水稻抗病相关基因OsDR8的制作方法

专利名称：水稻抗病相关基因OsDR8的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域。具体涉及一个水稻抗病相关基因OsDR8的分离克隆和功能验证。OsDR8基因的功能与水稻抵抗病害的能力显著相关。
背景技术：
植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病毒、细菌、真菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果(1)病原体成功的在寄主植物内繁殖，引起相关的病症；(2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基因资源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。
植物的抗病反应是多基因参于调控的复杂过程。参于植物抗病反应的基因分为两类(1)抗病基因，又称R(resistance)基因和(2)抗病相关基因。
根据目前人们对抗病基因功能的认识，这类基因的产物主要是作为受体，直接或间接与病原蛋白相互作用，启动植物体内的抗病信号传导路径(Tang等，1996，Science 2742060-2063；Baker等，1997，Science 276726-733；Jia等，2000，EMBO J.194004-4014；Dangl和Jones，2001，Nature 411826-833；Nimchuk等，2001，Curr.Opin.Plant Biol.4288-294)。抗病基因介导的抗病反应抗性强，是很好的基因资源。但由于下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制(1)抗病基因的资源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害白叶枯病的抗病基因少于30个，抵抗另一水稻重要病害—稻瘟病的抗病基因也只有大约40个；(2)抗病基因具有病原种类和病原生理小种特异性，抗病范围有限；(3)因为病原的快速突变，一个抗病基因的作用往往几年或者十几年后就丧失了。
抗病相关基因是指除抗病基因外所有参于抗病反应的基因，它们的编码产物参于合成植物体内抗病信号分子、参于信号传导或参于防卫反应等。这类基因的共同特点是病原诱导后它们的表达量升高或减少，因此人们可以根据病原诱导前后基因的表达量的差异大规模地鉴定植物抗病相关基因(Maleck等，2000，Nature Genet.26403-410；Schenk等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9711655-11660；Zhou等，2002，Science in China 45449-467)。目前，人们对抗病相关基因的认识有限。根据已有报道，绝大多数抗病相关基因单独作用时的抗性能力可能比抗病基因小。但根据下述原因，它们是值得大力开发的基因资源(1)由于绝大多数抗病相关基因的产物不需要直接与病原物相互作用，这类基因是具有持久抗性的基因资源；(2)大多数抗病相关基因参于的抗病反应没有病原特异性，因此它们是具有广谱抗性的基因资源；(3)这类基因的资源丰富。
植物的抗病反应可以分为两大类。长期以来研究者们对这两大类抗病反应给予了不同名称，如垂直抗性和水平抗性(Van Der Plank等，1968，Disease Resistance in Plants，Academic，New Youk)、质量抗性和数量抗性(Ou等，1975，Phytopathology 651315-1316)、完全抗性和部分抗性(Parlevliet，1979，Annu.Rev.Phytopathol.1203-222)。质量抗性(或垂直抗性或完全抗性)是抗病基因介导的抗病反应。数量抗性(或水平抗性或部分抗性)是由数量性状位点(quantitative trait locus，QTL)调控的抗病反应，它被认为无病原特异性，而且抗性持久(Roumen，1994，Rice Blast Disease，Zeigler等编著，CAB International，Cambridge，UK，pp.245-265)。目前，人们对植物抗病QTL的基因本质还不清楚。因此，虽然水稻中已经鉴定出了大量抗病QTL，如抗白叶枯病QTL(Li等，1999，Mol.Gen.Genet.26158-63)、抗稻瘟病QTL(Wang等，1994，Genetics 1361421-1434；Chen等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1002544-2549)、抗纹枯病QTL(Li等，1995，Theor.Appl.Genet.91382-388)和抗病毒病QTL(Albar等，1998，Theor.Appl.Genet.971145-1154)等，但这些抗性QTL没有被很好地用于水稻品种抗病性的改良。
