pita蛋白的富亮氨酸区域(Leucine-rich-domain，LRD)结合，激发Pita调控的防卫反应，导致水稻的抗病反应(Jia et al.，2000)。这是第二个无毒基因与抗病基因编码的产物直接互作的例子，也是第一次从分子水平上证实了稻瘟病菌无毒基因和水稻抗病基因之间符合基因对基因的假说。不同于AVR-Pita，对应于抗病基因Pi33的无毒基因ACE1编码一个大分子量的聚酮化合物合成酶(Polyketidesynthase，PKS)和非核糖体多肽合成酶(non-ribosomal peptide synthase，NRPS)复合体(Berruyer et al.，2003；Bohnert at al.，2004)。利用Ace1-GFP融合蛋白研究发现，Ace1定位于附着胞的细胞质中，表明Ace1不是通过泌出胞外并被植物细胞识别。通过对Ace1的β-聚酮合成酶区域的点突变研究发现点突变导致Acelp的蛋白产物活性丧失而不再表现无毒，表明ACE1的存在是水稻抗病品种识别真菌信号的必要条件。与已报道的真菌无毒基因不同，ACE1编码的蛋白酶并不直接与水稻作用，而是Ace1的代谢产物被水稻识别(Fudal et al.，2002)。另一个无毒基因AVR1-CO39虽已被克隆，但是其功能目前尚未确定(Farman和Leong，1998)，在此不赘。
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由病原真菌Magnapothe grisea Barr.(无性态Pyriculariagrisea Sacc.)引起的稻瘟病是世界水稻生产上最具毁灭性的病害之一，每年都造成10-30％的水稻产量损失(Baker et al.，1997)。从环境保护与农业的可持续发展的观点来看，使用抗病品种是防治稻瘟病最经济有效和对环境安全的措施。但是，由于稻瘟病菌群体的多样性及易变性，使得抗病品种的抗性不稳定.以致抗病品种的感病化问题一直没有得到解决。从病原菌无毒基因着手，可望阐释稻瘟病菌与水稻的互作关系，以及病原菌的致病机理，从而，为稻瘟病抗病育种打下坚实的基础。
随着分子生物学的快速发展，目前，至少有40多个稻瘟病菌无毒基因已经被分子定位。其中，PWL1，PWL2，Avr1-CO39，Avr-Pita和ACE1已经被克隆(Bhnert et al.2004；Farman and Leong 1998；Kanget al.1995；Orbach et al.2000；Sweigard et al.1995)。
发明内容
本发明的目的是分离克隆稻瘟病菌菌株CHL42中携带的一个稻瘟病菌无毒基因AvrPi39和包含调控这个基因的启动子的DNA片段。
本发明的另一个目的是提供上述稻瘟病菌无毒基因所编码的蛋白质。
本发明的另一个目的是提供含有上述无毒基因的载体。
本发明的另一个目的是提供上述载体转化的转基因菌株。
本发明的另一个目的是提供上述基因在设计农药分子靶点中的应用。
本发明的另一个目的是提供利用上述基因培育抗病植物的方法。
本发明的进一步目的是提供上述基因在建立分子检测体系，监测植物稻瘟病发病情况中的应用。
本发明涉及分离和应用一种包含基因AvrPi39的DNA片段，该片段赋予稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)对水稻产生特异性(专化性)的非致病性反应。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO1所示序列的亚片段，结构如图5所示。该DNA序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，或该序列替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽。本发明所示的DNA片段在稻瘟病菌菌丝体中呈组成型表达。所分离、克隆的AvrPi39无毒基因编码的蛋白属于激酶类蛋白。对AvrPi39基因进行修饰或改造，可改变或增加基因的某种功能。如果改变该基因的编码区的上游调控区域，可能会导致基因无毒性的丧失或改变。
本发明同样包括将包含该基因的片段和一个组成型表达的启动子连接，该启动子可以在任何条件下和侵入植株的不同时期表达。这种组成型表达的启动子包括花椰菜花叶病毒35S的启动子等。另一方面，也可以将该基因和一个组织特异性表达的启动子或精确环境诱导的启动子连接，这些启动子称之为诱导型启动子。这样，环境的改变，侵入植株的不同时期都可以改变该基因的表达。其中环境条件包含植株的生长状况，温度，湿度等，侵入植株的不同时期包括孢子萌发、附着胞形成、侵入钉分化和侵染菌丝扩展等。
