专利名称：慢病毒-胸苷激酶基因构型及其获得方法和临床应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因新构型，具体涉及一种慢病毒一胸苷激酶基因构型及其获得方法和临床应用。
背景技术：
恶性肿瘤是威胁人类健康的首要疾病，仅在我国每年因肿瘤死亡人数就达150万，根据目前癌症发病趋势，到2020年全球每年新增癌症患者人数将达到1500万。WHO预测21世纪癌症将成为人类的"头号杀手"。因此探索肿瘤治疗的新技术新方法具有十分重要的意义。基因治疗正以巨大的治疗潜力展现在人们面前，其发展代表了根治肿瘤的方向。
HSV1-TK基因结合GCV是最常用于临床基因治疗的自杀基因系统之一。1980年Steven L. Mc Knight测定了单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因全序列并确定了其丌放读码框(Steven L. McKnight， Nucleic Acids Research, 1980，8(24) :5949-5964. )， 1986年Moolten博士偶然发现TK基因转染肿瘤细胞可使其对化疗敏感性增加(Moolten， Cancer Res, 1986,46:5276—5281)，随后人们对TK基因的抗癌作用进行了研究，其治疗肿瘤的基本原理是，当TK被转入哺乳动物的细胞后，其编码的胸苷激酶可将无毒的前药GCV磷酸化为细胞毒性产物，阻止细胞DNA合成，从而使靶细胞走向死亡(Tomicic MT, MutatRes， 2002, 505:1-11)。
显然，如何获得胸苷激酶基因构型以及在临床应用具有高转染效率、高效稳定表达，是医学及生物学研究者们最为关心的课题
发明内容
本发明的第一个目的，是为了提供一种在临床应用具有高转染效率、高效稳定表达的新型病毒载体基因构型，即慢病毒一胸苷激酶基因构型。
本发明的第二个目的，是为了提f 一种慢病毒一胸苷激酶基因构型的制备方法。
本发明的第三个目的，是为了提供一种慢病毒一胸苷激酶基因构型的临床应用。
本发明的第一个目的可以采取如下技术方案达到
慢病毒一胸苷激酶基因构型，其特征是包括慢病毒载体LV、胸苷激酶片断和CMV启动子，全构件核苷酸长8. 1Kb，胸苷激酶长l.lKb、启始片断为18bp;全构件的DAN序列如序列表SEQ IDNe: 1所示启始片断的序列为ATGGCTTCGTACCCCGGC。
本发明所述慢病毒一胸苷激酶基因构型如图1所示。本发明的第二个目的可以采取如下技术方案达到
慢病毒—胸苷激酶基因构型的获得方法，其特征在于包括如下步骤-
1)在序列为ATGGCTTCGTACCCCGGC启始片断的诱导下，将慢病毒载体LV与TK基因cDNA，经酶切、连接、转化使胸苷激酶片断插入慢病毒载体中，构成初级构件；
2)将1)中的初级构件与辅助质粒pLPl、pLP2、pLP/VSVG共转染293T细胞培养扩增，提取培养上清液，80， OOOOg超速离心分离得到用于治疗的慢病毒一胸苷激酶基因产品。
所述TK基因cDNA可以如序列表SEQ IDNs: 2所示；其中，红色部分为TK基因序列，起始密码子ATG，终止密码子TGA， GAATTC为的酶切位点，CCGCGG为fecll的酶切位点，CCCGGG为fe迈I的酶切位点。
为TK基因PCR扩增而设计的引物可以如序列表SEQ IDN2: 3所示。
用于DNA连接及载体构建过程可以如图2所示。
本发明的第三个目的可以采取如下技术方案达到-
慢病毒一胸苷激酶基因构型的临床应用，其特征是可以利用本发明所述的慢病毒一胸苷激酶基因构件扩增后的上清液制取基因产品，该产品可以制成治疗神经胶质瘤、前列腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等实体肿瘤的制剂。
本发明具有以下突出的有益效果
