专利名称：一种快速筛选香蕉抗枯萎病的方法
技术领域：
本发明属于一种快速筛选香蕉抗枯蒌病的方法。
背景技术：
香蕉作为世界重要水果之一，年产量达10400万吨(FAO， 2004)。我 国的香蕉生产近年来发展迅猛，到2004年全国栽培面积达26.96万hm2， 总产量达642万吨，居全球第五，是我国南方产量最大的水果，香蕉业已 成为我国热区农业中的支柱产业，但是由于目前香蕉栽培种抗性差，全球 香蕉产业深受枯萎病(又称巴拿马病)的危害，其病原菌为古巴尖镰孢菌 (Fusarium oxysporum f.sp cuberse (E.F.Simth) Snyder .et hansen)， 是一种 具毁灭性的检疫性病害，特别是该病原菌4号生理小种，能够浸染所有的 香蕉种类，为毁灭性病害。以广东为例，1995年报道该病在广东危害香蕉 栽培种面积约1.4 hm2;而在2002年，发病面积猛增到1.4万hm2， 2003 年则增加到2.0万hm2。目前有枯萎病发生的蕉园里第一年发病率为10%， 第二年发病率为20% 30%，第三年发病率达70%以上，遭此危害的蕉田 基本上不能继续种植香蕉。香蕉感染枯萎病后，当前没有任何药剂可以防 治，因此香蕉祜萎病已使得台湾、广东等地部分香蕉园毁灭，造成极大的 经济损失。因此蕉农只有选择抗枯萎病的香蕉品种进行种植，才能防止香 蕉枯萎病的发生。由于目前还没有找到一种有效的防治香蕉枯萎病的化学 药剂，采用种植抗病品种、与水生作物轮作和生物防治是当前防治香蕉枯 萎病比较有效的途径，但是香蕉试管苗市场管理较为混乱，许多不是抗病 品种被不法商以抗病品种出售，最后造成蕉农经济损失。而且在没有水田 的地区，香蕉与水生作物轮作是不可能的。
本发明的目的是提供一种快速筛选香蕉抗枯萎病的方法，分别筛选和 制备两对特异性引物，以待检测的香蕉植株的基因组DNA为模板，通过 PCR扩增的方法能快速地鉴定出抗香蕉枯萎病植株和易感枯蒌病植株，经过多次实验结果表明，其检测的准确率达100%。为蕉农选择种植抗枯蒌病
香蕉品种进行种植提供了有效的保证。
本发明包括如下步骤
(1) 香蕉基因组DNA的提取
称取0.5g香蕉根尖或者叶片，加入0.01-0.02克聚乙烯吡咯环酮，快 速在液氮中研磨成粉末状；将粉末转入65 'C预热的4 mL3%CTAB提取液 中(CTAB提取液2% CTAB， lOOmmol L1 Tris漏Cl (pH8.0)， 1.4 mol L" NaCl， 20 mmol I/1 EDTA(pH8.0)， 20/(^巯基乙醇)，同时加入20 pL10 mg mL'1的 蛋白酶K，摇匀后65 t:水浴60min，期间不断轻轻摇动离心管；冷却后， 加入l/3体积5molL"的KAc溶液，混匀后冰浴20 mhi;加入等体积的氯 仿/异戊醇(24:l)，混匀后，在4'C条件下12,000 rpm离心10min;上清液 转移到新的离心管中，向上清液中加入2/3倍体积预冷的异丙醇，充分混 匀，-20°。沉淀111后，在4'C条件下用12,000 rpm离心15min;弃上清， 加入1 mL75。/。乙醇洗涤两次，4'C， 12,000 rpm离心5 min;弃上清，在通 风橱中风干沉淀物，加入500 fiLTE缓冲液(含10吗.mr1的RNase)溶解， 55'C水浴30min;取上层液相，加入2倍体积预冷的无水乙醇沉淀DNA， 在4'C条件下12,000 ipm离心15 min;弃上清，75°/。乙醇洗涤沉淀，在4 'C 条件下12,000 rpm离心15 min，弃上清，置超净工作台中倒置于吸水纸上 晾干，DNA干燥后，用50-10(HiL的TE溶解沉淀；用0.8%琼脂糖凝胶电 泳检测提取DNA的质量，同时用紫外分光光度计检测DNA浓度，然后 -20'(:分装保存备用；
