专利名称：香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶的提取纯化方法
技术领域：
本发明属于植物保护和生物技术领域，特别涉及一种香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶的提取纯化方法。
背景技术：
香蕉镰刀菌枯萎病又称香蕉巴拿马病、黄叶病，是由镰刀菌侵染引起维管束坏死的土传性病害，病原菌为尖镰孢霉古巴专化型[Fusarium oxysporum f.sp.cubense(E.F.Smith)Snyder et Hansen](FOC)病原菌从受伤的根茎侵入，通过寄主维管束向茎上发展，并进一步向假叶部蔓延。当植株枯死后，病原菌随残体遗留在土壤中，随着水流或带菌的农具在蕉园内再进行自然传播，其厚垣孢子可在土壤中存活8～10年。由于该菌存活期长，传播迅速，尚未有防止该病的特效药物，因此一旦在香蕉产地发病，很可能大面积爆发将造成重大损失。
尖镰刀菌古巴专化型有4个生理小种，1号小种(race1)感染香蕉的栽培种“大蜜哈”[Grosmichel(AAA)]及龙牙蕉(MusaAAB)，矮蕉[Dwarfcavendish(AAA)]较抗病，该小种呈世界分布，在中国大陆已有记录；2号小种(race2)在中美洲，仅感染三倍体杂种梭香蕉[Bluggoe(AAB)]，不侵染“大蜜哈”；3号小种(race3)感染野生的羯尾蕉属(Heliconia)；4号小种(race4)能感染几乎所有的香蕉种类，如Cevendish、“大蜜哈”、矮香蕉、野蕉(BB)和梭指蕉，毁灭性最大，在全世界范围内尚未找到有效的抵抗4号小种的香蕉品种。
香蕉枯萎病侵染时间长，没有有效的农药和防治措施，品种抗病性成为一个重要的控病方法。但是，由于对病害的侵染过程缺乏深入的研究，目前未见有关香蕉枯萎病的致病性研究报道，对病菌的致病因子没有足够的认识，抗病品种的选取很难取得理想的进展。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供一种香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶的提取纯化方法。该香蕉枯萎病菌致病性内切多聚半乳糖醛酸酶在致病过程中有重要作用，是致病的重要因子。
香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶(PG)的提取纯化方法包括以下步骤(1)将香蕉枯萎病菌4号生理小种接种于诱导果胶酶液体培养基中，振荡培养；于4℃离心除去菌丝，上清液用超滤膜浓缩得粗酶液；(2)粗酶液上样于Sephacry S-100 16/10凝胶层析柱，预先用柱平衡缓冲液平衡柱，用柱平衡缓冲液洗脱，收集洗脱液，测酶活性及蛋白含量；(3)收集步骤(2)中混合酶活性大于粗酶活性25％的洗脱液，浓缩脱盐，测浓缩液酶活性及蛋白含量；浓缩液上样于Sepharose SP XL式16/10强阳离子交换层析柱，预先用柱平衡缓冲液平衡柱，用柱平衡缓冲液配置的0.75mol/L NaCl溶液进行线性梯度洗脱，收集梯度洗脱部分，测PG活性及蛋白含量；(4)收集酶活性大于上样液酶活性25％的洗脱液混合，浓缩脱盐，测浓缩液的酶活性及蛋白含量后，浓缩液上样于Sepharose FF CM弱阳离子交换层析柱，用柱平衡缓冲液配置的0.75mol/L NaCl溶液进行线性梯度洗脱，收集梯度洗脱峰，浓缩脱盐，即为纯化的多聚半乳糖醛酸酶PGC1。
所述浓缩脱盐采用分子量10kDa的超滤离心管。
所述步骤(1)中上清液经分子量10kDa的超滤膜浓缩200倍。
所述步骤(2)中柱平衡缓冲液为pH4.5的0.02mol/L醋酸钠缓冲液、内含0.15mol/L NaCl；所述步骤(3)和步骤(4)中柱平衡缓冲液为pH4.5的0.02mol/L醋酸钠缓冲液。
步骤(2)中用柱平衡缓冲液洗脱1.5倍柱体积，流速2.5mL/min。
步骤(3)线性梯度洗脱30倍柱体积，流速4mL/min。
步骤(4)线性梯度洗脱30倍柱体积，流速0.5mL/min。
所述步骤(2)中粗酶液上样量为2mL；步骤(3)中浓缩液上样量为2mL；步骤(4)中浓缩液上样量为0.5mL。
