专利名称：一株甘蔗内生固氮泛菌属细菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及ー株具有固氮作用及拈抗病原真菌的甘蔗内生固氮泛菌属细菌。
背景技术：
农业微生物资源是生命科学资源宝库的重要组成部分，是微生物保藏菌种库源，又是微生物开发利用的源泉，充分发挥农业微生物资源宝库的作用，积极发掘新的生防微生物资源是农业微生物资源开发研究的重要内容。内生固氮菌是指那些定殖在植物内部与宿主植物联合固氮的微生物，主要是细菌，它们的部分或整个生活周期寄居在植物组织特别是营养繁殖的组织中生存、繁衍、传播而不会对植物引起明显的损害。对内生固氮菌最早的认识来自于禾本科作物和牧草。如20世纪80年代末以来，D6bereiner实验室先后从甘鹿体内分尚得到几种具有特殊生理生化特性的固氮菌，包括 Gluconacetobacter(Acetobacter；diazotrophicus, Herbaspirillum seropedicae,Herbaspirillum rubrisubalbicans 和 Burkholderia spp.。在巴西之后，这些属的固氮菌相继从美洲其他国家、澳洲和亚洲种植甘蔗的体内被分离。在亚洲，这些属的固氮菌已在印度、菲律宾和日本等国种植的甘蔗体内被分离。近年国内外的研究者先后对不同地域的甘蔗、水稻、小麦、燕麦、玉米、大麦、高粱、甘薯及卡拉草等植物中的内生固氮菌进行了分离研究。研究证明，内生固氮菌避免了化合态氮的抑制及土著微生物的竞争，更有利于充分发挥固氮效能，分泌固氮产物直接供给植物吸收，表现出更高的固氮效率。近年来，大量施用化肥造成的肥料浪费及土壌、地下水体污染已引起了世界各国的广泛重视。減少化肥施用，提高氮肥利用率是当前农业生产的重要任务。利用生物固氮是减少氮肥施用量最为有效的途径，生物固氮资源的研究、开发和利用在我国农业可持续发展中占有重要地位。植物内生固氮菌除了能为宿主提供氮素以外，还同时具有分泌生长素、溶磷、增强植株抗病性、抗逆境等多方面的促进植物生长的作用。因此，联合(内生)固氮菌是ー类非常有发展前景的农业微生物资源，充分发挥联合固氮菌的固氮促生长及抗病性能，对农业可持续发展具有重要意义。据相关资料统计，全球毎年因病害导致的大田农作物减产达20%，严重为害时可达可造成50%的损失，甚至绝收。目前，控制植物病害的主要手段是使用化学杀菌剂，但它在作物中以及环境中的残留毒性对人类健康有潜在危险，已成为全社会关心的问题。随着科学技术的不断发展进步，減少使用化学农药，保护人类生存环境的呼声日益高涨，且早已引起人们的高度重视。为了保护环境，维护生态平衡和人类健康安全，开发和使用具有生防作用的农业微生物资源已成为现代农业发展的ー个方向。目前已发现联合固氮菌的宿主植物大多为具有重要价值的作物如甘蔗、水稻、小麦、玉米、牧草等不能自主固氮的禾本科植物。针对长期単一施用化学肥料带来的土壌肥力下降，农产品品质下降和农业环境污染加剧等一系列对农业可持续发展的负面影响，积极发掘和利用联合固氮作用的潜力对农业可持续发展更具特殊的意义。广西是我国最大的蔗糖生产产区，甘蔗及蔗糖产量占全国60%以上。但是，一直以来我国甘蔗生产成本高，缺乏国际竞争力。在甘蔗生产的各项农资投入中，化肥尤其是氮肥所占比重最大，其对甘蔗产量的影响也最为显著。此外，我国甘蔗主产区蔗地90%以上为旱坡地，土壌保水、保肥能力差，化肥利用率很低。近年来，甘蔗生产上受到各种病害的危害，特别是甘蔗黑穗病、宿根矮化病、凤梨病、赤腐病等的普遍发生也成为蔗糖产业发展的重要限制因子。因此，充分发挥蔗地生态系统中联合固氮菌的固氮及拈抗病原菌等促生潜力，对提高我国甘蔗的生产能力，保护和改善甘蔗的生态环境，促进经济可持续发展具有重要的经济和社会意义。因此 ，分离筛选具有促进甘蔗生长及拈抗病原真菌的内生固氮菌，可为甘蔗生产上实现节肥減耗、加强甘蔗生态系统的良性循环提供科学基础和技术支持。
发明内容