根据本发明提供的AvrPi39基因序列信息(SEQ ID NO1)，本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得与AvrPi39等同的基因(1)通过数据库检索获得；(2)以AvrPi39基因片段为探针筛选稻瘟病菌或其它病原菌的基因组文库或cDNA文库获得；(3)根据AvrPi39基因序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从稻瘟病菌或其它病原菌的基因组、mRNA和cDNA中获取；(4)在AvrPi39基因序列的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得该基因。
本发明提供的稻瘟病菌无毒基因AvrPi39具有重要的应用价值。应用之一是根据该基因的结构及其功能来设计新型农药的分子靶点。
应用之二是将所述的AvrPi39基因序列连接到任何一种转化载体，用任何一种转化方法将AvrPi39无毒基因和相应的抗病基因Pi39共价导入水稻或其他植物细胞。也就是说，将无毒基因置于病原菌侵入诱导表达的启动子，而将相应的抗病基因置于组成型表达的启动子下，一起导入寄主植物中，当寄主受到病原菌侵染时，无毒基因便被诱导表达无毒蛋白，然后无毒蛋白作为激发子，激发其特异的抗病基因表达，产生对应的受体蛋白，它们之间相互识别，导致寄主产生过敏性反应，以阻止入侵病原菌的定殖和扩展。由于这种工程植物是基于寄主抗病反应后各种防卫反应的综合表达和作用，因此，这种新型的抗性是稳定而持久的。
本发明提供的无毒基因的另一个应用是根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记，包括但不限于SNP(单核苷酸多态)、SSR(简单序列重复多态)、RFLP(限制性内切酶长度多态)、CAP(切割扩增片段多态)。用这些标记可监测田间稻瘟病菌群体的生理小种及其遗传结构的动态变化，以及该无毒基因在田间自然群体中的分布情况；有助于水稻品种的抗病性鉴定和稻瘟病菌小种的鉴定；也有助于抗病品种的合理布局和轮换，以更有效地控制稻瘟病的发生。
本发明能够进一步提供或应用利用上述DNA片段获得的无毒性的转基因菌株，以及用本发明的基因转化的菌株。也可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其他的菌株。
本发明的有益效果本发明通过对稻瘟病菌无毒基因的克隆及其功能分析，有助于揭示稻瘟病菌小种与水稻品种间特异性互作及其进化的分子机理。在实践上可以根据该基因的结构及其功能设计新型农药的分子靶点；可以将该基因和相应的抗病基因共价导入水稻等寄主植物培育持久抗病品种；有助于建立稻瘟病菌自然群体致病性变异的分子检测体系，研究稻瘟病菌无毒基因在田间自然群体中的分布情况，揭示稻瘟病菌群体中小种的组成和变异特点；也有助于水稻品种的抗病性鉴定及其合理布局和轮换，以便更有效地控制稻瘟病的发生。
图1为稻瘟病菌无毒基因AvrPi39的图位克隆示意图；图2为稻瘟病菌无毒基因AvrPi39的高解析度遗传及电子物理图谱；图3为稻瘟病菌无毒基因AvrPi39的部分转化菌株的致病性鉴定图；图4为稻瘟病菌无毒基因AvrPi39的部分转化体的选择标记潮霉素基因的PCR检测结果图；图5为稻瘟病菌无毒基因AvrPi39的基因结构示意图；图6为稻瘟病无毒基因AvrPi39表达特性的RT-PCR检测图；图7为分子标记MS1-23鉴定亲本及其后代个体的AvrPi39位点基因型结果图。
其中，图2中a为AvrPi39位点的高解析度遗传图谱。水平线表示染色体区域，上方为SSR等分子标记，括号内数字为各标记位点的重组体数，下方数字为标记间的遗传距离(cM)；b为AvrPi39位点区域的超重叠群图谱。长的水平线表示染色体区域，短的水平线表示BAC克隆，垂直线表示连锁标记的着陆位置；c为AvrPi39位点端粒区域的电子物理图谱；水平线表示基因组区域，黑色的箭头所示为3个候选无毒基因。
图3中在水稻品种Q15的叶片上进行致病性鉴定的菌株从左到右分别是无毒基因AvrPi39供体菌株CHL42，遗传转化受体菌株CHL43，转化子菌株WTL129和WTL139，以及假阳性转化子菌株WTL141。
图4中M为分子量标记DL2000；泳道1为阴性对照(ddH2O)；泳道2为载体pBHt1质粒的潮霉素抗性基因的PCR产物；泳道3为受体菌株CHL43；泳道4-12为无毒基因AvrPi39的转化子菌株，其中，泳道8-11为假阳性转化子菌株。
图5中黑色方盒表示无毒基因AvrPi39的外显子，带斜线的方盒分别为5’和3’非翻译区。
图6为无毒基因AvrPi39在其供体菌株CHL42的菌丝体、在健康的水稻上接种后0h、24h、128h的表达情况。菌株CHL42菌丝体的基因组DNA作为外参照；Tubullin基因为内参照。
图7中P1为无毒亲本CHL42；P2为有毒亲本CHL43，A为无毒的子囊孢子后代个体，V为有毒的子囊孢子后代个体；M分子量标记DL2000。