近年研究发现很多抗病相关基因的染色体位置与抗病QTL相对应，提示这些抗病相关基因可能就是相对应的QTL。抗病相关基因的染色体位置与抗病QTL相对应这一现象在多种植物中都被观察到，包括水稻(Xiong等，2002，中国科学45518-526；Ramalingam等，2003，Mol.Plant-Microbe Interact.1614-24；Wen等，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339；Chu等，2004，Mol.Gen.Genomics 271111-120)、小麦(Faris等，1999，Theor.Appl.Genet.98219-225)、豆类(Geffroy等，2000，Mol.Plant-Microbe Interact.13287-296)和马铃薯(Trognitz等，2002，Mol.Plant-Microbe Interact.15587-597)。这些结果为采用候选基因策略分离、克隆和利用抗病QTL的基因提供了依据。
水稻是世界上重要的粮食作物，但病害的影响常常造成其产量和品质的下降。因此，了解病害的发病机制，有助于利用高效途径改良水稻品种的抗性，控制病害的发生，减少或避免植物病害所带来的损失。
分离克隆抗病相关基因是对水稻抗病机理研究的前提。同时，与抗病基因的应用相比，抗病相关基因的应用能提供植物更为广谱及长效的抗性。通过超量表达抗病相关基因进行水稻品种的改良，将进一步增强植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。

发明内容
本发明的目的是分离克隆水稻中携带的一个抗病相关基因完整DNA片段，并利用RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)通过使目标基因沉默鉴定该基因在抗病反应过程中所起作用，为利用这个基因改良水稻品种或其它植物抵御病害的能力奠定基础。
本发明涉及分离一种包含OsDR8(Oryza sativa defense responsive 8)基因的DNA片段并鉴定其功能，该片段赋予植物对由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和稻瘟病菌(Pyricularia grisea)所引起的病害产生抗病反应。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO1所示序列的亚片段。对其序列进行分析表明它与玉米的维生素B1的生物合成酶基因thil同源。
可以采用已经克隆的OsDR8基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsDR8基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsDR8基因的序列，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞，产生转基因植物。
将克隆的抗病相关基因转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用遗传转化技术在植株中累加多个抗性基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的连锁基因组序列。抗病相关基因的克隆是克服传统育种不能在植物种间转移抗病相关基因问题的前提。
在本发明的实施例部分，我们阐述了OsDR8基因的分离和功能验证过程以及该基因的特点，分离的OsDR8基因能够和适当的载体连接，转入植物体中，为使植物体获得或增强抗病的能力提供一条可能的途径。
序列表、附图及其说明序列表SEQ ID No1.OsDR8基因的序列和它编码的蛋白质的氨基酸序列。


图1.本发明鉴定和分离克隆水稻抗病相关基因OsDR8以及验证OsDR8基因功能的流程图。
图2.是cDNA芯片中每一个方格内cDNA克隆的排列规则图。cDNA芯片的每张尼龙膜上有384个方格，每个方格有8个位点。图中示方格中cDNA克隆的排列方式，每个克隆占据两个位点。A、B、C和D分别代表不同cDNA克隆。
图3.利用cDNA芯片检测接种病原菌前后差异表达的cDNA克隆。a、c、e用接种病原菌5天后的叶片组织制作的探针与芯片杂交；b、d、f用接水(对照)的叶片组织制作的探针与芯片杂交。方框表示cDNA芯片上一个方格，每个方格中有8个位点(图2)。箭头表示在上下对比的图像中差异表达的cDNA克隆。图a、c和e中所示3个cDNA克隆在接种病原菌5天后表达量明显增加。