1、 本发明可利用慢病毒一胸苷激酶基因构件扩增后的上清液制取基因样品，根据本慢病毒一胸苷激酶基因构建系统在初步临床前预实验中表明，无论在体外肿瘤细胞系或动物模型中，该基因产品具有明确、高效、稳定抗肿瘤效应，安全性好，应用方便，其中对脑胶质瘤的临床前期应用中，有效率超过90%。应用本载体系统可克服常用的腺病毒载体表达时间短暂、腺病毒本身抗原表达可引起人体免疫反应的缺点，因此对手术不能完全切除、放化疗效果不佳的恶性实体肿瘤有很好的应用前景。
2、 本发明可高效稳定转染多种人体实体肿瘤，例如神经胶质瘤、前列腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等，具有高抗癌作用，对恶性脑胶质瘤临床前期应用中，有效率超过90%。
图1是慢病毒一胸苷激酶基因构型图。 图2是DNA连接及载体构建示意图。 图3是重组慢病毒质粒pLenti6/5V-TK的测序结果。 具体实施例
下面结合实施例对本发明作进一歩说明 实施例1:
慢病毒一胸苷激酶基因构型，其特征是包括慢病毒载体LV、胸苷激酶
片断和CMV启动子，全构件核苷酸长8. 1Kb，胸苷激酶长l.lKb、启始片断为 18bp;全构件的DAN序列如序列表SEQ ID他1所示；启始片断的序列为 ATGGCTTCGTACCCCGGC。慢病毒一胸苷激酶基因构型如图1所示。
本实施例所述慢病毒一胸苷激酶基因构型的制备方法包括如下歩骤
1、 LV慢病毒载体的获得
理想的病毒载体能同时提供高效的基因转移、长期稳定的基因表达及生物 安全性。研究表明，以HIV-1为基础构建的这类慢病毒载体具有可感染非分 裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点，适于 体内基因治疗，是目前较为理想的基因转移载体(Naldini L， Science, 1996,272:263-267; Delenda C' J Gene Med，2004, 6:S125-138; Sinn PL， Gene Therapy, 2005， 12:1089-1098)。我们利用的pLenti6/5V-D-TOPO属第三代慢 病毒载体质粒，以ViraPower'*1 Lentiviral Expression Systems建立TK基 因表达的慢病毒包装系统。所应用的慢病毒表达系统ViraPower'^Lentiviral Expression Systems为载体质粒、包装质粒、rev质粒和包膜蛋白质粒4质 粒共转染293T细胞生产假病毒颗粒。该包装系统中①去掉了 HIV的大部分的 蛋白编码基因，不存在产生复制型H工V的可能性；②慢病毒载体的包装质粒 中缺失掉了 LTRs，因而载体基因组只能在生产细胞中表达，而不可能被整合 入病毒粒子中；③假型慢病毒载体无复制性，只携带外源基因，相当均一， 无类似于复制型月泉病毒 (replication competent adenoviruses, RCA)之类 的成分；④载体基因组有自灭活机制，整合于宿主基因组后，不可能再被拯 救而产生可被包装的病毒基因组。因,而其生物安全性极高。
2、 TK基因全长cDNA编码片断
所述TK基因cDNA可以如序列表SEQ ID他2所示；其中，红色部分为 TK基因序列，起始密码子ATG，终止密码子TGA， GAATTC为EcoR I的酶切位 点，CCGCGG为Sac II的酶切位点，CCCGGG为Sam I的酶切位点。测序结果显示重组质粒构建正确。
3、 DNA连接及载体构建
DNA连接及载体构建过程如图2所示，具体包括如下过程
(1) 目的基因HSV-TK片段的获取、纯化及回收以AcMl和feJI双酶 切质粒pSNAV2. 0-TK(2. Omg/ml)，回收约1. 2 kb左右片段，获取目的基因TK 片段；20ul酶切产物以含溴化乙锭(EB)的1%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外 灯下观察，切割目标凝胶条带，再用U-gene HQ&Q凝胶回收试剂盒II回收纯 化，获得可以用于构建的HSV-TK基因片段。