具体实施例方式
实施例1稻瘟病菌无毒基因AvrPi39的遗传分析及初步定位本发明利用图位克隆法克隆了无毒基因AvrPi39。首先，为了发掘和鉴定稻瘟病菌新无毒基因，利用由菌株CHL42(MAT1-2)andCHL43(MAT1-1)杂交得到的212个后代子囊孢子菌株接种水稻品种Q15(含有抗病基因Pi39)，结果表明，这个作图群体中非致病菌性株与致病性菌株的分离比符合1∶1。由此推断，CHL42所表现的对水稻品种Q15的非致病性是由一对显性基因控制的。
为了快速地确定无毒基因的染色体位置，利用参考菌株70-15的参考序列(reference sequence)，开发并构建了由121个微卫星标记(SSR，simple sequence repeat)组成的遗传图谱。然后，通过混合群体分离分析法(bulked-segregant analysis，BSA)，筛选了全部121个SSR标记，得到了6个与无毒基因连锁的位于第1染色体上的SSR标记，进一步用212个后代菌株进行了连锁分析。结果表明，该无毒基因位点被定位在第1染色体的标记MS1-15和端粒2之间的区域(图2)。
实施例2稻瘟病菌无毒基因AvrPi39的精细定位及电子物理作图为了进一步缩小AvrPi39基因所在区域的范围，并增加标记密度，在上述区域内新开发了10个SSR标记，其中4个SSR标记被检测到在2个亲本之间具有多态性，进一步用212个后代菌株进行了连锁分析。结果表明，该无毒基因位点与标记MS1-23共分离。
为了更精细地确定无毒基因AvrPi39的位置，我们利用参考菌株70-15的序列开发了4个候选无毒基因标记(candidate avirulencegene，CAG)，结果表明其中具有多态性的2个CAG标记与目的基因共分离。然后，我们利用参考菌株70-15的细菌人工染色体(bacterialartificial chromosome，BAC)，通过生物信息学分析(bioinformaticsanalysis，BIA)，构建了该位点的电子物理图谱。结果表明，AvrPi39位点被物理定位在标记CAG1-1和端粒重复序列(TTAGGG)n之间11.2kb的区域内(图2)。
实施例3稻瘟病菌无毒基因AvrPi39候选基因的预测注释及序列分析为了确定AvrPi39的候选基因，我们利用菌株70-15的参考序列，通过基因预测软件Softberry的FGENESH(http://www.softberry.com)对目的基因区域进行了基因预测及注释分析，初步确定了AvrPi39的候选无毒基因为AvrPi39-L1，AvrPi39-L2和AvrPi39-L3。因此，通过以下的基因功能互补实验确认其功能。
实施例4稻瘟病菌候选无毒基因AvrPi39的转化与转化菌株的致病性鉴定利用PCR技术分别扩增了3个候选基因约1.1kb，2.6kb和4.1kb的片段并将其克隆至双元载体转化体系pBHt1中，然后导入了农杆菌菌株AGL1中。把含有目的基因转化载体的AGL1在基本培养基(minimal medium，MM)中28℃培养2天；收集细菌细胞并用诱导培养基(induction medium，IM)洗两次，然后这些菌体用含200μM乙酰丁香酮(AS)的诱导培养基(IM+AS)重新悬浮，28℃下培养6h；将上述悬浮液与等体积的稻瘟病菌的分生孢子悬浮液(1×106个孢子/ml)混合。取200μl的混合液涂在加入AS(200μM)的共培养基(co-cultivation medium，CM)的硝酸纤维素滤膜上，25℃下共培养48h；用MM液体培养基来收集硝酸纤维素滤膜上的真菌和细菌细胞，然后取200μl收集到的共培养菌液涂布于含有潮霉素B(250μg/ml)，头孢噻肟钠(200μg/ml)和羧苄青霉素(250μg/ml)的筛选培养基(screening medium，SM)上，25℃下培养7-10d；将单菌落再次转入筛选培养基进行二次筛选；25℃下生长3-4周后，将存活下来的菌落转入PDA试管斜面培养基中。待菌丝长满斜面，将灭菌的稻秆放置于菌盖上；2周后取出稻秆，擦掉稻秆上的菌丝；36h后，挑取稻杆上的单个分生孢子即为转化子菌株。
对20个AvrPi39-L1转化菌株，30个AvrPi39-L2转化菌株和50个AvrPi39-L3转化菌株进行了致病性鉴定。结果表明，有20个AvrPi39-L3转化菌株在毒性菌株CHL43的遗传背景下，表现了与无毒基因供体菌株CHL42相同的无毒性(图3)。由此说明，候选基因AvrPi39-L3就是无毒基因AvrPi39。
对实现了功能互补的转化菌株进行了潮霉素基因的PCR鉴定，结果表明目的基因片段已经导入这些转化体(部分个体见图4)。由此说明转化菌株的无毒性是由无毒基因AvrPi39的表达而产生的。以上结果说明，无毒基因AvrPi39已经被成功地克隆了。
