一种从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法，该方法步骤为：对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA；特异性引物的制备；荧光核酸恒温扩增检测技术RealAmp反应；RealAmp标准曲线的构建；结果判断。本发明的一种从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法克服以往基因扩增方法的不足，具有高特异性，灵敏度高、定量检测下限为4.3×10-4ng/μl，易操作，用时短、只需2-3h，不易受污染物的影响且能现场检测土壤样品，也不需要昂贵而精密的温度循环装置、只需能达63℃的恒温装置，分析判断反应产物的方法极为简单，只需肉眼观察即可，又能定量地判别土壤中香蕉枯萎病菌热带4号小种的含量，适宜于广泛地推广应用。
【专利说明】一种从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于香蕉枯萎病菌热带4号小种检测领域，尤其涉及一种从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法。
【背景技术】
[0002]香蕉为芭蕉科芭蕉属植物，是热带亚热带地区重要的经济作物和粮食作物。香蕉枯萎病是香蕉产业的毁灭性病害，严重制约着我国香蕉产业健康发展。
[0003]香蕉枯萎病病原菌为Fusarium oxysporum Schlevht.f.sp.cubense (E.F.Smith)Snyd.&Hans.,曾用名Fusarium cubense E.F.Smith,属于半知菌类,瘤座菌目，镰孢菌属，中文名称为尖孢镰孢菌古巴专化型。该菌分为3个小种。在我国，主要为I号小种和4号小种。I号小种发生历史悠久，可以通过改种Cavendish类香蕉来解决I号小种的危害。4号小种于1996年传入我国，严重危害我国香蕉产业的安全。4号小种又细分为亚热带4号小种和热带4号小种，在我国主要是热带4号小种。
[0004]香蕉枯萎病的传播危害分远距离传播和近距离传播，远距离以病原菌随香蕉组培苗二级苗的调运为主，近距离传播是病原菌在蕉园内随土壤传播蔓延。生产中，迫切需要土壤病原菌快速检测技术，用来检测组培苗二级苗土壤、新开辟蕉园土壤是否带菌以及疑似病株的快速诊断。因此，建立一套香蕉枯萎病病原菌热带4号小种快速、稳定的检测方法是我国香蕉安全生产的重要保证。
[0005] 近年来，有报道证实基于PCR的方法已经成功用于检测香蕉枯萎病病原菌热带4号小种，PCR方法在操作时间上以及检测的特异性和灵敏度方面较常规方法有较大提高，但是，PCR方法必须有精密的温度循环装置，而且它的检测时间也还是比较长(2~3小时)，并且反应过程很容易受污染物的影响，从而使得这种方法不能满足实际检测的需要。因此，需要开发一种灵敏度高并且反应迅速的方法，在一定程度上可以取代PCR的检测方法，而且，普通的PCR方法只能定性检测病原菌的有或无，不能定量检测病原菌的多少，更不能明确土壤中有多少病原菌？因此，将生物技术发展的最新成果应用于香蕉枯萎病病原菌热带4号小种检测，具有重要意义。
[0006]日本学者Notomi等于2000年首次开发了环介导等温核酸扩增反应(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),该技术依赖六条特异引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列，该技术先利用两条内引物和两条外引物，通过链置换作用形成茎环状DNA结构，然后在内引物的作用下通过环介导的自动循环链置换反应大量扩增靶序列，具有特异性强、敏感性高、简便易行等特点。实时突光核酸恒温扩增检测技术(real-time fluorescenceloop-mediated isothermal amplification assay,简称 RealAmp)是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术，可以定量检测病原物，具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定等优点。此外，SYBR Green I是目前LAMP产物最灵敏的检测方法之一，但是在RealAmp中SYBR Green I的加入可能会抑制LAMP的反应效率，因此，在实际操作中普遍采用SYT0-9荧光染料进行RealAmp反应，而把SYBR Green I染色颜色判断结果作为定量检测的一种辅助判断措施。
[0007]该方法通常是按如下步骤进行:步骤一、对被检标本进行预处理，快速提取被检标本的DNA ;步骤二、特异性引物的制备:确定待测标本的靶基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物各一对；步骤三、实时荧光核酸恒温扩增(RealAmp)反应:将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与BstDNA聚合酶混合，在63°C保温1.5小时进行循环链置换反应；步骤四、绘制标准曲线:标准曲线是根据不同稀释的模板浓度与相应的Tt值之间的关系而构建的，X轴表示起始模板浓度的对数值，Y轴表示不同浓度模板扩增达到阈值所用的时间(Tt)。步骤五、分析判断反应产物结果。