本发明目的是提供一株具有高效联合固氮及拈抗病原真菌性能的甘蔗内生固氮菌，同时开发该内生固氮细菌的应用。本发明采取的技术方案本发明所述的甘鹿内生固氮菌属于泛菌属(Pantoea sp.)细菌,该菌株已于2011年11月3日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为 CGMCC No. 5438。该菌株由甘蔗茎部组织分离获得，通过无氮培养基筛选、固氮酶活性測定、固氮酶基因nifH扩增及序列分析，确定其为甘蔗内生固氮菌，含有固氮酶基因nifH，菌株与甘蔗组培苗的联合固氮效率为12.85%。经菌株形态、16S rDNA序列分析、Biolog系统分析，把该菌株鉴定为肠杆菌科泛菌属Pantoea sp.细菌。菌株命名为NN08200，其最适生长温度为28-30°C，最适生长pH为7 8。该菌对甘蔗、玉米幼苗的生长具有显著的促进作用，并且对甘蔗黑穗病菌(Ustilago scitaminea SycL )、甘Ik凤楽病菌[Ceratocystis paradoxa(Dode；Moreau] >甘鹿赤腐病菌(Colletotrichum Falcatum)、甘鹿虎斑病菌(Rhizoctonia solani Kiihn)、玉米大斑病菌[Exserohilum turcicum (Pass. ) Leonard et Suggs]、玉米小斑病菌[Cochliobolus heterostrophus (Drechsler)Drechsler]等多种重要真菌性病害的病原菌具有较强的拈抗作用。本发明的有益效果本发明所述的泛菌属(Pantoea sp.)细菌菌株NN08200,保藏号CGMCC No. 5438,能显著促进植物生长并且拈抗多种植物病原真菌。利用该菌接种甘蔗组培苗50d后植株干重和总氮含量分别比空白对照增加了 46. 74%和41.5%，固氮效率为12. 85% ;接种菌株NN08200的玉米幼苗地上部分干重比对照增加74. 5%，地下部分増加84.6%，株高比对照增加16. 3%，叶绿素含量增加了 29.2%，含氮量增加了 27.0%。本发明所述的Pantoea sp.菌株具有联合固氮、分泌生长素等促植物生长的作用，同时能拈抗多种重要植物病原菌，利用平板对峙法检测抑菌试验结果表明NN08200对引起甘蔗虎斑病的立枯丝核菌(R. Solani)生长的抑制效果达86. 9%，对甘蔗黑穗病菌(U. scitaminea)的抑制率达78. 4%。本发明菌株可应用于生产具有促生及抑制植物病害的固氮微生物菌剂和生物有机月巴，对于減少化肥农药的使用、保护生态环境具有重要意义，并有广阔的应用前景。
图I接种菌株NN08200对甘蔗生长的促进作用。图2接种菌株NN08200对玉米幼苗生长的促进作用。图3菌株NN08200对玉米小斑病菌的抑制作用。图4菌株NN08200对甘蔗虎斑病菌(立枯丝核菌)的抑制作用。图5菌株NN08200分泌IAA特性的比色反应。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明。实施例I本发明菌株的分离取甘蔗蔗茎，在超净工作台上先用70%酒精浸30s，无菌水洗3次，再用0. 1%升萊浸Imin, 70%酒精浸30s,无菌水洗5次。称取Ig表面灭菌的组织块浸于IOmL磷酸盐缓冲液在无菌的研钵中研碎后静置5min，取上清液用无菌水做10倍系列稀释，分别取原液和稀释液100 y L铺在Ashby无氮培养基(成份为蔗糖10g，NaCl 0. 2g，KH2PO4O. 2g，MgSO4 7H200. 2g, CaSO4 2H20 0. lg, CaCO3 5g，蒸馏水 IOOOmL, pH 7. 0)平板上，在 28°C培养2-3d至长出单菌落。菌落长出后，在Ashby无氮培养基平板上用划线法进行菌种纯化。实施例2本发明菌株的固氮酶活性采用こ炔还原こ烯法(acetylene reduction assay, ARA)测定固氮酶活性。