(2) pLenti6/5V载体片段的获取、纯化及回收fco/ I和i7 o I双酶切质 粒pLenti6/5V-EGFP (6. 7mg/ml)，回收7.0kb左右片段，获取线性化的载体 片段；20iil酶切产物以含溴化乙锭(EB)的1%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外 灯下观察，切割目标凝胶条带，再用U-gene HQ&Q凝胶回收试剂盒II回收纯 化，获得可以用于构建的pLenti6/5V载体片段。
(3) 目的基因HSV-TK片段与pL^nti6/5V载体片段的连接利用5"s7 I与 为同尾酶的关系，在LDNA连接酶促反应下，目的基因HSV-TK片段以
粘端连接方式与pLenti6/5V载体片段连接。
(4) 连接产物的转化、扩增及菌液的筛选鉴定采用热休克方法转化 DH-5a大肠杆菌感受态细胞，铺氨卞的LB平板培养，挑取阳性克隆菌斑接种 培养管摇菌扩增，取菌液小提质粒，各小提质粒采用化o/ I和5"acII双酶切
鉴定筛选。
(5) 重组质粒pLenti6/5V-TK的提取及质粒PCR、酶切和测序鉴定小提 质粒经化o/Pl和6^:n双酶切筛选鉴定正确的菌液，再次摇菌，大量扩增， 采用碱裂解法大量提取质粒；以重组的pLenti6/5V-TK质粒为模板，以合成 的HSV-TK基因上、下游引物进行TK基因的PCR扩增，TK基因5'端引物 5' -GCC AGA ATT CAT GGC TTC GTA CCC CGG C_3， ， 3'端引物5， -CTG CGA ATT CTC AGT TAG CCT CCC CCA'T-3'; 重组质粒pLenti6/5V-TK分别 用S柳I单酶切、十J力oI双酶切鉴定；小提的重组质粒pLenti6/5V-TK 送上海英俊生物技术有限公司测序。
(6) 表达TK基因的慢病毒包装系统的建立利用ViraPower Lentiviral Expression Systems与我们构建的重组慢病毒载体质粒pLenti6/5V_TK,共 同建立TK基因表达的慢病毒包装系统。其中包括表达载体质粒 pLenti6/5V-TK、包装质粒(pLPl) 、 rev质粒(pLP2)和包膜蛋白质粒(pLP/VSVG) 4质粒，包装细胞293T细胞，以及用于慢病毒感染细胞筛选的抗生素一盐酸 抗稻瘟菌素S (Blasticidin SHCl， BSD) 。 4质粒共转染293T细胞，使其大量扩增，提取培养上清液，80，000g超速离心分离出可用于治疗的慢病毒一胸 苷激酶产品。
(7)对产品进行氯化铯(CsCL)纯化，应用空斑试验测出PFU效价，_70°。保存。
本发明应用机理将TK基因通过慢病毒载体系统转入肿瘤细胞中使之表 达，继之以一定途径使用GCV，在其参与下胸苷激酶转化单磷酸核苷为三磷酸 核苷，并与肿瘤新生DNA链结合，干扰DNA的合成而杀死肿瘤细胞，而且TK 基因抗肿瘤细胞效应还能通过该系统独特强大的"旁观者效应"，即携带TK 基因阳性细胞的死亡，可以导致周围TK基因阴性的细胞死亡，使其抗肿瘤效 应放大。
7序列表
<110〉广州军区广州总医院
<120>慢病毒一胸苷激酶基因构型及其获得方法和应用 <160〉 1
<170> Patentln Version 3,3
<210> 1
<211〉 8094
<212>舰
<213〉人工序列
<220〉
<223>全构件包括慢病毒载体LV、胸苷激酶片断和CMV启动子，可以制成治疗神经胶质 瘤、前列腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等实体肿瘤的制剂。
〈400〉 1
