专利名称：：一株成团泛菌及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于新菌种筛选技术及环境生物
技术领域：
，具体涉及一株成团泛菌(Pfl"toeflflgg/omerawMFC3)、其筛选方法及其在Fe(III)还原和腐殖酸还原中的应用。
背景技术：
：Fe(ni)呼吸和腐殖酸呼吸是厌氧环境中普遍存在的两种微生物呼吸代谢形式。Fe(in)呼吸，是指微生物利用Fe(ni)作为呼吸链末端电子受体，实现电子在呼吸链上的传递，并从电子传递的过程中获得能量进行生长的代谢过程。腐殖酸呼吸，则指微生物以腐殖酸作为唯一末端电子受体，接受来自有机酸等物质提供的电子，偶联能量的产生，支持菌体生长的过程。两种呼吸作用在元素的生物地球化学循环过程中均具有重要意义，表现为1)微生物在进行Fe(m)呼吸或腐殖酸呼吸的过程中，可直接将环境中的有机质或甲苯、氯乙烯等环境有毒物质氧化，产生C02;2)呼吸作用产生的Fe(II)或还原态腐殖酸能够还原环境中的一些氧化态物质，如Fe(m)、Mn(IV)、Cr(VI)、U(VI)、硝基芳香化合物和多卤代污染物。Fe(ni)呼吸和腐殖酸呼吸作用可影响环境中C、N、Fe、Mn以及一些痕量金属元素的生物地球化学循环，并且能够促进重金属以及有机污染物的脱毒，在水体自净、污染土壤原位修复、污水处理等方面具有积极作用，因此近年来与两种呼吸作用有关的研究倍受关注。迄今为止，已从土壤、沉积物、水体及污泥中分离到上百种Fe(in)还原菌，包括地杆菌、希瓦氏菌、产甲垸菌、发酵细菌、嗜热菌等；从上世纪90年代后期以来，多种以腐殖酸或腐殖酸模式物蒽醌-2,6-二磺酸(AQDS)为末端电子受体的细菌也被分离和鉴定。但尚未发现具有Fe(ni)呼吸和腐殖酸呼吸活性的成团泛菌的报道。
发明内容本发明的目的在于开发一种具有Fe(m)呼吸和腐殖酸呼吸活性的新菌株。本发明经大量试验研究，从广东肇庆古森林土壤样品中分离纯化得到一株成团泛菌，具有较强的Fe(in)或腐殖酸还原能力，本发明的另一个目的是提供所述成团泛菌在Fe(m)还原和腐殖酸还原中的应用。本发明提供的成团泛菌(Z^2"toeaaggfo附e/YwwMFC3或f*.aggfo附e/"a似MFC3)，于2008年4月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC2453。本发明所述成团泛菌的富集、分离及纯化方法包括以下步骤(1)取古森林土壤样品于液体分离培养基中富集每升液体分离培养基中含l.Og葡萄糖(作为电子供体)、0.412gAQDS(蒽醌-2,6-二磺酸，作为电子受体)、2.5gNaHC03、0.25gNH4Cl、0.678gNaH2P04.2H20、O.lgKCl、lO.OmL维生素溶液、lO.OmL微量元素溶液。其中，维生素溶液是每升去离子水中含2.0mg生物素、2.0mg叶酸、B610.0mg维生素、5.0mg硫胺素、5.0mg核黄素、5.0mg烟酸、5.0mg泛酸钙、O.lmg维生素B12、5.0mg对氨基苯甲酸、5.0mg硫辛酸；微量元素溶液是每升去离子水中含1.5g氨三乙酸、3.0gMgS04.7H20、0.5gMnS04.H20、l.OgNaCl、O.lgFeS04.7H20、O.lgCoCl2.6H20、O.lgCaCl2、O.lgZnS04.7H20、O.OlgCuS04.5H20、O.OlgA1K(S04)2.12H20、O.OlgH3B03、O.OlgNa2Mo04.2H20。往己接种样品的培养液中鼓充高纯混合气体(N2/CO2=80/20)，时间不少于30分钟，鼓气完毕用铝盖密封，置于厌氧工作站(N2/CO2=80/20)，静置培养，观察培养液的颜色变化情况。当培养液颜色从无色变为黄色直至不再变化时，以10%的接种量富集培养三次。(2)将第四代富集培养反应后的培养液进行适当稀释后均匀涂布于固体分离培养基上，置于厌氧工作站(N2/CO2=80/20)培养，挑取单菌落进行单菌落分离与纯化。固体分离培养基为每升液体分离培养基中加入18g琼脂粉。(3)观察测定本发明成团泛菌的形态、生理、生化及16SrRNA基因序列特征。本发明的有益效果是提供了一株新的具有Fe(m)呼吸和腐殖酸呼吸能力的菌株，所述菌株与已报道菌株相比，具有较强的Fe(m)还原和腐殖酸还原能力，电子利用谱广，能还原结晶度较高的铁氧化物，例如纤铁矿、赤铁矿。所述菌株筛选方法简单，具有工业化生产的可能性。