防除连作香蕉巴拿马枯萎病的拮抗菌及其微生物有机肥料的制作方法

专利名称：：防除连作香蕉巴拿马枯萎病的拮抗菌及其微生物有机肥料的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于防除连作香蕉巴拿马枯萎病的拮抗菌及其微生物有机肥料，属于农业集约化生产
技术领域：
。二
背景技术：
：自2001年在我国第一次发现连作香蕉巴拿马枯萎病后，该土传连作病害迅速蔓延，目前在我国香蕉主要生产区(海南省、广东省、广西壮族自治区)越来越严重，正在成为香蕉生产的瓶颈。连作香蕉巴拿马枯萎病是由病原真菌(尖孢镰刀菌第4小种)引起的，在连作4茬时就开始出现，连作6茬以后越发严重。如果没有防治该病害的方法与途径，再过5-10年中国就难以生产香蕉，这对中国的香蕉业和人民的生活将产生很大影响。我们的研究结果表明，连作作物枯萎病的关键问题不是养分缺乏或不平衡，也不是土壤次生盐渍化问题，而是土壤中的微生物区系及其次生物质的致毒问题。另一方面，水稻、小麦、玉米、油菜等作物秸秆就地焚烧、规模化养殖后的畜禽粪便随地弃置等不仅严重污染了环境，也极大地浪费了能作为有机肥和生物有机肥产品的原料；大量的养分资源(C、N、P、K、S及微量元素)流失于土壤-植物系统之外，明显地削弱了我国农业可持续发展的能力。如何将从土壤中因作物收获而取走的营养元素最大限度地归还到土壤中去，唯一的途径就是将这些固体有机废弃物制成商品有机肥料再施入土壤。如果将这些固体有机废弃物经过高温发酵合成高品位的有机堆肥，再用于功能菌的载体，所制成的微生物有机肥料功能明确，将会有很好的应用前景。三
发明内容1.技术问题本发明的目的在于提供用于防除连作香蕉巴拿马枯萎病的拮抗菌及其微生物有机肥料，防效高，并且有增产功能，使香蕉连作障碍土壤得到生物修复，确保集约化农业的顺利发展。2.技术方案用于防除连作香蕉巴拿马枯萎病的拮抗菌NJN-6和NJN-ll，均属枯草芽孢杆菌(5flc///^犯6"to)，2009年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，NJN-6菌种保藏号为CGMCCNO.3183，NJN-11的菌种保藏号为CGMCCNO.3184;NJN-6菌株的主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+,细胞为杆状，端生芽孢，兼性厌氧生长，接触酶阳性、氧化酶阴性、V.P.反应阳性，甲基红试验阴性，发酵葡萄糖产酸不产气，发酵果糖产酸产气，不发酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇，可以利用柠檬酸盐，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性;NJN-11菌株的主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞为杆状，端生芽孢，兼性厌氧生长，接触酶阳性、氧化酶阴性、V.P.反应阳性，甲基红试验阳性，发酵葡萄糖、果糖产酸不产气，不发酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇，可以利用柠檬酸盐，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性。用上述防除连作香蕉巴拿马枯萎病的拮抗菌所生产的微生物有机肥料，该微生物有机肥料中含有1X1()S个/g以上的NJN-6和1X1()S个/g以上的NJN-11、全氮含量质量比为4~5%，全氮中质量比90%以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为610%、有机质含量质量比为3035%。所述微生物有机肥料的生产方法，其特征为(1)将权利要求1所述的拮抗菌NJN—6和NJN—11，分别进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为培养液为PDA，pH6.07.0,发酵温度范围3035'C，搅拌速度为180~300转/分钟，发酵时间为48hr.，发酵液的含菌或芽孢量^1X10ie个/ml;所用PDA培养液配制方法为(以配制1L培养基为例)用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min,接着用四层医用纱布过滤，滤液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7.2-7.4，121'C灭菌20min。