(2) PCR检测所用两对引物的序列_
OPU10F 5，-ACCTCGGCACTCGAAGACACAT-3，~~
OPU10R 5，-ACCTCGGCACTATTACCCATCAT-3， OPS09F 5'-TCCTGGTCCCAGTACAAATAC-3， OPS09R 5，-TCCTGGTCCCTCTGAATTTTC-3，
这两对引物序列设计好以后，由上海生工生物公司进行合成，得到引 物后，用dd水配成10倍的母液，使用时按要求进行使用； (3) PCR扩增反应条件分别利用两对特异引物OPU10F和OPU10R， OPS09F和OPS09R对抗 病品种'威廉斯芽变'和感病品种'威廉斯'香蕉基因组进行PCR扩增，反应 体系为2.5 pL 10xbuffer， 0.4 jiL25 mmol丄-1 MgCl2, 1.0 |iL 2.5 m mol丄1 dNTP， lULATaqDNA聚合酶，1.0^110fimoW/1引物，20ng模板DNA， 最后加入16 ddH20补足到25 jiL的总反应体积;然后在PCR仪上反应， PCR反应程序为，94'C预变性5 min，然后94'C变性40 S，38 。C退火1 min， 72 。C延伸90 S ,循环35次，72 。C 10 min;取10 PCR反应产物与2 jiL 上样缓冲液混匀，点入含EB的1.2%琼脂糖凝胶中，在5Vcm"条件下电 泳1 h后，把琼脂糖凝胶转移到FX自动成像系统(BIORAD公司)进行拍照， 从扩增的产物中就可以快速地确定所有检测的待测株是否能抗香蕉枯萎 病。
本发明以香蕉基因组为模板，用两对特异引物分别对其基因组进行 PCR扩增，都能从抗病品种中扩增出特异DNA片段，而感病的香蕉品种则 不能扩增出目的片段。这项技术通过一次实验同时用两对特异引物分别进 行PCR扩增，扩增结果可以相互验证，能有效地消除PCR假阳性的现象， 检测过程快速简单，结果可靠，从而能快速地鉴定出抗香蕉枯蒌病植株和 感枯蒌病香蕉植株。经过多次实验结果表明，这种方法对香蕉抗枯萎病的 检测的准确率达100%。为蕉农选择抗香蕉枯萎病品种进行提供了可靠的保 证。
图1是本发明用OPU10F和OPU10R引物对'威廉斯'和'威廉斯芽变'基 因组扩增结果图2是本发明用OPS09F和OPS09R引物对"威廉斯芽变"和"威廉斯" 基因组扩增结果图3是本发明利用OPU10F和OPU10R在"金手指"和"威廉斯芽变" 和其它四个感病品种中的扩增结果图4是本发明OPS09F和OPS09R在四个感病品种、"威廉斯芽变"和"金 手指"中的扩增结果图5是本发明利用OPU10F和OPU10R对"威廉斯芽变"组培苗检测 结果图；图6是本发明利用OPS09F和OPS09R对"威廉斯芽变"组培苗检测结 果图。
具体实施方式
实施例l
分别用OPU10F和OPU10R、 OPS09F和OPS09R两对引物都能从抗香蕉 枯蒌病品种"威廉斯芽变"4个植株中通过PCR反应，扩增出约为1800bp 的DNA片段，而在感染病品种"威廉斯"4个植株中则无此片段出现如图l 和图2所示。说明通过利用引物OPU10F和OPU10R、 OPS09F和OPS09R对香 蕉基因组进行PCR扩增，能够准确地从香蕉植株中筛选出抗香蕉枯萎病品 种，此目的带的出现也可作为香蕉抗枯蒌病抗品种 一个重要标记。