图4.OsDR8基因位于水稻7号染色体，其染色体位置与已知抗稻瘟病QTL(Wang等，1994，Genetics 1361421-1434)相对应。
图5.采用RT-PCR技术分析OsDR8基因在抗稻瘟病水稻材料(C101LAC、C101A51和明恢63(Minghui63))、感稻瘟病水稻材料(CO39和珍汕97(Zhenshan 97))、抗白叶枯病水稻材料(IRBB4、IRBB13和明恢63)、感白叶枯病水稻材料(IR24和珍汕97)接种稻瘟病菌(IK81-3和V86013)、白叶枯病菌(PXO61、PXO99和JL691)或接水(control，对照)后的表达特征。1、2、3、4、5、6、7和8分别代表接种或接水后2小时、4小时、8小时、16小时、1天、3天、5天和7天。用不受病原诱导的水稻肌动蛋白(actin)基因的表达量作为衡量样品量的标准。
图6.水稻品种明恢63中覆盖OsDR8基因区段的亚克隆的重叠图。图中长线条代表从水稻品种明恢63 BAC克隆5F21中获得的包含OsDR8基因的DNA片段，以及这条片段中的限制性内切酶消化位点的位置。箭头的位置及长度表示对限制性内切酶亚克隆测序的长度及序列位置，箭头方向表示对亚克隆进行测序的方向。将亚克隆测序序列拼接得到一长1980bp的序列。
图7.采用GENSCAN(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)基因结构预测软件、参照拟南芥作为分析模板分析从水稻品种明恢63中获得的1980bp、包含OsDR8基因的序列。分析结果显示该序列包含OsDR8基因完整的编码序列。图中Gn代表基因编号；Ex代表外显子；Init代表基因起始端外显子；Term代表基因终止端外显子；PlyA代表PolyA；S代表DNA链，其中“+”表示分析过程中输入的DNA序列链；Begin代表外显子、启动子或PolyA在输入DNA序列中的起始位置；End代表外显子、启动子或PolyA在输入DNA序列中的终止位置；Len代表外显子、启动子或PolyA的序列长度(bp)；Fr代表翻译阅读框(每条DNA序列有3个翻译阅读框)；I/Ac代表3’剪切位点分值；Do/T代表5’剪切位点分值；CodRg代表翻译区分值；P代表外显子概率；Tscr代表外显子分值。
图8.OsDR8基因的结构及用于超量表达遗传转化载体构建的DNA片段长度和结构。线条表示内含子；柱条表示外显子，其中黑色部分代表编码序列，白色部分代表5’和3’非编码区(UTR)；数字表示各个结构的碱基数。“ATG”和“TGA”分别是翻译起始密码和终止密码；“gt”和“ag”是内含子剪切位点。长箭头代表遗传转化片段的长度和相对应基因结构的位置。短箭头代表进行基因结构分析中所用5’RACE和RT-PCR引物位置。
图9.用定量RT-PCR技术检测OsDR8基因在对照材料(明恢63)和T0代遗传转化植株(D16RMH)中的表达量。D16RMH-24和D16RMH-30是阴性转化植株，其它植株是阳性转化植株。纵坐标代表OsDR8基因在每份水稻材料中的相对表达量(对照材料的表达量定为1)(三次实验的平均值)。
图10.点接种的稻瘟病菌V86013在T0代遗传转化植株(D16RMH)上更容易生长繁殖，形成明显大、褐色点。箭头示部分转化植株的叶片上已形成病斑。明恢63为遗传转化受体材料(对照)，牡丹江8是感病品种(对照)。每一叶片接种四个点，每一点接种菌液10微升。接种后4天照片。
具体实施例方式
以下实施例中进一步定义本发明，图1描叙了鉴定和分离克隆OsDR8基因以及验证OsDR8基因功能的流程。根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例一构建病原诱导的水稻cDNA文库，制作水稻cDNA芯片采用抗病水稻品种明恢63(Oryza sativa ssp.indica)构建的水稻全生育期平衡化cDNA文库(储昭晖等，水稻全生育期均一化cDNA文库的构建和鉴定，2002，科学通报471656-1662)制作cDNA芯片。该文库由水稻不同生长时期和不同生理状态下的15种组织的cDNA组成，包括白叶枯病菌和稻瘟病菌接种诱导后的组织。该文库包含大约62,000个克隆，平均插入片段为1.4kb。随机取该文库中的21504个cDNA克隆，抽提质粒制作cDNA芯片(cDNA array)(Zhou等，The defense-responsive genes showing enhance and repressed expression after pathogeninfection in rice(Oryza sativa L.)，2002，Sci.in China 45449-467)。为了保证杂交结果的可靠性，在cDNA芯片上每个cDNA克隆有两个位点，它们位于同一方格的对称位置(图2)。