(2)分别将NJN—6和NJN—11发酵液按50L/吨的量接种到腐熟的猪粪堆肥和菜粕的微生物分解混合物中进行固体发酵，发酵过程中每天翻堆1次，温度不超过50'C，发酵5天，发酵结束后拮抗菌NJN—6和NJN—ll含量均达到lXl()S个/g以上，获得拮抗菌NJN—6的猪粪堆肥固体菌剂、菜粕的微生物分解混合物固体菌剂和NJN—11的两种固体菌剂。所用腐熟的猪粪堆肥发芽指数为98%以上，有机质含量>35%，有机氮含量为1.2-2%，含水量25-30%。(3)按猪粪堆肥、菜粕的微生物分解混合物两类分别将拮抗菌NJN—6固体菌剂和NJN—ll固体菌剂按照体积比l:l混合，获得猪粪堆肥的固体混合菌剂和菜粕的微生物分解混合物的固体混合菌剂；(4)再将猪粪堆肥的固体混合菌剂与菜粕微生物酶解混合物的固体混合菌剂按体积比50-70%:30-50%的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次，最后在温度不超过60'C的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，包装出厂即为能防治连作香蕉巴拿马枯萎病的微生物有机肥。所述微生物有机肥料可专用于巴拿马枯萎病的生物防治。3.有益效果本发明与目前市场上的有机肥料产品相比具有如下优点1)该肥料产品中含有抑制香蕉巴拿马枯萎病原真菌生长的专一性高效菌株NJN-6和NJN-11，其抑制效果非常显著。试验结果表明，香蕉枯萎病的防治率达到80%以上，在已经严重发病(当季发病率15%以上)的田块上，香蕉巴拿马枯萎病可以控制在5%以下(表2)，如果连年这样施用，可以有效控制枯萎病的发生。2)该肥料为有机肥，含有丰富的有机质(3035%)，有机氮含量为4%,而且大部分为氨基酸和小分子多肽。本产品总磷含量为4%,而且生物有效性特别高，使用本产品后能使作物顺利度过苗期磷素敏感期。3)由于是生物菌株制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于蔬菜的无公害生产，农民可以不用或减少其他防治疫病化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于农产品的出口。同时，该微生物肥料还有增产功能，可为农民增加收入。4)该微生物有机肥可以在营养钵使用，也可以在大田使用，不仅具有有机肥的功能，而且其中所含的拮抗菌通过多种生防机制起作用，从而达到防治香蕉枯萎病的效果。四图lNJN-6菌株的拮抗效果图2NJN-ll菌株的拮抗效果图3.NJN-6菌株的盆载拮抗效果(注Tl为化肥对照，T3为含有NJN-6的有机肥)图4.NJN-11菌株的盆载拮抗效果(注Tl为化肥对照，T4为含有NJN-11的有机肥)图5NJN-6菌株和NJN-11菌株混合肥料的盆载拮抗效果(注Tl为化肥对照，T5为同时含有NJN-6和NJN-11的有机肥)五具体实施方式(一)拮抗菌株的分离拮抗菌株的初筛采集香蕉连作田块中健康香蕉的根际土壤，采用PDA+NA加入病原菌尖孢镰刀菌(i^yan'謂0;9^0r謂)第4小种(来自中国普通微生物菌种保藏管理中心)孢子悬液的双层平板初筛拮抗菌株，初筛共获得11株拮抗菌株，将菌种冻干一2(TC保存，用于进一步筛选。拮抗菌株的复筛取初筛后的拮抗菌株和病原菌，在PDA平板上进行对峙试验，进行复筛。用打孔器(5mm)从长满病原菌的平板上挖取一块病原菌菌块至PDA平板中央，置于28'C培养箱中培养。ld(24h)后在PDA平板中央，距病原菌块四周2cm处用灭菌牙签接种待测拮抗菌，28'C培养3~5d，观察测试拮抗菌菌落对病原菌的抑制情况。最终筛选得到菌株NJN-6和菌株NJN-11,NJN-6菌株和NJN-11菌株的拮抗效果分别见图1和图2。(二)拮抗菌株的鉴定NJN-6菌株和NJN-11菌株均鉴定为枯草芽孢杆菌(5a"7/www^'to)。NJN-6菌株的主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞为杆状，端生芽孢，兼性厌氧生长，接触酶阳性、氧化酶阴性、V.P.