实施例5AvrPi39基因的结构利用5’和3’RACE反应，获得了AvrPi39的全长cDNA并对其进行了测序。序列表中的SEQ ID NO1是AvrPi39的DNA序列。AvrPi39基因DNA长度为4107bp，其全长cDNA为944bp，含有一个828bp的开放读码框，5’和3’非翻译区分别为55bp和61bp。通过比较基因组DNA和cDNA，发现该基因的开放读码框只有1个外显子(图5)。
实施例6AvrPi39无毒蛋白的结构AvrPi39基因编码的蛋白序列如序列表中SEQ ID NO2所示。无毒基因AvrPi39编码1个由275个氨基酸残基组成的蛋白多肽。数据库比较发现该无毒基因属于激酶类蛋白。
实施例7AvrPi39基因的表达特性分析利用RT-PCR技术对AvrPi39基因的表达模式进行了分析。从无毒菌株CHL42的菌丝体和用无毒菌株CHL42接种不同时段的水稻叶片中提取总RNA，利用反转录试剂盒SuperScriptTMReverseTranscriptase III进行反转录cDNA第一条链的合成。RT-PCR引物为For5’CCCTCGGCAACCATCCACACATTAC3’；Rev5’TGGCGTACGGTTTTTCCCATTCGGT 3’；PCR反应为94℃预变性4min；接下来是35个循环，循环程序如下94℃变性30sec，65℃退火45sec，72℃延伸1min；最后72℃延伸7min，温度降到4℃即完成扩增。实验结果表明，以无毒菌株CHL42的菌丝体和用该菌株接种后24h、120h的叶片组织的RNA反转录出的模板均能扩增出特异的目标片段，说明AvrPi39是组成型表达的基因(图6)。
实施例8AvrPi39基因的应用利用本发明提供的AvrPi39基因的序列信息，根据该基因的结构及其功能设计新型农药的分子靶点；将该基因和相应的抗病基因共价导入水稻等寄主植物培育抗病品种；根据该基因序列产生的分子标记在田间稻瘟病菌群体监测中的应用(图7)；以及根据监测的结果指导抗病品种合理布局中的应用。
水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPi39及其应用序列表SEQUENCE LISTING<110>华南农业大学<120>水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPi39及其应用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>944<212>DNA<213>稻梨孢属稻瘟病菌(Magnaporthe grisea Barr.(无性态Pyricularia grisea Sacc.))<220>
<221>5’UTR<222>(1)..(55)<220>
<221>CDS<222>(56)..(883)<220>
<221>exon<222>(56)..(883)<220>
<221>gene<222>(56)..(883)<220>
<221>3’UTR<222>(884)..(944)<400>1ttttttatcc ctctacaacc ctgaagtctc aaaaaaaaaa atcacgacca acgaa atg cca 61Met Pro1ctg tca acg acg gcg caa ctg gtc cgc agt cgc gtc gaa acc atc aca cac acc 115Leu Ser Thr Thr Ala Gln Leu Val Arg Ser Arg Val Glu Thr Ile Thr His Thr5 10 15 20tgc cat tca atc gtc tat ttt tat aaa aca gaa cca acc acc gta tgg aaa tca 169Cys His Ser Ile Val Tyr Phe Tyr Lys Thr Glu Pro Thr Thr Val Trp Lys Ser25 30 35gac tct ata tgg att gac ggc gaa cag tac gga aaa ctc aca aca gca gaa aat 223Asp Ser Ile Trp Ile Asp Gly Glu Gln Tyr Gly Lys Leu Thr Thr Ala Glu Asn40 45 50 51acc agt gcg gac ctt tcc cgt gaa cat acc att tat caa gcc ctc ggc aac cat 277Thr Ser Ala Asp Leu Ser Arg Glu His Thr Ile Tyr Gln Ala Leu Gly Asn His55 60 65cca cac att aca caa tgt ttc ggt ctt gaa