实施例二利用cDNA芯片技术鉴定水稻中的抗病相关基因用携带抗白叶枯病基因或抗稻瘟病基因的四个水稻材料分别接种与它们呈非亲和性反应的病原菌(表1)，将病原接种前和接种后1天和5天的水稻叶片总RNA分别反转录成cDNA并标记放射性同位素作探针，并分别与cDNA芯片杂交，通过分析不同探针杂交的同一cDNA位点的杂交信号的变化，鉴定出一批病原接种前后差异表达的cDNA克隆，它们代表不同的抗病相关基因(图3)(参见Zhou等，The defense-responsive genes showing enhance andrepressed expression after pathogen infection in rice(Oryza sativa L.)，2002，Sci.in China45449-467)。
表1.用于cDNA芯片分析的抗病水稻材料和病原菌组合

其中编号为EI35I3的cDNA克隆在水稻品种明恢63接种稻瘟病菌株V86013后表达量增加了3.2倍。鉴于EI35I3克隆在病原菌接种前后表达量有明显差异，我们认为cDNA克隆EI35I3所代表的基因参与了植物的抗病反应，是一个抗病相关基因，并将其命名为OsDR8。
实施例三在分子标记遗传连锁图上定位OsDR8基因用一个三交分离群体(Wang等，1998，Theor.Appl.Genet.97407-412)对鉴定出的抗病相关的cDNA克隆EI35I3进行染色体定位分析。发现OsDR8基因位于水稻7号染色体，其染色体位置与已知的抗稻瘟病QTL(Wang等，1994，Genetics 1361421-1434))相对应(图4)，提示OsDR8可能就是相对应的抗病QTL的基因(Wen等，Three types of defense-responsivegenes are involved in resistance to bacterial blight and fungal blast diseases in rice，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339)。
实施例四OsDR8基因在不同水稻抗病品种中的表达模式分析为了进一步验证分析OsDR8是一个经病原物诱导表达量上升的基因，本发明首先对cDNA克隆EI35I3进行测序获得一条长1159bp的cDNA序列(位于序列表SEQ ID NO1所示序列的581至1817bp处)。然后根据cDNA序列设计PCR引物，采用RT-PCR(reverse transcriptase-PCR)技术、利用12种水稻材料—病原菌组合分析OsDR8基因的表达模式(表2)(Wen等，Three typesof defense-responsive genes are involved in resistance to bacterial blight and fungal blast diseasesin rice，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339)。被分析的水稻材料中，C101A51、C101LAC和CO39是抗稻瘟病近等基因系，IRBB4、IRBB13和IR24是抗白叶枯病近等基因系。在RT-PCR分析中，OsDR8基因特异性PCR引物35I3F(5’-TCCAGCCTCCTCAAGACCT-3’)和35I3R(5’-AGTCCTCCTGCTTCGTCGTA-3’)是根据该基因的cDNA片段克隆EI35I3的序列设计的；另外，用水稻肌动蛋白(actin)的PCR引物actinF(5’-TATGGTCAAGGCTGGGTTCG-3’)和actinR(5’-CCATGCTCGATGGGGTACTT-3’)的扩增产物作为样品RNA量的标准。RT-PCR以两步法进行(Zhou等，2002，Science in China 45449-467)。首先，将用于反转录的总RNA用无RNA酶活性的DNA酶I处理，去除总RNA中可能污染的DNA；将总RNA在65℃处理10分钟，灭活DNA酶I；将RNA在72℃变性5分钟，然后加入Oligo-dT15、dNTP、反转录酶等，在42℃反转录90分钟。第二步，取1微升反转录产物作PCR扩增。
表2.用于RT-PCR分析的水稻材料和病原菌组合


从RT-PCR分析结果(图5)可知接种稻瘟病菌或白叶枯病菌后，OsDR8基因在所有抗病水稻材料中的表达量都增加了，即病原菌可诱导增强OsDR8基因表达。这一诱导最早发生在病原侵染后16小时(图5)。而OsDR8基因的表达在感病水稻材料接种病原菌后和所有水稻材料接水(对照)后无变化。这些结果进一步证实OsDR8是一个抗病相关基因，它不仅参于水稻抗白叶枯病反应的调控，也参于抗稻瘟病反应的调控。