反应阳性，甲基红试验阴性，发酵葡萄糖产酸不产气，发酵果糖产酸产气，不发酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇，可以利用柠檬酸盐，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性；NJN-11菌株的主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+,细胞为杆状，端生芽孢，兼性厌氧生长，接触酶阳性、氧化酶阴性、V.P.反应阳性，甲基红试验阳性，发酵葡萄糖、果糖产酸不产气，不发酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇，可以利用柠檬酸盐，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性。(三)菌剂生产(1)将拮抗菌NJN—6和NJN—11，分别接种到PDA培养液进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为pH6.07.0，发酵温度范围2437'C，搅拌速度为180300转/分钟，发酵时间为48hr.，发酵液的含菌或芽孢量^1X10^个/ml;所用PDA培养液配制方法为(以配制1L培养基为例)用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，接着用四层医用纱布过滤，滤液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7.2-7.4，121'C灭菌20min。(2)将NJN—6和NJN—11发酵液按50L/吨的量分别接种到腐熟的猪粪堆肥和菜粕的微生物分解混合物中进行固体发酵，发酵过程中每天翻堆1次，温度不超过50。C，发酵5天，发酵结束后拮抗菌含量均达到1X108个/g以上，获得拮抗菌NJN—6的猪粪堆肥固体菌剂、菜粕的微生物分解混合物固体菌剂和NJN—ll的两种固体菌剂。腐熟的猪粪堆肥发芽指数为98%以上，有机质含量》35%，有机氮含量为1.2-2%,含水量25-30%。其中菜粕的微生物分解混合物制备方法为(公知公用，见发明专利ZL200610086126.0，一种农用氨基酸的生物制取方法及其肥料产品)，菌株37-1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量55-65%和pH6.0-7.5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至5(TC时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50'C共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和pH,使它们分别维持在55-65%和6.0-7.0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物pH调整为5.0左右，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜昨的微生物分解混合物(含氨基酸的混合材料)。(3)按猪粪堆肥、菜粕的微生物分解混合物两类分别将拮抗菌NJN—6固体菌剂和NJN—11固体菌剂以体积比1:1混合，获得猪粪堆肥的固体混合菌剂和菜粕的微生物分解混合物的固体混合菌剂。(4)再将猪粪堆肥的固体单一菌剂、混合菌剂按体积比70%分别与菜粕微生物酶解混合物的固体单一菌剂、混合菌剂按体积比30%的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次，最后在温度不超过6(TC的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，获得能防除连作香蕉巴拿马枯萎病的单菌微生物有机肥(分别含菌株NJN-6、菌株NJN-11)、混合微生物有机肥(含菌NJN-6和NJN-11)。该混合微生物有机肥料(防治香蕉巴拿马枯萎病的专用微生物有机肥)中含有1X1()8个/g以上的NJN-6和NJN-ll、全氮含量质量比为45%,全氮中质量比90%以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为610%、有机质含量质量比为3035%。