[0008]Dita等人通过分析香蕉枯萎病病原菌20个不同营养亲和型的转录间隔区之间的差异，设计了热带4号小种的PCR扩增的特异性引物对FocTR4-F(5' -CACGTTTAAGGTGCCATGAGAG-3' )/FocTR4_R (5' -CGCACGCCAGGACTGCCTCGTGA-3')，扩增片段大小为463bPt)Dita等人所开展的研究内容，仅通过PCR的方法定性地检测香蕉枯萎病病原菌热带4号小种，并非是定量地从土壤中检测。Li等人通过SCAR的方法使用环介导等温核酸扩增技术(LAMP)在中国检测了香蕉枯萎病菌4号小种(Fusarium oxysporiumf.sp.cubense race4),但并未从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌热带4号小种。
[0009]使用Dita等人建立的PCR检测技术，需要提取较高纯度的样品基因组DNA、用时较长，也不能现场检测土壤样品，更不能定量地从土壤中检测病原菌，且需要昂贵而精密的温度循环装置，必须借助电泳仪才能对判别扩增产物的阳性或阴性，成本高，不易操作，需要具有一定技术水平的专业人员才能开展检测工作。Li等人通过环介导等温核酸扩增技术(LAMP)检测了中国的香蕉枯萎病菌4号小种，而未从土壤中检测香蕉枯萎病菌热带4号小种，也没有定量地检测土壤中的病原菌含量，并不能明确土壤中病原菌的含量。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于提供一种从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法，旨在解决传统PCR检测技术需要提取较高纯度的样品基因组DNA、用时较长，不能现场检测土壤样品，不能定量地从土壤中检测病原菌，且需要昂贵而精密的温度循环装置，成本高，不易操作的问题。
[0011]本发明是这样实现的，一种从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法，该从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法包括以下步骤:
[0012]步骤一、对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA ；
[0013]步骤二、特异性引物的制备；
[0014]步骤三、荧光 核酸恒温扩增检测技术RealAmp反应；
[0015]步骤四、RealAmp标准曲线的构建；
[0016]步骤五、结果判断。
[0017]进一步，对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA的具体方法如下:
[0018]被检样品的DNA核酸提取:向0.1g待检测样品中加入300 ill DNA提取液，研磨成糊状后，在95 °C恒温水浴IOmin后，25°C、1000Orpm下离心2分钟，取50iU上清液作为检测模板DNA ；[0019]DNA 提取液包含:100mM Tris_HClpH7.4、1M KClUOmM EDTA 和 2%w/vPVPP。
[0020]进一步，特异性引物的制备参考Dita设计的香蕉枯萎病菌热带4号小种特异性检测引物所获得的463bp片段设计香蕉枯萎病菌热带4号小种的LAMP检测引物，取得RealAmp特异性引物2对，内引物和外引物各一对；
[0021]由两对引物构成的引物混合液，两对引物分别为:外引物FocTR4-F3 即 5 ' -CACGTTTAAGGTGCCATGAGAG-3 '、外引物 FocTR4_B3 即5' -CGCACGCCAGGACTGCCTCGTGA-3'，内引物 FocTR4_FIP 即 5' -ATTCAAGCCGGATTGACGGATTGGATATGTAGAGAATGTGGTGG-3'、内引物 FocTR4_BIP 即 5' -GGGAGCCAAGAAGAAGCAGGACCTTCGATTCTTGTATC-3'，所述外引物FocTR4_F3和所述外引物FocTR4_B3的浓度分别为5pmol/μ I ;所述内引物FocTR4_FIP和所述内引物FocTR4_BIP的浓度均为40ρπιο1/μ I。
[0022]进一步，步骤三荧光核酸恒温扩增检测技术(RealAmp)反应具体如下:
[0023]将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与BstDNA聚合酶混合，在63°C保温90min进行循环链置换反应；
[0024]RealAmp25 μ L反应体系:I μ L抽提的核酸DNA作为模板，2.5 μ LlO X Bst DNApolymerse buffer、1.4mM dNTPs、0.8mM 甜菜喊、8mM MgS04、0.2 μ M 的外引物、1.6 μ M 的内引物、I μ L Bst DNA polymerase, 0.2 μ M SYT0-9荧光染料，补水至25 μ L，然后再加入等体
系的石腊油覆盖整个反应液；
[0025]RealAmp 反应在 ESE-Quant Tube Scanner 上进行，63°C 反应 90min 后 80°C 反应IOmin终止反应；
[0026]RealAmp反应前在反应管内盖上加如I μ L1: 10倍稀释的SYBR Green I荧光染料，待反应结束后瞬时离心将SYBR Green I加入LAMP反应液中进行显色观察；设置阳性对照反应时，用感染HLB的柑橘基因组总DNA代替；设置阴性对照反应时，用IOOmM Tris-HClPH8.0与50mM EDTA代替，将含有配制好的反应溶液的反应管置于63°C反应90min ;反应结束后显示屏上显示扩增曲线，X轴表示扩增时间，Y轴显示荧光值。