实施例五分离克隆OsDR8基因和基因结构分析1.与OsDR8基因同源基因结构的预测以OsDR8基因的cDNA片段克隆EI35I3的序列作模板，用BLAST分析方法(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)检索核苷酸数据库，发现数据库中来自水稻品种日本晴的一条位于水稻7号染色体、长144741bp序列(核苷酸数据库GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)注册号AP004674)的一段序列(第23781至25016bp处)与EI35I3的同源性达到94％(E值＝0)，提示AP004674中包含与OsDR8同源的基因，即OsDR8的等位基因。
利用GENSCAN(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)、GeneFinder(http//genomic.sanger.ac.uk/gf/gf.shtml)、Gene Feature Searches(http//dot.imgen.bem.tmc.edu9331/)、GeneMark(http//genemark.biology.gatech.edu/GeneMark/hmmchoice.html)等多个基因结构的预测软件，分析AP004674序列中与EI35I3 cDNA序列同源的区段，推测AP004674序列中与EI35I3 cDNA同源的基因的编码区全长1059bp。
2.基因末端序列分析采用美国Invitrogen公司的5’RACE试剂盒，通过5’-RACE(rapid amplification of cDNAend)分析方法，确定OsDR8基因的5’末端序列。进行5’-RACE分析的反转录条件与上述实施例四中的RT-PCR的反转录条件一致，反转录引物是OsDR8基因特异引物GSP1(5’-GTAGGTGATCATGTCG-3’)。反转录完成后，进行PCR扩增，扩增引物是OsDR8基因特异引物GSP2(5’-GGACTACCGCAACTCCA-3’)与5’RACE试剂盒锚定引物AbridgedAnchor(5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3’)。然后通过电泳回收扩增片段，用pGEM-T Vector System I试剂盒(美国Promega Corporation)对回收片段进行克隆。最后对克隆进行测序分析。序列分析发现OsDR8基因转录起始位点位于GENSCAN预测的翻译起始位点上游349bp处，即OsDR8基因的5’末端非翻译区(un-translated region，UTR)长349bp(位于序列表SEQ ID NO1所示序列的268至616bp处)。
参照推测的核苷酸数据库GenBank的AP004674序列中与cDNA克隆EI35I3的序列同源基因的结构，并与EI35I3序列进行比较，发现EI35I3序列包括OsDR8基因的3’-UTR。3’-UTR长64bp(位于序列表SEQ ID NO1所示序列的1754至1817bp处)。由此可知OsDR8基因成熟转录子全长为1472bp(位于序列表SEQ ID NO1所示序列的268至1817bp处，不包含内含子)。
3.从水稻品种明恢63中分离克隆OsDR8基因实施例四已证明水稻品种明恢63携带有功能的OsDR8基因。本发明利用cDNA克隆EI35I3作探针，筛选明恢63 BAC(bacterial artificial library)文库(Peng等，1998，植物学报401108-1114)，获得一阳性克隆5F21。分析AP004674序列中与EI35I3 cDNA同源基因的编码区两侧的限制性内切酶消化位点，发现限制性内切酶SamI和BamHI的消化位点分别位于与EI35I3序列同源基因编码区的两侧。用SamI和BamHI消化明恢63 BAC克隆5F21，获得一个大约1.9kb的DNA片段。将这一DNA片段连接到质粒载体pCAMBIA1301(见Sun等，2004，Plant J.37517-527；王石平等，中国发明专利申请公开说明书，专利申请号02139212.9)上，并命名D55S。
分别用限制性内切酶PstI、SacI、KpnI和BamHI+SacI消化质粒D55S。通过1％琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段，纯化后用T4-DNA聚合酶补平末端，与限制性内切酶Sma I消化处理的去磷酸化的pUC19载体(美国Amersham Bioscience公司)平端连接，电转化大肠杆菌DH10B(Sun等，2004，Plant J.37517-527)，通过蓝白斑筛选获得阳性亚克隆。提取阳性亚克隆质粒，并与空pUC19质粒进行电泳比较，剔除假阳性克隆及小片段克隆，检测阳性克隆插入片段大小。
采用M13-R和M13-F通用引物、美国Perkin Elmer公司的测序试剂盒(Big Dye Kit)、以双脱氧核苷酸末端终止法(美国Perkin Elmer公司)分别从每个亚克隆的一端或两端测序。共计对6个亚克隆进行了测序(图6)。对6条亚克隆的序列进行拼接，得到一长1980bp的序列。分析这条1980bp长的序列，证明它包含OsDR8基因的完整的编码序列。