图l.用OPU10F和OPU10R引物对'威廉斯'和'威廉斯芽变'基因组扩 增结果，1,2,3,4是"威廉斯芽变"是抗病品种；5,6，7,8是"威廉斯"是感 病品种。
图2 .用OPS09F和OPS09R引物对"威廉斯芽变"和"威廉斯"基因 组扩增结果，1,2,3,4是"威廉斯芽变"是抗病品种；5,6,7,8是"威廉斯" 是感病品种。
实施例2
将OPU10F和OPU10R， OPS09F和OPS09R引物用于感病品种
('Cavendish'、'大蜜哈，、'巴西蕉，、'野生蕉，)和抗病品种('金手指
Goldfinger，)进行进一步验证。结果表明，用OPU10F和OPU10R这一对
引物在抗病品种'金手指'和"威廉斯芽变"中均稳定扩增出大小相同的目
的片段，而感病的4个品种均不能扩增出目的片段如图3所示；再用
OPS09F和OPS09R在抗病品种'金手指'和"威廉斯芽变"均扩增出目的片
段，但是在金手指中扩增时出现多条泳带，这是可能是由于退火时温度过
低导致的错配现象而造成的如图4所示。实验结果表明，分别用两对引物
相互验证可以直接应用于香蕉抗病枯萎病品种快速检测。
图3利用OPU10F和OPU10R在"金手指"和"威廉斯芽变"和其
它四个感病品种中的扩增结果。
注M是Maricer2000; 1，"金手指"是抗病品种，2，"威廉斯芽变"是
抗病品种；3,4,5,6分别为感病品种("Cavendish"、"大蜜哈"、"巴西蕉"、"野生蕉")
图4 OPS09F和OPS09R在四个感病品种、"威廉斯芽变"和"金手指" 中的扩增结果。
注M是Marker 2000; 1，2,3,4是四个感病品种("Cavendish"、"大蜜 哈"、"巴西蕉"、"野生蕉");5,6是"威廉斯芽变"和"金手指"。 实施例3
随机选取本实验室的40株"威廉斯芽变"组培材料，分别利用OPU10F 和OPU10R， OPS09F和OPS09R引物，对其组培苗是否也能抗香蕉枯萎病 情况进行分析。用两对引物分别检测到在40株"威廉斯芽变"幼苗，结果 表明有39株苗都能扩增出目的片段。在组培苗中有一株可能发生了变异， 导致基因组中目的片段的缺失，所以扩增不出目的片段。
同时对这40株组培苗进行接种枯萎病4号生理小种病菌后，再种植在 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所香蕉园内(广东湛江)，在香蕉苗 种植后整个生育期间没有枯萎病的发生。因此从本实验结果看，利用这两 对引物进行检测后再种植，能保证检测到的香蕉苗抗枯萎病植株不感染枯 蒌病，所以这种快速的检测方法是切实有效的。
图5利用OPU10F和OPU10R对"威廉斯芽变"组培苗检测结果。 注M是Marker 2000; 140是是"威廉斯芽变"组培苗，其中第六个植 株发生了变异，PCR结果为阴性，其他39株均为阳性。
图6利用OPS09F和OPS09R对"威廉斯芽变"组培苗检测结果。 注M是Marker 2000; 140是是"威廉斯芽变"组培苗，其中第六个植 株发生了变异，PCR结果为阴性，其他39株均为阳性。
所需要的仪器和药品在国内的的生物试剂公司均有公幵销售，能很容易 地从市场上购买到。 .