图1为成团泛菌尸朋toe"flggfomeraraMFC3的10000倍扫描电子显微镜图片具体实施例方式实施例l本发明成团泛菌MFC3的富集、分离及纯化取5g古森林土壤样品于lOOmL液体分离培养基中。每升液体分离培养基中含l.Og葡萄糖(作为电子供体)、0.412gAQDS(2，6-二磺酸蒽醌，作为电子受体)、2.5gNaHC03、0.25gNH4Cl、0.678gNaH2P04.2H20、O.lgKC1、lO.OmL维生素溶液、lO.OmL微量元素溶液。其中，维生素溶液是每升去离子水中含2.0mg生物素、2.0mg叶酸、B6lO.Omg维生素、5.0mg硫胺素、5.0mg核黄素、5.0mg烟酸、5.0mg泛酸钙、0.1mg维生素B12、5.0mg对氨基苯甲酸、5.0mg硫辛酸；微量元素溶液是每升去离子水中含L5g氨三乙酸、3.0gMgS04.7H20、0.5gMnSO4.H2O、1.0gNaCl、O.lgFeS04.7H20、O.lgCoCl2.6H20、O.lgCaCl2、O.lgZnS04.7H20、O.OlgCuS04.5H20、O.OlgA1K(S04)2.12H20、O.OlgH3B03、O.OlgNa2Mo04.2H20。往己接种样品的培养液中鼓充高纯混合气体(N2/CO2=80/20)，时间不少于30分钟，鼓气完毕用铝盖密封，置于厌氧工作站(N2/COf80/20)，30°C静置培养，观察培养液的颜色变化情况。当培养液颜色从无色变为黄色直至不再变化时，以10%的接种量富集培养三次。最后，将第四代反应后的培养液进行适当稀释后均匀涂布于固体分离培养基上，固体分离培养基为每升液体分离培养基中加入18g琼脂粉，置于厌氧工作站(N2/CO2=80/20)3(TC培养48小时，挑取单菌落进行单菌落分离与纯化。本发明成团泛菌的形态、生理、生化及16SrDNA基因序列特征(1)菌体形态特性采用常规的细菌电子显微镜观察，该菌株为革兰氏阴性菌，短杆状，大小为(0.5-1.(Vm)x(l-3)^im，以周生鞭毛运动。(2)菌落形态特征在牛肉膏蛋白胨琼脂固体培养基平板上好氧培养24小时后，菌落表面光滑，半透明，边缘整齐，菌落直径为23mm。(3)生理生化特征所述菌具兼性厌氧生长能力，在厌氧条件下，能以葡萄糖、蔗糖、甘油、乳酸、柠檬酸或甲酸为电子供体，还原水铁矿、针铁矿、纤铁矿、赤铁矿等铁氧化物及AQDS。其它已经测定的生理生化特征见表1。表1生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(注"+"表示为阳性反应，"-"表示为阴性反应)(4)16SrDNA基因序列特征采用常规方法，用SDS-蛋白酶K，氯仿-异戊醇(体积比24:1)抽提，0.6体积异丙醇沉淀的方法提取细菌总DNA。采用细菌16SrDNA通用引物F27和R1492扩增细菌的16SrDNA，将PCR扩增产物回收后进行测序。再将得到的碱基序列在GenBaiik等国际核酸序列数据库内进行同源序列搜索(Blastsearch),找出该菌株与数据库中同源性最高的模式菌株或保藏于ATCC或DSM等国际菌种保藏中心的菌株。根据比对结果，菌株与成团泛菌的16SrDNA序列具最高同源性，达99.9%。结合上述的生理生化特性、16SrDNA序列比对结果，本发明菌株属于肠木干菌属，命名为成团泛菌Pfl/2foe"flgg/owera似MFC3。实施例2成团泛菌MFC3以葡萄糖为电子供体对针铁矿的还原活性培养基A配方每升去离子水中含针铁矿2.25g，NaHC032.5g，NH4Cl0.25g，NaH2P04.2H200.678g，KC1O.lg，葡萄糖l.Og，维生素溶液和微量元素溶液各10.0mL，于121'C灭菌20分钟，葡萄糖单独灭菌，灭菌后与其它成分混合。其中维生素溶液和微量元素溶液成分同实施例1所述分离培养基。制备细菌悬浮液用接种环挑取一环活化的菌株于200mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于摇床中(3(TC,180转/分钟)培养16小时，使细菌数量达到指数生长期，8000转/分钟离心收集菌体，倒去上清液，将沉淀下来的菌体悬浮于200mL培养基A中，制成菌悬液。接种细菌悬浮液于培养液A中，使其菌数达到108CFU/mL,然后鼓充高纯混合气体(N2/CO2=80/20)，鼓气时间不少于30分钟，于3(TC静置厌氧培养。