4.OsDR8基因内含子的确定采用基因预测软件GenScan(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)对包含OsDR8基因的明恢63基因组的1980bp DNA序列的分析显示其编码区段中存在一个内含子(图7)。本发明根据cDNA克隆EI35I3测序结果(位于序列表SEQ ID NO1所示序列的581至1817bp处)与克隆D55S测序结果比较，确定在序列表SEQ ID NO1所示序列的1502至1579bp序列中确实存在一个78bp的内含子。这个内含子与预测的内含子的大小和位置一致(图7)。
为了确定OsDR8基因是否存在另外的内含子，将EI35I3的cDNA序列与进行5’RACE分析获得的cDNA序列(位于序列表SEQ ID NO1所示序列的268至784bp处)进行拼接后与克隆D55S序列进行对比分析，确定OsDR8基因只包含一个78bp的内含子，它位于序列表SEQ ID NO1所示序列的1502至1579bp处。根据这一结果OsDR8基因编码区被内含子分为两段，分别长885bp(位于序列表SEQ IDNO1所示序列的617至1501bp处)和174bp(位于序列表SEQ ID NO1所示序列的1580至1753bp处)(图8)。OsDR8基因全长1550bp(位于序列表SEQ ID NO1所示序列的268至1817bp处)(图8)。
实施例六OsDR8基因编码产物的分析根据BLAST分析结果，OsDR8基因编码的蛋白质与植物维生素B1合成酶有较高的同源性。如OsDR8基因的编码产物与玉米的维生素B1的生物合成酶基因thil-1的编码产物(National Center for Biotechnology Information(NCBI，http//www.ncbi.nlm.nih.gov)蛋白质数据库注册号S61419)同源，氨基酸一致性为73％(E值＝e-142)，与玉米的维生素B1的生物合成酶基因thil-2的编码产物(NCBI蛋白质数据库注册号S61420)同源，氨基酸一致性为73％(E值＝e-141)，与甜橙的维生素B1的生物合成酶(NCBI蛋白质数据库注册号T10474)氨基酸一致性为72％(E值＝e-132)。以上证据说明，OsDR8基因的编码产物极有可能是一种维生素B1合成酶。
实施例七OsDR8基因的功能验证本发明采用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术、通过抑制抗病水稻品种明恢63中OsDR8基因的表达，验证该基因的功能。这个技术途径的主要机理将目标基因的部分片段以反向重复的形式与能够表达双链RNA(double strand RNA，dsRNA)的载体连接，通过遗传转化将该载体导入植物中。获得的转化植株大量表达与目标基因部分片段同源的dsRNA。这些dsRNA迅速形成短干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)。这些siRNA与目标基因的转录子(mRNA)互补配对，在细胞内特殊酶的作用下使目标基因的转录子降解，从而在mRNA水平上抑制目标基因的功能。研究者可以通过转基因植株表型的改变，验证目标基因的功能。RNA干扰技术已被广泛用于基因功能的验证(Smith等，2000，Nature 407319-320)本发明用下列dsF和dsR序列作为PCR引物，含OsDR8基因cDNA片段的cDNA克隆(EI35I3，pSPORT1载体(该载体见储昭晖等，水稻全生育期均一化cDNA文库的构建和鉴定，2002，科学通报471656-1662))为模板，通过PCR扩增得到待转化的DNA片段。为了便于PCR产物的克隆，dsF和dsR引物的5’-端标有下划线的部分为限制性酶SpeI和AscI或者SacI和AvrII的消化位点，随后的3’-端的序列则分别与载体pSPORT1多克隆位点两侧的序列匹配。
SpeI AscIdsF5’-TAACTAGTGGCGCCTGCAGGTACCGGTCCG-3’SacI AvrIIdsR5’-TAGAGCTCGCCTAGGTGCACGCGTACGTACGTAAGC-3’
构建OsDR8基因片段的第一重复链(正向链)用AscI和AvrII消化部分PCR产物及载体pMCG161(依据载体pMCG161的使用说明，http//www.chromdb.org/info/plasmids/pMCG161.html)，消化完全后在75℃水浴10min灭活限制性内切酶，置于冰上，用T4DNA连接酶进行连接反应。电转后获得的克隆质粒用dsF和dsR引物扩增筛选阳性克隆。