[0027]进一步,其特征在于,步骤四RealAmp标准曲线的构建方法如下:
[0028]采用Dita设计的香蕉枯萎病菌热带4号小种Fusarium oxysporium f.sp.cubense Tripical race4，FocTR4 特异性检测引物 FocTR4_F5' -CACGTTTAAGGTGCCATGAGAG-3/ /FOCTR4-R5' -CGCACGCCAGGACTGCCTCGTGA-3'，扩增片段大小为 463bp ;克隆该序列到pMD18-T载体测序正确后的质粒，命名为PMD18-T-TR4，用于构建标准曲线。
[0029]进一步，香蕉枯萎病菌热带4号小种的PCR检测反应体系方法如下:
[0030]2.5 μ LlOXPCR buffer,2y L dNTPs,0.25 μ L Taq 聚合酶，引物 FocTR4_F/FocTR4-R 各 I μ L，I μ L DNA,补水至 25 μ L ；
[0031]PCR反应的条件:94°C预变性3min，94°C变性30s、57°C退火30s、72°C延长60s、进行35次循环；72°C延长7min ；
[0032]反应结束后，取5 μ L反应产物，1%琼脂糖凝胶电泳后EB染色观察结果；
[0033]PCR扩增条带切胶回收连接pMD-18-T载体后测序正确后，将该质粒命名为PMD18-T-TR4，10倍梯度稀释后作为模板用于评估RealAmp的检测灵敏度并由此构建香蕉枯萎病菌热带4号小种的RealAmp的标准曲线。
[0034]进一步，结果判断采用两种方法判断结果，一种是定量检测结果的判断，直接在ESE-Quant Tube Scanner反应结束后,仪器自动根据标准曲线显示定量结果；另外，反应结束后离心将反应管内盖上的SYBR Green I混入到反应液中，采用不开盖显色来判断结果，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。
[0035]本发明的实时突光核酸恒温扩增检测技术(Real-time fluorescenceloop-meidated isothermal amplification assay,简称 RealAmp)是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术，可以定量检测病原物，克服以往第一代LAMP检测方法的不足，具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定等优点，采用不开盖(closed-tube detection technique)不易受污染物的影响且能现场检测土壤样品，分析判断反应产物的方法极为简单，适宜于广泛地推广应用。
[0036]本发明的一种从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法克服以往基因扩增方法的不足，具有高特异性，灵敏度高、定量检测下限为4.3 X 10-4ng/ μ 1，易操作，用时短、只需2-3h，不易受污染物的影响且能现场检测土壤样品，也不需要昂贵而精密的温度循环装置、只需能达63°C的恒温装置，分析判断反应产物的方法极为简单，只需肉眼观察即可，又能定量地判别土壤中香蕉枯萎病菌热带4号小种的含量，适宜于广泛地推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1是本发明提供的从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法流程图。
[0038]图2是本发明实施例提供的香蕉枯萎病病原菌热带4号小种LAMP检测引物设计示意图。[0039]图3是本发明实施例提供的香蕉枯萎病病原菌热带4号小种RealAmp检测的特异性分析；
[0040](A)以香蕉枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense (Foc) ) I 号小种(racel)、亚热带 4 号小种(Subtropical Race4, ST4)、热带 4 号小种(Tropical Race4,TR4)、甜瓜蔓枯病菌(Mycosphaerella melonis)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.cucumerium)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)的 DNA 以及土壤、水为对照用来测试LAMP的特异性(分别对应编号的1-8)，2%琼脂糖凝胶电泳检测各个PCR管的产物，仅模板是FocTR4基因组DNA显示有梯度条带，其余均无梯度条带；“M”MarkerDL5000 ；
[0041](B)使用香蕉枯萎病病原菌热带4号小种的特异性PCR检测引物，扩增“A”中的1-8，仅模板是FocTR4基因组DNA显示有单一条带，其余均无条带；“M”MarkerDL2000 ；
[0042](C)RealAmp检测的显色反应表明，仅模板是FocTR4基因组DNA的显色为绿色(阳性)，其余均为橙色(阴性)；
[0043](D)ESE-Quant Tube Scanner仪器进行RealAmp扩增反应后的扩增曲线仅有I条，相应编号对应的是以FocTR4基因组DNA为模板的PCR管。