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<210〉 2
<211> 1608
<212〉画
<213>人f序列
<220>
<223〉 TK基闪全长cDNA编码片断序列。
<400〉 2
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210>3 <2]1> <212>DNA <213>人I序列 <220>
<223〉为了合成HSV-TK基闪而设计的引物，用作TK基因PCR扩增。 <400>3
TK基闪5'端引物5' -GCC AGA ATT CAT GGC TTC GTA CCC CGG C-3'; TK基囚3'端引物5' -CTG CGA ATT CTC AGT TAG CCT CCC CCA T-3'
权利要求
1、慢病毒—胸苷激酶基因构型，其特征是包括慢病毒载体LV、胸苷激酶片断和CMV启动子，全构件核苷酸长8.1Kb，胸苷激酶长1.1Kb、启始片断为18bp；全构件的DAN序列如序列表SEQ ID№1所示；启始片断的序列为ATGGCTTCGTACCCCGGC。
2、 根据权利要求1所述的慢病毒一胸苷激酶基因构型，其特征是所述慢病毒—胸苷激 酶基因构型如图1所示。
3、 慢病毒一胸苷激酶基因构型的获得方法，其特征在于包括如下歩骤1)在序列为ATGGCTTCGTACCCCGGC启始片断的诱导下，将慢病毒载体LV与TK基 因cDNA，经酶切、连接、转化使胸苷激酶片断插入慢病毒载体中，构成初级构件；2)将l)中的初级构件与辅助质粒pLPl、 pLP2、 pLP/VSVG共转染293T细胞培养扩 增，提取培养上清液，80， OOOOg超速离心分离得到用于治疗的慢病毒一胸苷激酶基因产品。
4、 根据权利要求3所述的慢病毒一胸苷激酶基因构型的获得方法，其特征在于所述 TK基因cDNA如序列表SEQ ID他2所示；其中，红色部分为TK基因序列，起始密码 子ATG，终止密码子TGA， GAATTC为五09i I的酶切位点，CCGCGG为的酶切位点， CCCGGG为&w I的酶切位点。
5、 根据权利要求3所述的慢病毒一胸苷激酶基因构型的获得方法，其特征在于为TK 基因PCR扩增而设计的引物如序列表SEQ IDN2: 3所示。
6、 根据权利要求3所述的慢病毒一.胸苷激酶基因构型的获得方法，其特征在于用于 DNA连接及载体构建过程如图2所示。
7、 慢病毒一胸苷激酶基因构型的临床应用，其特征是利用本发明所述的慢病毒一胸苷 激酶基因构件扩增后的上清液制取基因产品，该产品可以制成治疗神经胶质瘤、前列腺癌、 黑色素瘤、肝癌、肺癌等实体肿瘤的制剂。
8、 如权利要求7所述的慢病毒一胸苷激酶基因构型的临床应用，其特征是利用慢病毒 一胸苷激酶基因构件扩增后的上清液制取基因产品，该产品可以制成治疗神经胶质瘤、前列 腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等实体肿瘤的制剂。
全文摘要
本发明涉及一种慢病毒-胸苷激酶基因构型及其获得方法和临床应用，其特征是所述基因包括慢病毒载体LV、胸苷激酶片断和CMV启动子，全构件核苷酸长8.1Kb，胸苷激酶长1.1Kb、启始片断为18bp；全构件的DAN序列如序列表SEQ ID №1所示；启始片断的序列为ATGGCTTCGTACCCCGGC。可以利用本发明所述的慢病毒-胸苷激酶基因构件扩增后的上清液制取基因产品，该产品可以制成治疗神经胶质瘤、前列腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等实体肿瘤的制剂。
文档编号C12N15/867GK101481708SQ20081019875
公开日2009年7月15日 申请日期2008年9月25日 优先权日2008年9月25日
发明者戴学军, 健 林, 王伟民 申请人:广州军区广州总医院