构建OsDR8基因片段的第二重复链(反向链)用SacI和SpeI消化剩余的PCR产物和连接了第一重复链的克隆质粒，消化完全后在75℃水浴10min灭活限制性内切酶，用T4D16A连接酶进行连接反应。电转后获得的克隆质粒用SacI和SpeI双酶消化反应筛选阳性克隆，阳性克隆命名为D16R。
将构建好的双链RNA载体D16R电转化农杆菌感受态细胞EHA105，保存菌株用作农杆菌介导的水稻遗传转化。
采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，Optimising the tissue culture conditions forhigh efficiency transformation of indica rice，2005，Plant Cell Rep.23540-547)将D16R导入抗病水稻品种明恢63。获得的遗传转化植株被命名为D16RMH(其中D16R为遗传转化载体名称，MH代表水稻品种明恢63)。本发明共获得独立转化植株30株。对全部30株植株在成株期阶段接种白叶枯病菌株PXO61，发现15株转化植株的抗性不同程度减弱；与转基因的受体水稻品种明恢63、以及阴性转化植株D16RMH-24和D16RMH-30相比，这些抗性减弱的转化植株的病斑面积(病斑长/病叶长×％)增加7％-42％(表3)。
表3.部分T0代转化植株(D16RMH)对白叶枯病菌株PXO61的反应

(1)除特殊标注的植株外每株转基因植株接种3-5片叶，两周后调查病斑和病叶长度，每个数据来自于多个叶片的平均值。
(2)阴性转化植株，其它植株为阳性转化植株。
为进一步验证转化植株的抗病能力减弱是否与OsDR8基因表达量相关，本发明对表3中所列17株转化植株抽提总RNA，利用Rotor-Gene 3000TM定量PCR仪(Rotor-Gene公司)、SYBR Green荧光嵌入染料和Rotor-Gene公司的定量PCR分析方法做定量RT-PCR分析，比较转化植株和对照材料中OsDR8基因表达量。PCR反应引物是35I3F(5’-TCCAGCCTCCTCAAGACCT-3’)和35I3R(5’-AGTCCTCCTGCTTCGTCGTA-3’)。以水稻肌动蛋白的RT-PCR产物作为样品量一致性对照。肌动蛋白PCR引物序列是actin(5’-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3’)和actinR(5’-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3’)。
实验结果显示转化植株中OsDR8基因的表达状况与植株的表型共分离(图9)。OsDR8基因表达量与抗病性减弱的转化植株呈负相关；抗病性减弱的转化植株中OsDR8基因的表达量与对照材料明恢63相比显著减少。而抗病表型无明显变化的转化植株(D16RMH-24和D16RMH-30)中OsDR8基因表达量与明恢63相比无明显变化。该结果说明了OsDR8基因在水稻抗白叶枯病反应过程当中发挥相当重要的作用。
另外，本发明也证明转化植株对稻瘟病菌的抗性也减弱了。取转化植株和对照材料的叶片，采用点接种(spot inoculation)方法(Jia等，Determination of host responses to Magnaporthegrisea on detached rice leaves using a spot inoculation method，2003，Plant Disease 87129-133)在室内接种稻瘟病菌V86013进行观察，OsDR8基因表达量降低的转化植株叶片上稻瘟病菌的生长繁殖状况都明显好于对照抗病品种明恢63，而与感病品种牡丹江8号情况相似；部分转基因植株的叶片上甚至形成了典型的病斑(图10)。说明OsDR8基因在水稻抗稻瘟病反应中也发挥作用。
OsDR8基因与玉米的维生素B1的生物合成酶基因thil高度同源。thil基因的蛋白质产物在细胞内的定位情况表明它在质体膜上，因为该基因的蛋白质产物的氨基端有一个质体定位序列，并且有很多的疏水氨基酸，因此推测该基因产物所在场所质体即为维生素B1的合成场所(Belanger等，1995，Plant Mol Biol，29809-821)。维生素B1是生物体内许多的代谢有关酶类的辅助因子，这些代谢途径包括三羧酸循环、戊糖磷酸途径、厌氧呼吸、氨基酸合成分支途径和色素生物合成等。如β-胡萝卜素合成所经历的一个代谢途径将丙酮酸转化为乙酰辅酶A所需的酶丙酮酸脱氢酶需要维生素B1为辅助因子，而维生素B1活性形式为硫胺素焦磷酸作为辅助因子参与代谢(Schulze-Siebert等，1987，Plant Physiol，841233-1237)。有研究表明维生素B1除了在一些植物的生化代谢途径中起作用，它同样也可以作为一个诱导因子刺激植物体内的病程相关蛋白(PR-1)的积累，增加烟草对烟草花叶病毒的抗性(Malamy等，1996，Mol Plant-Microbe Interact，9474-482)。结合本实验结果，推测OsDR8基因的功能可能是抗病植物受病原菌侵染后，诱导产生了该基因的蛋白质产物，从而促进了维生素B1的大量合成；而维生素B1可以转化为其活性形式作为辅助因子增强一些代谢有关酶的活性，使植物产生大量的生理生化变化抵制病害，同时由于维生素B1的积累可以诱导病程相关蛋白的产生而控制病害。