将NN08200活化后在Ashby液体培养基中生长48h，取ImL菌液接种于灭菌的含IOmL Ashby液体培养基的60mL磨ロ小口瓶中，培养24h后从瓶内抽出5mL气体，然后再注入5mL乙炔气体，继续培养24h，用气相色谱仪检测こ烯生成量，以nmolC2H4/h. mL表示固氮酶活性。以巴西甘鹿内生固氮菌G. diazotrophicusPAL5为阳性对照，以接种ImL灭活菌液的处理作为空白对照。实验结果表明，本发明菌株的固氮酶的こ炔还原こ烯活性约为2445nmol C2H4/h,高于阳性对照巴西甘鹿内生固氮菌模式菌株G. diazotrophicus PAL5的固氮酶活性1675nmolC2H4/h。实施例3本发明菌株的nifH基因及16S rDNA的克隆分析PCR扩增模板的制备将菌株NN08200活化后接种到LB液体培养基(成分为胰蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化钠10g，蒸馏水lOOOmL，pH 7. 0)，培养20h后离心收集菌体备用。用细菌基因组DNA提取试剂盒，按产品说明书从新鲜的细菌LB培养物中提取本发明菌株的基因组DNA，保存于-20°C，DNA含量约为50_100ng/ UしnifH 基因分析扩增引物为 PolyF(TGCGAYCCSAARGCBGACTC)和PolyR(ATSGCCATCATYTCRCCGGA), PCR 反应程序为94°C 3min 预变性，然后进行 94°C lmin,55°C lmin，72°C lmin，30个循环，最后72°C IOmin0 PCR扩增产物进行I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。以固氮葡糖醋酸杆菌G. diazotrophicusPAL5菌株(Gillis et al. , 1989)为阳性对照，以大肠杆菌E. coli DH5 a菌株为阴性对照。将nifH扩增产物回收以后克隆到T载体上，按宝生物工程(大连)有限公司(简称TaKaRa)的pMDTM18_T Vector克隆试剂盒说明来操作。经PCR验证的阳性克隆送上海生エ生物工程公司测序，测序结果在GenBank登录和比对分析。
菌株的16S rDNA序列分析利用细菌16S通用引物27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和 1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)扩增细菌的 16SrRNA基因。PCR 反应程序为94°C 3min 预变性，然后进行94°C 55s, 50°C 50s, 72°C lmin，35个循环，最后72°C IOmin0 PCR扩增产物进行I. 2%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物回收以后克隆到T载体上，选择阳性克隆送上海生エ生物工程公司测序，测序结果在GenBank登录和比对分析。nifH PCR扩增得到的片段测序后发现本 发明菌株含有钥铁固氮酶铁蛋白基因nifH序列；16S rDNA序列分析结果表明本发明菌株与泛菌属(Pantoea sp.)细菌的同源性
最闻98 % o实施例4本发明菌株的Biolog鉴定在LB平板活化菌株，挑取单菌落至BUG琼脂培养基平板，30°C，培养16_24h。用无菌棉签将BUG琼脂培养基平板上的菌体悬浮于0. 85% NaCl溶液，调节菌悬液OD6tltl为0. 2，取150ii L菌液加入Biolog-GN2板的96孔，30°C培养。分别在4_6h和16_24h用BIOLOG微生物自动鉴定仪及Biolog Microstation 4. 20. 05系统检测和分析代谢指数。Biolog微生物鉴定系统检测显示本发明菌株的碳源代谢谱与Pantoeaagglomerans°综合菌株的菌落形态、Biolog鉴定、nifH基因及16S rDNA的序列分析结果，将本发明菌株鉴定为肠菌科泛菌属(Pantoea sp.)细菌。