aaa gac aaa acg ggc gac gct att 331Pro His Ile Thr Gln Cys Phe Gly Leu Glu Lys Asp Lys Thr Gly Asp Ala Ile70 75 80 85gcg ctt cgt atc gaa cgc gcg aag tgt gac ctg cgg ggc ttc atc gaa gca agc 385Ala Leu Arg Ile Glu Arg Ala Lys Cys Asp Leu Arg Gly Phe Ile Glu Ala Ser90 95 100 105ata cga cca tcc acc aag caa cgc cta gct atg gca tct gct ctg gtc gag ggc 439Ile Arg Pro Ser Thr Lys Gln Arg Leu Ala Met Ala Ser Ala Leu Val Glu Gly110 115 120gtc cag tat ctt cac tcc tgc aag gtc ttt tgg ggc gat ctc tcc acc cga aac 493Val Gln Tyr Leu His Ser Cys Lys Val Phe Trp Gly Asp Leu Ser Thr Arg Asn125 130 135 140acc ctt gtt ttt gac aaa atg aac ctc aag ctt tgc gac ttt gcg agt gct gca 547Thr Leu Val Phe Asp Lys Met Asn Leu Lys Leu Cys Asp Phe Ala Ser Ala Ala145 150 155ctt gaa ggc gta tac cca gaa ttt ggg cat tat acg tat gaa gtg cgt tat tgg 601Leu Glu Gly Val Tyr Pro Glu Phe Gly His Tyr Thr Tyr Glu Val Arg Tyr Trp160 165 170 175ccg gct ttg ccc cag gac gat att gag caa cta agt atg tac caa aaa gaa ttg 655Pro Ala Leu Pro Gln Asp Asp Ile Glu Gln Leu Ser Met Tyr Gln Lys Glu Leu180 185 190 195
水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPi39及其应用序列表ttc gct tta ggc tcg gcg ata tat gaa att acc gaa tgg gaa aaa ccg tac gcc 709Phe Ala Leu Gly Ser Ala Ile Tyr Glu Ile Thr Glu Trp Glu Lys Pro Tyr Ala200 210 215aag gtc gac gat aat gac atc gat caa gtt ctc cat agt ggc cag agg ccc acg 763Lys Val Asp Asp Asn Asp Ile Asp Gln Val Leu His Ser Gly Gln Arg Pro Thr220 225 230 235att tcg gac tgg aat tgt gca cgg gat att att atg cgt tgc tgg gat ttt gag 817Ile Ser Asp Trp Asn Cys Ala Arg Asp Ile Ile Met Arg Cys Trp Asp Phe Glu240 245 250tat agt tca gta cgt att gtc gca gaa gat ctg gct tcg ctt ctc aaa gat tta 871Tyr Ser Ser Val Arg Ile Val Ala Glu Asp Leu Ala Ser Leu Leu Lys Asp Leu255 260 265 270agg act ata taa tattcaggtt taacatgaa tgaacgtttt caccccgatt caccattgat 933Arg Thr Ile275acattctgca g 944<210>2<211>57<212>PRT<213>稻梨孢属稻瘟病菌(Magnaporthe grisea Barr.(无性态Pyricularia grisea Sacc.))