所述步骤(4)PGC1蛋白N-末端序列为Asp Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr SerGly Leu Ala Thr Ala Val Ser Ser Cys Thr Arg Ile Val。
本发明纯化的多聚半乳糖醛酸酶PGC1是香蕉枯萎病菌4号生理小种的关键致病因子之一，将在香蕉枯萎病的检疫和防治中产生重要作用。
(1)在香蕉枯萎病检测中的应用由于只有香蕉枯萎病菌的4号小种才能分泌PGC1，因此利用纯化的PGC1酶蛋白研制抗体，可对病菌、感病植株、带菌土壤进行血清学检测。
(2)在香蕉抗枯萎病菌的育种上的应用在香蕉组培过程中，加入纯化的PGC1，诱导耐PGC1的愈上组织或筛选出再生植株。对PG1的耐抗性可作为品种抗病性鉴定的一个指标。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果本发明提取纯化方法从香蕉枯萎病菌中提取致病性内切半乳糖醛酸酶，可以作为该病菌的检疫检测的新的指标，并能应用致病性内切半乳糖醛酸酶，制备香蕉枯萎病菌抗血清，以及在筛选和培育新的香蕉抗病品种。
图1为Sephacryl S-100凝胶过滤柱层析图。
图2为Sephacryl S-100凝胶过滤柱层析收集各管的PG活性变化曲线。
图3为Sepharose SP XL 16/10强阳离子交换柱层析图。
图4为Sepharose SP XL 16/10强阳离子交换柱层析收集各管的PG活性变化曲线。
图5为Sepharose CM弱阳离子交换柱层析图。
图6为Sepharose CM弱阳离子交换柱层析收集各管的PG活性变化曲线。
图7为纯化PGC1的IEF-PAGE电泳图谱。
其中71为粗酶液PG同工酶染色；72为经Sepharose CM Hitrap收集的PGC1酶染色；73为经Sepharose CM Hitrap收集的PGC1酶蛋白银染；74为标准等电点(pI3.5-9.5)。
图8为各纯化PGC1步骤的SDS-PAGE电泳银染图谱。
其中1为Sepharose SP XL 16/10收集酶液；2为Sephacryl S-100 16/10收集酶液；3为粗酶液；4为Sepharose CM Hitrap收集酶液；5为低分子量蛋白标准。
具体实施例方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
液体培养基NH4HNO3 1.0g、KCl 0.2g、FeSO4 0.01g、KH 2PO 40.2g、ZnSO4 0.01g、蒸馏水1000mL。Sigma公司生产柑桔果胶5g，羧甲基纤维素钠5g，液体培养基pH值5.0后，于121℃、15磅下灭菌20min。
PG酶活性的测定用pH5.0的0.05mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液配制0.5％的果胶酸溶液，取1mL果胶酸溶液与0.5mL稀释100倍的酶液混合，于45℃水浴锅中反应30min，立即加入DNS试剂0.5mL中止反应，再加入蒸馏水至5mL。在Bakeman分光光度计520nm波长处测定反应混合物的O.D值。测定后，取样品的O.D值平均值在标准曲线查出相应的糖量。对照除加入的PG酶液沸煮10min的失活酶液外，其余操作同上。多聚半乳糖醛酸酶的酶活单位为45℃下每mg酶每分钟催化低物释放1μmolD-半乳糖醛酸量(μmol/mg·min)。
酶蛋白浓度测定按Bradforf方法，用考马斯亮兰G250显色，在595nm下比色测定，用牛血蛋白清作标准曲线。
本发明香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶的提取纯化工艺步骤是-20℃低温保藏的香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株(由广东省农业科学院提供)活化，接种在加有香石竹叶片的PDA平板上，25℃培养7天，用0.7cm打孔器在菌落边缘打下菌片，每个250mL三角瓶盛诱导果胶酶液体培养基100mL，加4个菌片，25℃下，110rpm振荡培养10天。在4℃，16000g下离心20min，取上清液。然后用Millipore公司的Amicon 8400超滤浓缩系统，内含10kDa超滤膜，浓缩约200倍，测多聚半乳糖醛酸酶活性和蛋白含量，保存于-20℃冰箱中备用。