观察培养液的颜色变化情况，每隔510天取混合均匀的4mL培养液于16mL0.5mol/LHCl溶液中180转/分钟振荡1.5小时，再过滤，采用邻菲罗林法给滤液中的Fe(n)显色，采用紫外分光光度计在510nm处测定Fe(n)的含量，并以不加菌的培养液为对照，验证菌株的铁还原能力。Fe(II)含量变化见表2，Fe(II)含量单位为mg/L，表示每升样品中所含Fe(II)的毫克数。由表2可知，随着培养时间的延长，体系中Fe(II)的生成量明显高于不加菌的对照，说明该菌能够以葡萄糖为电子供体厌氧还原针铁矿，并且还原能力较强。表2尸.flggfommwwMFC3以葡萄糖为电子供体还原针铁矿过程中<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例3成团泛菌MFC3以葡萄糖为电子供体对纤铁矿的还原活性培养基B配方每升去离子水中含纤铁矿2.25g，NaHC032.5g，NH4Cl0.25g，NaH2P04.2H200.678g，KC10.1g，葡萄糖l.Og，维生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(维生素溶液和微量元素溶液成分同实施例1所述分离培养基)，于12ir灭菌20分钟，葡萄糖单独灭菌，灭菌后与其它成分混合。制备细菌悬浮液用接种环挑取一环活化的菌株于200mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于摇床中G(TC，180转/分钟)培养16小时，使细菌数量达到指数生长期，8000转/分钟离心收集菌体，倒去上清液，将沉淀下来的菌体悬浮于200mL培养基B中，制成菌悬液。接种细菌悬浮液于培养基B中，使其菌数达到108CFU/mL，然后鼓充高纯混合气体(N2/CO2=80/20)，鼓气时间不少于30分钟，于3(TC静置厌氧培养。观察培养液的颜色变化情况，每隔5~10天取混合均匀的4mL培养液于16mL0.5mol/LHCl溶液中180转/分钟振荡1.5小时，再过滤，采用邻菲罗林法给滤液中的Fe(n)显色，采用紫外分光光度计在510nm处测定Fe(II)的含量，并以不加菌的培养液为对照，验证菌株的铁还原能力。Fe(II)含量变化见表3，Fe(II)含量单位为mg/L，表示每升样品中所含Fe(II)的毫克数。由表3可知，体系中Fe(n)的生成量明显高于不加菌的对照，说明该菌能够以葡萄糖为电子供体厌氧还原纤铁矿，并且还原能力较强。表3P.flggfomera似MFC3以葡萄糖为电子供体还原纤铁矿过程中<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例4成团泛菌MFC3以葡萄糖为电子供体对水铁矿的还原活性培养基C配方每升去离子水中含水铁矿2.5§，NaHC032.5g，NH4Cl0.25g，NaH2PO4.2H2O0.678g，KC10.1g,葡萄糖l.Og，维生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(维生素溶液和微量元素溶液成分同实施例1所述分离培养基)，于12rC灭菌20分钟，葡萄糖单独灭菌，灭菌后与其它成分混合。制备细菌悬浮液用接种环挑取一环活化的菌株于200mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于摇床中G(TC，180转/分钟)培养16小时，使细菌数量达到指数生长期，8000转/分钟离心收集菌体，倒去上清液，将沉淀下来的菌体悬浮于200mL培养基C中，制成菌悬液。接种细菌悬浮液于培养基C中，使其菌数达到108CFU/mL，然后鼓充高纯混合气体(N2/CO2=80/20),鼓气时间不少于30分钟，于3CTC静置厌氧培养。观察培养液的颜色变化情况，每隔510天取混合均匀的4mL培养液于16mL0.5mol/LHCl溶液中180转/分振荡1.5小时，再过滤，采用邻菲罗林法给滤液中的Fe(n)显色，采用紫外分光光度计在510nm处测定Fe(n)的含量，并以不加菌的培养液为对照，验证菌株的铁还原能力。Fe(n)含量变化见表4，Fe(II)含量单位为mg/L，表示每升样品中所含Fe(II)的毫克数。由表4可知，体系中Fe(II)的生成量明显高于不加菌的对照，说明该菌能够以葡萄糖为电子供体厌氧还原水铁矿，并且还原能力较强。