序列表SEQ ID NO1<110>华中农业大学<120>水稻抗病相关基因OsDR8<130>
<141>2005-01-30<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1980<212>DNA<213>Oryza sativa<220>
<221>gene<222>(268)..(1817)<223>
<220>
<221>3’UTR<222>(1754)..(1817)<223>
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<221>CDS<222>(617)..(1501)<223>
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<221>CDS<222>(1580)..(1753)<223>
<220>
<221>Intron<222>(1502)..(1579)<223>
<220>
<221>5’UTR<222>(268)..(616)<223>
<400>1gggctccacc actagtaccc ctcactacag gtagccataa aaaaaatcga tcaccaaaac 60ccattattag gttgtgtact gatacagaaa gttgggaacc aatctcccag cacagaaaac120ggtacggttc attagcgcgt gattaattaa atatttacta ttttttaaaa aaaatagatc180aatatgattt ttaagcaact ttcgtataaa tactttttca aaaaaacaca ccgttttcta240gtttgaaaag cgtacacgcg tgaaatgagg gagaaaggtt ggaaacgtgg gattgcaaac300acagcattag tcgtcacggt acccagcaaa aaatcactga acacagcacc actgttcccg360tgagtccgta acttagcagc acttgtcccg ttctcctgaa gacagtccaa aaaccctcac420taaaccttcc caaaatatct cctccaatca atccgaaacc cagaggccca tactgctgac480acgtggacgg cactcccaga tatttgcgct ctcctcttct tcttataccc ccgccaaccc540acgctctatc cactcacaca cacactcctc atcccagagc aagaagctca gctcctcctc600ctctcgcatg gcagcc atg gcc acc acc gcg tcc agc ctc ctc aag acc tcc652Met Ala Thr Thr Ala Ser Ser Leu Leu Lys Thr Ser1 5 10
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1.赋予水稻对白叶枯病和稻瘟病产生抗性的DNA序列，它是SEQ ID NO1中所示的DNA序列，它包括完整的OsDR8基因。
2.OsDR8基因的编码区，它是SEQ ID NO1中第617-1501位和第1580-1753位所示的DNA序列或者是编码与SEQ ID NO1编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。
3.权利要求1-2任一项所述的DNA序列在增加水稻对白叶枯病和稻瘟病抗性中的应用。
全文摘要
本发明涉及植物生物技术领域。具体涉及包含水稻抗病相关基因OsDR8的DNA片段的分离克隆和功能验证。利用基于RNA干扰(RNA interference，RNAi)原理的转基因技术，将OsDR8基因的部分DNA片段与能够表达双链RNA的载体连接并转入抗病水稻品种，抑制抗病水稻品种中OsDR8基因的表达。OsDR8基因表达量显著降低的遗传转化水稻对白叶枯病菌和稻瘟病菌的抗性明显减弱，证明OsDR8基因在水稻抗白叶枯病和抗稻瘟病中发挥重要作用。
文档编号C07K14/415GK1814760SQ200510018240
公开日2006年8月9日 申请日期2005年2月2日 优先权日2005年2月2日
发明者王石平, 王宫南 申请人:华中农业大学