采用Amersham Biosciences的全自动蛋白层析系统AKTA purify HPLC，预先用内含0.15mol/L NaCl，pH4.5的0.02mol/L醋酸钠缓冲液，平衡120mL的Sephacry S-100 16/10凝胶柱，上述粗酶液上样量为2mL，用凝胶柱平衡缓冲液洗脱1.5倍柱体积，流速2.5mL/min，收集4mL/管。检测洗脱液在OD280的吸光值，可见两个蛋白峰A和B，如图1所示。测各管收集液的PG活性表明，15-48收集管中存在PG活性，如图2所示。合并每次层析收集的酶活性大于粗酶液活性25％洗脱液，用Millipore公司的10kDa超滤离心管浓缩脱盐，获得组分BI，测浓缩液酶活性及蛋白含量。
BI每次上样2mL于20mL的Sepharose SP XL 16/10强阳离子交换层析柱中，预先用pH4.5的0.02mol/L醋酸钠缓冲液平衡柱，用pH4.5的0.02mol/L醋酸钠缓冲液配置的0.75mol/L NaCl溶液进行线性梯度洗脱30倍体积，流速4mL/min，收集梯度洗脱部分，4mL/管。经过Sepharose SP XL 16/10强阳离子交换柱层析后，可见一明显的蛋白洗脱峰C，如图3所示。PG活性检测表明，从60-74收集管存在PG活性，如图4所示。合并每次层析收集的酶活性大于BI活性25％洗脱液，经10kDa超滤离心管浓缩脱盐，获得组分CI，测浓缩液酶活性及蛋白含量。
CI每次上样0.5mL于1mL的Sepharose FF CM弱阳离子交换层析柱，用pH4.5的0.02mol/L醋酸钠缓冲液配置的0.75mol/L NaCl溶液进行线性梯度洗脱30倍柱体积，流速1mL/min，收集0.5mL/管，OD280检测为一对称的蛋白洗脱峰D，如图5所示，39-54收集管的有PG活性，如图6所示，收集梯度洗脱峰，合并数次层析的收集洗脱液，经10kDa超滤离心管浓缩脱盐，获得组分DI，进行IEF-PAGE同工酶电泳染色只检测到PGC1，如图7所示，SDS-PAGE电泳显示DI为一条蛋白带，如图8所示，即为达电泳纯的多聚半乳糖醛酸酶PGC1。
各纯化步骤组分析表明，纯化的PGC1酶活性为260.52 Units mg-1.min-1，与培养液相比较纯化了51.59倍，见表1。
表1 PGC1纯化表
超薄层IEF-PAGE电泳后，以标准等电点电泳迁移率作标准曲线的，从曲线中查出PGC1的等电点约为7.85，如图7所示。
用SDS-PAGE电泳，以标准分子量对数为纵坐标，迁移率为横坐标作直线回归图，以回归方程y＝3.1554x2-38.239x+131.33(R＝0.997)计算出PGC1的相对分子量为42.3kDa，如图8所示。
由中国科学技术大学生命科学院协助测定的PGC1酶蛋白N-末端序列为Asp Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu Ala Thr Ala Val Ser Ser Cys Thr ArgIle Val。
香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶的提取纯化方法.ST25SEQUENCE LISTING<110>华南农业大学<120>香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶的提取纯化方法<130>1<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>22<212>PRT<213>Fusarium oxysporum f.sp.cubense<400>1Asp Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu Ala Thr Ala Val Ser1 5 10 15Ser Cys Thr Arg Ile Val20
权利要求