(四)温室防效试验试验设4个处理Tl-对照，未施用微生物有机肥料；T3-施用单菌微生物有机肥料(含NJN—6菌株)；T4-施用单菌微生物有机肥料(含NJN—11菌株)；T5-施用复合微生物有机肥料(含NJN—6菌株和NJN—11菌株)。微生物有机肥料用量香蕉育苗时按土重的2%施用(育苗时所用的土壤均为健康土壤)，待香蕉长至第5片真叶时将其移栽到香蕉连作土壤中，其中连作土壤中也按土重2%的用量施入。所有处理的氮磷钾用量一致，常规管理。之后观察其发病情况，记录发病率，确认拮抗菌株是否有抑制香蕉巴拿马枯萎病的效果。香蕉苗移栽30天后，发现T1(对照，未施微生物有机肥料)处理有发病植株，再过20天后，Tl处理有80%的植株发病，其它各处理的发病情况不一。香蕉苗移栽50天后的植株发病率和防治率结果如表1所示。盆栽试验结果表明使用含有NJN—6的有机肥(T3)和含有NJN-ll的有机肥(T4)香蕉最终枯萎病的防治率分别为75%和68%(图3、图4)，其中T5-施用复合微生物有机肥料(含NJN—6菌株和NJN—11菌株)效果最好，防治率可以达到87.5%(图5)。表1不同生物有机肥防台香蕉巴拿马枯萎病^力效果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2不同生物有机肥对香蕉连作枯萎病土壤微生物区系的影响处理细菌(个/g土)放线菌(个/g土)真菌(个/g土)Tl1.54X1083.57X1062.3X105T31.49X1096.8X1072.4X104T42.56X1092.87X1076.9X104T52.87X1094.33X1073.1X104注Tl:CK(化肥)；T3:抗香蕉巴拿马枯萎病专性拮抗菌(NJN-6)单菌微生物有机肥；T4:抗香蕉巴拿马枯萎病专性拮抗菌(NJN—11)单菌微生物有机肥；T5:NJN-6和NJN—11菌株混合微生物有机肥；所有供试土壤均为香蕉连作土壤(五)田间试验通过营养钵育苗和移栽大田同时施用防治香蕉巴拿马枯萎病的专用微生物有机肥，微生物有机肥的用量如下营养钵育苗时施用量为1.596，移栽大田时的施用量为每棵1.5kg(折225kg/亩)。结果表明，在已经严重发病(当季发病率15%以上)的田块上，香蕉巴拿马枯萎病可以控制在5%以下(表3)。按照每公斤香蕉4元计算，营养钵育苗和移栽大田同时施用微生物有机肥可使蕉农增收3424元/亩，扣除该微生物有机肥成本投入517.5元/亩，蕉农还可净得2906.5元/亩，使大面积施用这种微生物有机肥料成为可能。表3施用微生物有机肥对防治香蕉枯萎病的影响(海南乐东红湖试验小区)处理枯萎病发生率(%)香蕉产量(kg/亩)增产率(%)对照(营养钵和移栽大田均不施用微生物有机肥)18±2.32505±85营养钵育苗施用微生物有机肥7.8±1.83127±9424.8移栽大田施用微生物有机肥12.1±2.12989±7419.3营养钵和移栽大田均施用微生物有机肥4.5±1.53361±8834.2注抗香蕉巴拿马枯萎病专用微生物有'ft肥的用量:营养钵育苗HS用量为1.5%,移栽大田的施用量为每棵1.5kg(折225kg/亩)本发明专利从微生物区系这一关键问题着手(表2)，研制出一种能显著消除香蕉作物连作巴拿马枯萎病发生的微生物有机肥料产品，生物防治率达80%以上。本肥料产品的作用机制在于本肥料产品中的有效碳和有效氮源给产品中的功能菌微生物区系的培育提供了很好的条件，使之迅速建立外源有益功能菌微生物的生态及其食物链；另一方面，本肥料产品中含有较高含量的有机氮和有机磷，这些营养物质对连作障碍土壤中香蕉作物的生长十分有利，大大提高了香蕉作物的立苗率和抗逆能力。权利要求1.用于防除连作香蕉巴拿马枯萎病的拮抗菌，包括菌株NJN-6和菌株NJN-11，均为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，2009年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，NJN-6菌种保藏号为CGMCCNO.3183，NJN-11的菌种保藏号为CGMCCNO.3184；NJN-6菌株的主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞为杆状，端生芽孢，兼性厌氧生长，接触酶阳性、氧化酶阴性、V.P.