权利要求
1、一种快速筛选香蕉抗枯萎病的方法，其特征是包括如下步骤(1)香蕉基因组DNA的提取称取0. 5g香蕉根尖或者叶片，加入0.01-0.02克聚乙烯吡咯环酮，快速在液氮中研磨成粉末状；将粉末转入65℃预热的4mL3％CTAB提取液中，同时加入20μL10mg mL-1的蛋白酶K，摇匀后65℃水浴60min，期间不断轻轻摇动离心管；冷却后，加入1/3体积5mol L-1的KAc溶液，混匀后冰浴20min；加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，混匀后，在4℃条件下12,000rpm离心10min；上清液转移到新的离心管中，向上清液中加入2/3倍体积预冷的异丙醇，充分混匀，-20℃沉淀1h后，在4℃条件下用12,000rpm离心15min；弃上清，加入1mL75％乙醇洗涤两次，4℃，12,000rpm离心5min；弃上清，在通风橱中风干沉淀物，加入500μLTE缓冲液溶解，55℃水浴30min；取上层液相，加入2倍体积预冷的无水乙醇沉淀DNA，在4℃条件下12,000rpm离心15min；弃上清，75％乙醇洗涤沉淀，在4℃条件下12,000rpm离心15min，弃上清，置超净工作台中倒置于吸水纸上晾干，DNA干燥后，用50-100μL的TE溶解沉淀；用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的质量，同时用紫外分光光度计检测DNA浓度，然后-20℃分装保存备用；(2)PCR检测所用两对引物的序列这两对引物序列设计好以后，由上海生工生物公司进行合成，得到引物后，用dd水配成10倍的母液，使用时按要求进行使用；(3)PCR扩增反应条件分别利用两对特异引物OPU10F和OPU10R，OPS09F和OPS09R对抗病品种‘威廉斯芽变’和感病品种‘威廉斯’香蕉基因组进行PCR扩增，反应体系为2.5μL 10×buffer，0.4μL 25mmol.L-1MgCl2，1.0μL 2.5m mol.L-1dNTP，1U LATaq DNA聚合酶，1.0μL 10μmol·L-1引物，20ng模板DNA，最后加入16μL ddH2O补足到25μL的总反应体积；然后在PCR仪上反应，PCR反应程序为，94℃预变性5min，然后94℃变性40S，38℃退火1min，72℃延伸90S，循环35次，72℃ 10min；取10μL PCR反应产物与2μL上样缓冲液混匀，点入含EB的1.2％琼脂糖凝胶中，在5V.cm-1条件下电泳1h后，把琼脂糖凝胶转移到FX自动成像系统(BIO-RAD公司)进行拍照，从扩增的产物中就可以快速地确定所有检测的待测株是否能抗香蕉枯萎病。
2、 据权利要求职所述的一种快速筛选香蕉抗枯萎病的方法，其特征是 CTAB提取液2。/。CTAB， lOOmmol L" Tris-Cl ， pH8.0， 1.4 mol L" NaCl， 20 mmol L" EDTA ， pH8.0， 2°/<^巯基乙醇。
3、 据权利要求职所述的一种快速筛选香蕉抗枯萎病的方法，其特征是 缓冲液含10叫.mr1的Rnase。
全文摘要
一种快速筛选香蕉抗枯萎病的方法，分别制备两对特异性引物，以待检测的香蕉植株的基因组DNA为模板，通过PCR扩增的方法能快速地鉴定出抗香蕉枯萎病植株和易感枯萎病植株。本发明以香蕉基因组为模板，用两对特异引物分别对其基因组进行PCR扩增，都能从抗病品种中扩增出特异DNA片段，而感病的香蕉品种则不能扩增出目的片段。这项技术通过一次实验同时用两对特异引物分别进行PCR扩增，扩增结果可以相互验证，能有效地消除PCR假阳性的现象，检测过程快速简单，结果可靠，从而能快速地鉴定出抗香蕉枯萎病植株和感枯萎病香蕉植株。经过多次实验结果表明，这种方法对香蕉抗枯萎病的检测的准确率达100％。为蕉农选择抗香蕉枯萎病品种提供了可靠的保证。
文档编号C12Q1/68GK101423870SQ20081019842
公开日2009年5月6日 申请日期2008年9月5日 优先权日2008年9月5日
发明者张秀梅, 李伟才, 尉 王, 胡玉林, 莫亿伟, 谢江辉, 陈佳瑛 申请人:中国热带农业科学院南亚热带作物研究所