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例5成团泛菌MFC3以葡萄糖为电子供体对赤铁矿的还原活性培养基D配方每升去离子水中含赤铁矿2.0g，NaHC032.5g，NH4Cl0.25g，NaH2PO4.2H2O0.678g,KC10.lg，葡萄糖l.Og，维生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(维生素溶液和微量元素溶液成分同实施例1所述分离培养基)，于12rC灭菌20分钟，葡萄糖单独灭菌，灭菌后与其它成分混合。制备细菌悬浮液用接种环挑取一环活化的菌株于200mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于摇床中(3(TC，180转/分钟)培养16小时，使细菌数量达到指数生长期，8000转/分钟离心收集菌体，倒去上清液，将沉淀下来的菌体悬浮于200mL培养基D中，制成菌悬液。接种细菌悬浮液于培养基D中，使其菌数达到108CFU/mL，然后鼓充高纯混合气体(N2/CO2=80/20)三30分钟，，于30。C静置厌氧培养。观察培养液的颜色变化情况，每隔5~10天取混合均匀的4mL培养液于16mL0.5mol/LHCl溶液中180转/分钟振荡1.5小时，再过滤，采用邻菲罗林法给滤液中的Fe(ll)显色，采用紫外分光光度计在510nm处测定Fe(II)的含量，并以不加菌的培养液为对照，验证菌株的铁还原能力。Fe(II)含量变化Fe(II)含量变化见表5，Fe(II)含量单位为mg/L，表示每升样品中所含Fe(II)的毫克数。由表5可知，体系中Fe(n)的生成量明显高于不加菌的对照，说明该菌对晶型结构很好的赤铁矿也有还原作用。表5尸.^g/omeraraMFC3以葡萄糖为电子供体还原赤铁矿过程中Fe(n)产生动态(单位mg/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例6成团泛菌MFC3以葡萄糖为电子供体对AQDS的还原活性培养基E配方每升去离子水中含AQDS0.412g，NaHC032.5g，NH4Cl0.25g，NaH2PO4.2H2O0.678g，KC10.lg，葡萄糖l.Og，维生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(维生素溶液和微量元素溶液成分同实施例1所述分离培养基)，于12rC灭菌20分钟，葡萄糖单独灭菌，灭菌后与其它成分混合。制备细菌悬浮液用接种环挑取一环活化的菌株于200mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于摇床中(3(TC，180转/分钟)培养16小时，使细菌数量达到指数生长期，8000转/分钟离心收集菌体，倒去上清液，将沉淀下来的菌体悬浮于200mL培养基E中，制成菌悬液。接种细菌悬浮液于培养基E中，使其菌数达到108CFU/mL,然后鼓充高纯混合气体(N2/CO2=80/20)，鼓气时间不少于30分钟，于3(TC静置厌氧培养。观察培养液的颜色变化情况，24小时培养液颜色呈橙黄色时取样，在厌氧工作站中用0.22jjm细菌滤器过滤培养液(把菌体等沉淀滤掉)，用紫外分光光度计(波长450nm处)测定还原态AQDS的含量，还原态AQDS含量变化(单位mmol/L)见表6。由表6可知，成团泛菌在24小时内可以将72%的AQDS还原(AQDS的初始浓度为1mmol/L)，表明该菌对AQDS的还原能力很强。表6尸."gg/omeraraMFC3以葡萄糖为电子供体还原AQDS过程中，<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>权利要求1、一株成团泛菌CGMCCNo.2453。2、权利要求1所述的成团泛菌CGMCCNo.2453在铁氧化物还原和腐殖酸还原中的应用。全文摘要本发明公开了一株成团泛菌及其应用，本发明同时公开了所述成团泛菌的筛选方法。本发明从广东肇庆古森林土壤样品中分离纯化得到一株成团泛菌(PantoeaagglomeransMFC3)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC2453，其具有较强的Fe(III)或腐殖酸还原能力，并具有以下优点电子利用谱广；能还原结晶度较高的铁氧化物；筛选方法简单，具有工业化生产的可能性。文档编号C12P9/00GK101353635SQ20081019845公开日2009年1月28日申请日期2008年9月11日优先权日2008年9月11日发明者周顺桂,莉庄,李芳柏,武春媛,王跃强申请人:广东省生态环境与土壤研究所