<400>2Met Pro Leu Ser Thr Thr Ala Gln Leu Val Arg Ser Arg Val Glu Thr Ile Thr His Thr1 5 10 15 20Cys His Ser Ile Val Tyr Phe Tyr Lys Thr Glu Pro Thr Thr Val Trp Lys Ser25 30 35Asp Ser Ile Trp Ile Asp Gly Glu Gln Tyr Gly Lys Leu Thr Thr Ala Glu Asn40 45 50 51Thr Ser Ala Asp Leu Ser Arg Glu His Thr Ile Tyr Gln Ala Leu Gly Asn His55 60 65Pro His Ile Thr Gln Cys Phe Gly Leu Glu Lys Asp Lys Thr Gly Asp Ala Ile70 75 80 85Ala Leu Arg Ile Glu Arg Ala Lys Cys Asp Leu Arg Gly Phe Ile Glu Ala Ser90 95 100 105Ile Arg Pro Ser Thr Lys Gln Arg Leu Ala Met Ala Ser Ala Leu Val Glu Gly110 115 120Val Gln Tyr Leu His Ser Cys Lys Val Phe Trp Gly Asp Leu Ser Thr Arg Asn125 130 135 140Thr Leu Val Phe Asp Lys Met Asn Leu Lys Leu Cys Asp Phe Ala Ser Ala Ala145 150 155Leu Glu Gly Val Tyr Pro Glu Phe Gly His Tyr Thr Tyr Glu Val Arg Tyr Trp160 165 170 175Pro Ala Leu Pro Gln Asp Asp Ile Glu Gln Leu Ser Met Tyr Gln Lys Glu Leu180 185 190 195Phe Ala Leu Gly Ser Ala Ile Tyr Glu Ile Thr Glu Trp Glu Lys Pro Tyr Ala200 210 215Lys Val Asp Asp Asn Asp Ile Asp Gln Val Leu His Ser Gly Gln Arg Pro Thr220 225 230 235Ile Ser Asp Trp Asn Cys Ala Arg Asp Ile Ile Met Arg Cys Trp Asp Phe Glu240 245 250Tyr Ser Ser Val Arg Ile Val Ala Glu Asp Leu Ala Ser Leu Leu Lys Asp Leu255 260 265 270Arg Thr Ile27权利要求
1.水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPi39编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，或该序列替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
3.编码权利要求1所述蛋白质的水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPi39的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPi39，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
5.含有权利要求3或4所述基因的载体。
6.权利要求3或4所述基因在设计农药分子靶点中的应用。
7.权利要求5所述载体转化的转基因植物。
8.利用权利要求3或4所述基因培育抗病植物的方法。
9.权利要求3或4所述基因在建立分子检测体系，监测植物稻瘟病发病情况中的应用。
全文摘要
本发明公开了水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPi39及其应用。本发明提供了一个稻瘟病菌(Magnaporthe gtisea)新无毒基因AvrPi39的核苷酸序列及其编码的氨基酸多肽序列，该基因是一个组成型表达的基因。本发明还涉及了根据该基因的结构及其功能设计新型农药的分子靶点；将该基因和相应的抗病基因共价导入水稻等寄主植物培育抗病品种；根据该基因序列产生的分子标记在田间稻瘟病菌群体监测中的应用；以及根据监测的结果指导抗病品种合理布局中的应用。
文档编号C12Q1/68GK101050233SQ200710027180
公开日2007年10月10日 申请日期2007年3月16日 优先权日2007年3月16日
发明者潘庆华, 冯淑杰, 马俊红, 王涛, 林菲, 王玲 申请人:华南农业大学