实施例5用Salkowski比色法测定NN08200菌株分泌IAA的能力配制S2比色液将4. 5gFeCl3溶于300mL蒸馏水，然后缓慢加入587. 4mL 98%H2SO4，待冷却后定容至1L，测定IAA范围5 200mg/L。将NN08200菌株接种在LB液体培养基中培养16h(28°C、120r/min)后，用无菌水调节0D600值为0. 05，取NN08200菌悬浮液100 u L分别接到不含色氨酸的King培养液(成分为蛋白胨20g，磷酸氢ニ钾I. 5g，硫酸镁I. 5g，蒸馏水lOOOmL，pH 7. 0)和含有100mg/L色氨酸的King培养液中，重复4次，以加IOOii L无菌水的培养液为空白对照，一起置于28°C、转速为120r/min的控温振荡器中培养12d。分别取NN08200菌悬液和空白对照50 y L各加A 50 u L S2比色液，置室温下静置，15min内观察其颜色变化，4个重复均变红为阳性，表示能分泌IAA，顔色越深表示分泌数量多；4个重复均不变色为阴性，表示不分泌IAA。测定结果见图5，表明NN08200菌株分泌IAA的能力较强。实施例6本发明菌株对多种植物病原真菌的拈抗作用采用平板对峙法，在培养皿中央接种病原菌菌饼，离该菌饼约3cm处，用接种环沾取培养48h的本发明菌株，在平板对称两测各划一条约3cm的细线，正放于28°C培养，以仅接种病原菌的平板为对照，重复3次。待对照长满全皿时测量病原菌菌落生长直径，计算本发明菌株对病原菌生长的抑制率。见图3、图4。试验结果表明，本发明菌株对甘鹿黑穗病菌(Ustilago scitamineaSyd.)、甘鹿凤梨病菌(Ceratocystis paradoxa (Dode) Moreau)、甘鹿赤腐病菌(Colletotrichum Falcatum)、甘鹿虎斑病菌(Rhizoctonia solani Kiihn)、玉米大斑病M [Exseronilum turcicum (Pass.) Leonard et Suggs]、玉米小斑病囷[Cocnliobolusheterostrophus (Drechsler)Drechsler]、甘庶虎斑炳隹(Rhizoctonia solani Kiihn)均具有较强的抑菌作用，抑制率达到72. 5 86. 9% (表I)。甘蔗内生固氮细菌Pantoea sp.对甘蔗的促生作用及其具有拈抗多种甘蔗重要真菌性病害的功能在国内属首次报道。表I菌株NN08200对多种植物病原真菌的拈抗作用
供试植物病原菌抑菌率(％)
甘鹿黑穗病菌U. scitaminea78.权利要求
1.一株甘鹿内生固氮泛菌属细菌，该菌属于泛菌属Pantoea sp. NN08200,含有固氮酶基因nif H，菌株与甘蔗组培苗的联合固氮效率为12.85%。
2.菌株NN08200在促进植物生长中的应用。
3.菌株NN08200对多种植物病原真菌具有较强拈抗活性，应用于生产具有促生及抑制植物病害的固氮微生物菌剂和生物有机肥。
全文摘要
本发明涉及一株甘蔗内生固氮细菌及其应用，该菌株分类命名为泛菌属细菌Pantoea sp.NN08200，保藏编号为CGMCC No.5438。本发明菌株能显著促进植物生长并且拈抗多种植物病原真菌。利用该菌接种甘蔗组培苗50d后植株干重和总氮含量分别比空白对照增加了46.74％和41.5％，固氮效率为12.85％；接种菌株NN08200的玉米幼苗地上部分干重比对照增加74.5％，地下部分增加84.6％，株高比对照增加16.3％，叶绿素含量增加了29.2％，含氮量增加了27.0％。该菌株具有联合固氮、分泌生长素等促植物生长的作用，可应用于生产具有促生及抑制植物病害的固氮微生物菌剂和生物有机肥。
文档编号C05F11/08GK102732443SQ201210010289
公开日2012年10月17日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者史国英, 李杨瑞, 林丽, 胡春锦, 魏源文 申请人:广西壮族自治区农业科学院微生物研究所