1.一种香蕉枯萎病菌多聚半乳糖醛酸酶的提取纯化方法，其提取纯化方法包括以下步骤(1)将香蕉枯萎病菌4号生理小种接种于诱导果胶酶液体培养基中，振荡培养；于4℃离心除去菌丝，上清液用超滤膜浓缩得粗酶液；(2)粗酶液上样于Sephacry S-100 16/10凝胶层析柱，预先用柱平衡缓冲液平衡柱，用柱平衡缓冲液洗脱，收集洗脱液，测酶活性及蛋白含量；(3)收集步骤(2)中混合酶活性大于粗酶活性25％的洗脱液，浓缩脱盐，测浓缩液酶活性及蛋白含量；浓缩液上样于Sepharose SP XL 16/10强阳离子交换层析柱，预先用柱平衡缓冲液平衡柱，用柱平衡缓冲液配置的0.75mol/L NaCl溶液进行线性梯度洗脱，收集梯度洗脱部分，测PG活性及蛋白含量；(4)收集酶活性大于上样液酶活性25％的洗脱液混合，浓缩脱盐，测浓缩液的酶活性及蛋白含量后，浓缩液上样于Sepharose FF CM弱阳离子交换层析柱，用柱平衡缓冲液配置的0.75mol/L NaCl溶液进行线性梯度洗脱，收集梯度洗脱峰，浓缩脱盐，即为纯化的多聚半乳糖醛酸酶PGC1。
2.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌多聚半乳糖醛酸酶的提取纯化方法，其特征在于所述浓缩脱盐采用分子量10kDa的超滤离心管。
3.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌多聚半乳糖醛酸酶的提取纯化方法，其特征在于所述步骤(1)上清液经分子量10kDa的超滤膜浓缩200倍。
4.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌多聚半乳糖醛酸酶的提取纯化方法，其特征在于所述步骤(2)中柱平衡缓冲液为pH4.5的0.02mol/L醋酸钠缓冲液、内含0.15mol/L NaCl；所述步骤(3)和步骤(4)中柱平衡缓冲液为pH4.5的0.02mol/L醋酸钠缓冲液。
5.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌多聚半乳糖醛酸酶的提取纯化方法，其特征在于步骤(2)中用柱平衡缓冲液洗脱1.5倍柱体积，流速2.5mL/min。
6.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌多聚半乳糖醛酸酶的提取纯化方法，其特征在于步骤(3)线性梯度洗脱30倍柱体积，流速4mL/min。
7.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌多聚半乳糖醛酸酶的提取纯化方法，其特征在于步骤(4)线性梯度洗脱30倍柱体积，流速0.5mL/min。
8.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌多聚半乳糖醛酸酶的提取纯化方法，其特征在于所述步骤(2)中粗酶液上样量为2mL；步骤(3)中浓缩液上样量为2mL；步骤(4)中浓缩液上样量为0.5mL。
9.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌多聚半乳糖醛酸酶的提取纯化方法，其特征在于所述步骤(4)PGC1蛋白N-末端序列为Asp Pro Cys Ser Val Thr AspTyr Ser Gly Leu Ala Thr Ala Val Ser Ser Cys Thr Arg Ile Val。
全文摘要
本发明公开了一种香蕉枯萎病菌多聚半乳糖醛酸酶的提取纯化方法，将粗酶液上样于Sephacry S－10016/10凝胶层析柱，用柱平衡缓冲液洗脱，收集混合酶活性大于粗酶活性25％的洗脱液，浓缩脱盐，浓缩液上样于Sepharose SP XL16/10强阳离子交换层析柱，进行线性梯度洗脱，收集梯度洗脱部分，将酶活性大于上样液酶活性25％的洗脱液混合，浓缩脱盐，浓缩液上样于Sepharose FF CM弱阳离子交换层析柱，进行线性梯度洗脱，收集梯度洗脱峰，浓缩脱盐。本发明提取纯化方法从香蕉枯萎病菌中提取致病性内切半乳糖醛酸酶，可以作为该病菌的检疫检测的新的指标，并能应用致病性内切半乳糖醛酸酶，制备香蕉枯萎病菌抗血清及在筛选和培育新的香蕉抗病品种。
文档编号C12N9/24GK1673366SQ20051003329
公开日2005年9月28日 申请日期2005年2月28日 优先权日2005年2月28日
发明者王振中, 王琪 申请人:华南农业大学