[0044]图4是本发明实施例提供的香蕉枯萎病病原菌热带4号小种RealAmp检测的灵敏度及标准曲线；
[0045](A)以包含RealAmp扩增区间的pMD-18-T_TR4质粒DNA为模板，按照10倍梯度系列稀释法将？皿0-18-1'-丁1?4质粒0嫩从4.3\101叩/^1依次稀释至4.3X l(T5ng/μ 1，以无菌水为阴性对照(分别对应编号的1_8)，2%琼脂糖凝胶电泳检测各个PCR管的产物，PMD-18-T-TR4质粒DNA浓度为4.3 X IO1ng/U I~4.3X10_4ng/u I的显示有梯度条带，浓度为4.3 X 10^4ng/U I的梯度条带较弱，其余均无梯度条带“M” Marker DL2000 ；
[0046](B)RealAmp检测的显色反应表明，以pMD_18-T_TR4质粒DNA浓度为4.3 X IO1ng/Ul~4.3 X 10-4ng/U I的显示为绿色(阳性)，其余均为橙色(阴性)；
[0047](C) ESE-Quant Tube Scanner仪器进行RealAmp扩增反应后的扩增曲线有6条，相应编号对应的是以PMD-18-T-TR4质粒DNA浓度为4.3 X IO1ng/ yl~4.3 X l(T4ng/ U I的PCR 管；
[0048](D )以不同浓度的起始模板DNA与相应的Tt值之间存在线性关系而构建的标准曲线。
[0049]图5是本发明实施例提供的香蕉枯萎病病原菌热带4号小种RealAmp检测的田间应用；
[0050](A) ESE-Quant Tube Scanner仪器进行RealAmp扩增反应后的扩增曲线，以浓度为8.6 X 10_4ng质粒DNA为正对照，无菌水为负对照；
[0051](B)依据标准曲线所计算出的每克土壤中的香蕉枯萎病菌热带4号小种的含量。【具体实施方式】
[0052] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0053]图1示出了本发明提供的从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法流程。为了便于说明，仅仅示出了与本发明相关的部分。
[0054]下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0055]步骤一、对被检样品进行预处理，快速提取被检样品的DNA:
[0056]被检样品的DNA核酸提取:向0.1g待检测样品中加入300 ill DNA提取液，研磨成糊状后，在95 °C恒温水浴IOmin后，25°C、1000Orpm下离心2分钟，取50iU上清液作为检测模板DNA。
[0057]DNA 提取液包含:IOOmM Tris-HCl (pH7.4)、IMKCl、IOmM EDTA 和 2% (w/v) PVPP0
[0058]步骤二、特异性引物的制备:参考Dita等人设计的香蕉枯萎病菌热带4号小种(Fusarium oxysporium f.sp.cubense Tripical race4, FocTR4)特异性检测引物所获得的463bp片段设计香蕉枯萎病菌热带4号小种的LAMP检测引物,取得RealAmp特异性引物
2对，内引物和外引物各一对。特异性的463bp的片段包含了整个RealAmp的序列。
[0059]由两对引物构成的引物混合液，两对引物分别为:外引物FocTR4-F3 (5 ' -CACGTTTAAGGTGCCATGAGAG-3 ')、外引物 FocTR4_B3(5' -CGCACGCCAGGACTGCCTCGTGA-3')，内引物 FocTIM-FIPG' -ATTCAAGCCGGATTGACGGATTGGATATGTAGAGAATGTGGTGG-3')、内引物FocTR4_BIP( 5' -GGGAGCCAAGAAGAAGCAGGACCTTCGATTCTTGTATC-3')，所述外引物FocTR4_F3和所述外引物FocTR4_B3的浓度分别为5pmol/U I ;所述内引物FocTR4-FIP和所述内引物FocTR4-BIP的浓度均为40pmol/iil。
[0060]表1香蕉枯萎病病原菌热带4号小种的特异性检测引物[0061]
【权利要求】
1.一种从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法，其特征在于，该从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法包括以下步骤: 步骤一、对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA ； 步骤二、特异性引物的制备； 步骤三、荧光核酸恒温扩增检测技术RealAmp反应； 步骤四、RealAmp标准曲线的构建； 步骤五、结果判断。
2.如权利要求1所述的从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法，其特征在于，对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA的具体方法如下: 被检样品的DNA核酸提取:向0.1g待检测样品中加入300 u I DNA提取液，研磨成糊状后，在95°C恒温水浴IOmin后，25°C、1000Orpm下离心2分钟，取50iU上清液作为检测模板 DNA ；
DNA 提取液包含:IOOmM Tris_HClpH7.4、IMKCl、IOmM EDTA 和 2%w/vPVPP。