反应阳性，甲基红试验阴性，发酵葡萄糖产酸不产气，发酵果糖产酸产气，不发酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇，可以利用柠檬酸盐，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性；NJN-11菌株的主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞为杆状，端生芽孢，兼性厌氧生长，接触酶阳性、氧化酶阴性、V.P.反应阳性，甲基红试验阳性，发酵葡萄糖、果糖产酸不产气，不发酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇，可以利用柠檬酸盐，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性。2、用权利要求1所述用于防除连作香蕉巴拿马枯萎病的拮抗菌所生产的微生物有机肥料，该微生物有机肥料中含有lXl()S个/g以上的NJN-6和NJN-11、全氮含量质量比为45%，全氮中质量比90%以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为610%、有机质含量质量比为3035%。3、权利要求2所述微生物有机肥料的生产方法，其特征为(1)将权利要求1所述的拮抗菌NJN—6和NJN—11，分别接种到PDA培养液，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为pH6.07.0，发酵温度范围3035'C,搅拌速度为180300转/分钟，发酵时间为48hr.，发酵液的含菌或芽孢量》1X10!。个/ml;(2)分别将NJN—6和NJN—11发酵液按50L/吨的量接种到腐熟的猪粪堆肥和菜粕的微生物分解混合物中进行固体发酵，发酵过程中每天翻堆1次，温度不超过5(TC，发酵5天，发酵结束后拮抗菌NJN—6和NJN—ll含量均达到lXl()8个/g以上，获得拮抗菌NJN—6的猪粪堆肥固体菌剂、菜粕的微生物分解混合物固体菌剂和NJN—ll的两种固体菌剂。(3)按猪粪堆肥、菜粕的微生物分解混合物两类分别将拮抗菌NJN—6固体菌剂和NJN—ll固体菌剂以体积比1:1混合，获得猪粪堆肥的固体混合菌剂和菜粕微生物分解混合物的固体混合菌剂；(4)再将猪粪堆肥的固体混合菌剂与菜粕微生物酶解混合物的固体混合菌剂按体积比50-70%:30-50%的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次，最后在温度不超过60'C的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，包装出厂即为能防治连作香蕉巴拿马枯萎病的微生物有机肥。4、根据权利要求3所述微生物有机肥料的生产方法，其中步骤(1)所用PDA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，接着用四层医用纱布过滤，滤液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7.2-7.4，121'C灭菌20min。5、根据权利要求3或4所述微生物有机肥料的生产方法，其中步骤(2)所用腐熟的猪粪堆肥发芽指数为98%以上，有机质质量比含量>35%,有机氮质量比含量为1.2-2%,含水量质量比25-30%。6、权利要求2所述微生物有机肥料的应用。全文摘要本发明涉及用于防除连作香蕉巴拿马枯萎病的拮抗菌及其微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术。本发明分离到了两株拮抗菌NJN-6和NJN-11，接种到腐熟的猪粪堆肥和菜粕的微生物分解混合物中进行固体发酵制成微生物有机肥料，肥料中含有1×10⁸个/g以上的拮抗菌、全氮含量为4～5％(90％以上为有机氮)，总氮磷钾养分为6～10％、有机质含量为30～35％。试验结果表明，香蕉枯萎病的防治率达到80％以上，在已经严重发病(当季发病率15％以上)的田块上，香蕉巴拿马枯萎病可以控制在5％以下，如果连年这样施用，可以有效控制枯萎病的发生。文档编号C12N1/20GK101659934SQ20091018336公开日2010年3月3日申请日期2009年9月18日优先权日2009年9月18日发明者欣何,杨兴明,标沈,沈其荣,黄启为申请人:南京农业大学被以下专利引用(1),