3.如权利要求1所述的从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法，其特征在于，特异性引物的制备参考Dita设计的香蕉枯萎病菌热带4号小种特异性检测引物所获得的463bp片段设计香蕉枯萎病菌热带4号小种的LAMP检测引物，取得RealAmp特异性引物2对，内引物和外引物各一对； 由两对引物构成的引物混合液，两对引物分别为:外引物FocTR4-F3即5' -CACGTTTMGGTGCCATGAGAG-3'、外引物 FocTR4_B3 即 5' -CGCACGCCAGGACTGCCTCGTGA-3'，内引物 FocTR4-FIP 即 5 ' -ATTCAAGCCGGATTGACGGATTGGATATGTAGAGAATGTGGTGG-3 '、内引物FocTR4-BIP 即 5 ' -GGGAGCCAAGAAGAAGCAGGACCTTCGATTCTTGTATC-3 '，所述外引物 FocTR4_F3和所述外引物FocTR4-B3的浓度分别为5pmol/ii I ;所述内引物FocTR4_FIP和所述内引物FocTR4-BIP 的浓度均为 40pmol/ii I。
4.如权利要求1所述的从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法，其特征在于，步骤三荧光核酸恒温扩增检测技术反应具体如下: 将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与BstDNA聚合酶混合，在63 °C保温90min进行循环链置换反应； RealAmp25 U L反应体系:I y L抽提的核酸DNA作为模板，2.5 y LlOXBst DNApolymerse buffer、1.4mM dNTPs、0.8mM 甜菜喊、8mM MgS04、0.2 u M 的外引物、1.6 u M 的内引物、Iy L BstDNA polymerase, 0.2u M SYT0-9荧光染料，补水至25 y L，然后再加入等体系的石腊油覆盖整个反应液； RealAmp 反应在 ESE-Quant Tube Scanner 上进行，63°C 反应 90min 后 80°C 反应10min终止反应； RealAmp反应前在反应管内盖上加如Iii L1: 10倍稀释的SYBR Green I荧光染料，待反应结束后瞬时离心将SYBR Green I加入LAMP反应液中进行显色观察；设置阳性对照反应时，用感染HLB的柑橘基因组总DNA代替；设置阴性对照反应时，用IOOmM Tris-HCl pH8.0与50mM EDTA代替，将含有配制好的反应溶液的反应管置于63°C反应90min ;反应结束后显示屏上显示扩增曲线，X轴表示扩增时间，Y轴显示荧光值。
5.如权利要求1所述的从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法，其特征在于，步骤四RealAmp标准曲线的构建方法如下: 采用Dita设计的香蕉枯萎病菌热带4号小种Fusarium oxysporium f.sp.cubenseTripicalrace4, FocTR4 特异性检测引物 FocTR4_F5 ' -CACGTTTAAGGTGCCATGAGAG-3/ /FOCTR4-R5' -CGCACGCCAGGACTGCCTCGTGA-3'，扩增片段大小为 463bp ;克隆序列到PMD18-T载体测序正确后的质粒，命名为PMD18-T-TR4，用于构建标准曲线。
6.如权利要求1所述的从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法，其特征在于，香蕉枯萎病菌热带4号小种的PCR检测反应体系方法如下:
2.5 μ LlOXPCR buffer,2uL dNTPs,0.25 μ L Taq聚合酶，引物FocTR4_F/FocTR4-R各IyL, IuL DNA，补水至 25yL ; PCR反应的条件:94°C预变性3min，94°C变性30s、57°C退火30s、72°C延长60s、进行35次循环；72°C延长7min ； 反应结束后，取5 μ L反应产物，1%琼脂糖凝胶电泳后EB染色观察结果； PCR扩增条带切胶回收连接pMD-18-T载体后测序正确后，将质粒命名为PMD18-T-TR4，10倍梯度稀释后作为模板用于评估RealAmp的检测灵敏度并由此构建香蕉枯萎病菌热带4号小种的RealAmp的标准曲线。
7.如权利要求1所述的从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法，其特征在于，结果判断采用两种方法判断结果，一种是定量检测结果的判断，直接在ESE-QuantTube Scanner反应结束后，仪器自动根据标准曲线显示定量结果；另外，反应结束后离心将反应管内盖上的SYBR Green I混入到反应液中，采用不开盖显色来判断结果,如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。
【文档编号】C12Q1/68GK103740806SQ201310545700
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】蒲金基, 张贺, 张欣, 彭军, 漆艳香, 谢艺贤, 喻群芳, 张辉强 申请人:中国热带农业科学院环境与植物保护研究所