专利名称：一种多聚半乳糖醛酸酶PG8fn及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及ー种多聚半乳糖醛酸酶PGSfn及其基因和应用。
背景技术：
果胶是ー类带负电的高分子多糖，由不同酯化度的半乳糖醛酸以a -1, 4糖苷键聚合而成的多糖链，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部与韩、钾、钠离子，特别是与硼化合物结合在一起(Stevenson etal.，1988)。它存在于所有的高等植物中，沉积于初生细胞壁和细胞间层，在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白相互交联，使各种细胞组织结构坚硬，表现出固有的形态(O' Neill et al.，2004)。由于果胶酶能够有效降解果胶质，因此成为不同的エ业领域中的新兴酶类。果胶酶中多聚半乳糖醛酸酶在食品行业中有比较广泛的应用，其通常用于果汁的提取和澄清。果汁中存在大量的果胶物质，果胶导致果汁的黏度加大并且混浊(岳强等，2005)。因此在食品エ业中，人们利用果胶酶来澄清果汁，它能使果汁过滤的时间缩短很多(屈慧鸽等，2005)。比如用果胶酶处理香蕉、葡萄和苹果等的果肉，能够提高果汁的产量。高比活的多聚半乳糖醛酸酶PGSfn由于其在弱酸性条件下具有较高的酶活且pH稳定性良好，相对于极酸多聚半乳糖醛酸酶有其特有的 应用优势。
发明内容
本发明的目的是提供一种能高效应用的多聚半乳糖醛酸酶。本发明的再一目的是提供编码上述多聚半乳糖醛酸酶的基因。本发明的另ー目的是提供包含上述基因的重组载体。本发明的另ー目的是提供包含上述基因的重组菌株。本发明的另一目的是提供一种制备上述多聚半乳糖醛酸酶的基因工程方法。本发明从Chaetomium luteum XZ8中分离得到一种多聚半乳糖醒酸酶PG8fn,其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。MIPSVLILSLGALAAANPLPAKRASCTFTDAASAISGKKSCSTITLKDITVPAGTTLDLTKLNDGTKVIFSGKTSFGYKEWAGPLISVSGNNIHVEGAPGHVIDGNGAKWWDTKGSNGGKKKPKFFYAHSMKNSNIKGLNVKNTPVQAFSINGAENLGVYDVHLDNSAGDSQGGHNTDAFDVGSSNGVYISGAVVKNQDDCLAINSGTNITFTGGSCSGGHGLSIGSVGGRKDNTVKTVRILNSSISNSQNGVRIKTVYGAKGSVSDVEYSGITLSNISKYGIVIEQDYENGSPTGKPTNGVPITDLTVKGVTGTVKSGATDVYILCAKGACSNWKWSGVSVTGGKKSSKCSNVPSPASC该酶包括360个氨基酸，N端16个氨基酸预测为信号肽序列。因此，成熟的多聚半乳糖醛酸酶PG8fn的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。NPLPAKRASCTFTDAASAISGKKSCSTITLKDITVPAGTTLDLTKLNDGTKVIFSGKTSFGYKEWAGPLISVSGNNIHVEGAPGHVIDGNGAKWWDTKGSNGGKKKPKFFYAHSMKNSNIKGLNVKNTPVQAFSINGAENLGVYDVHLDNSAGDSQGGHNTDAFDVGSSNGVYISGAVVKNQDDCLAINSGTNITFTGGSCSGGHGLSIGSVGGRKDNTVKTVRILNS SISNSQNGVRIKTVYGAKGSVSDVEYSGITLSNISKYGIVIEQDYENGSPTGKPTNGVPITDLTVKGVTGTVKSGATDVYILCAKGACSNWKWSGVSVTGGKKSSKCSNVPSPASC信号妝序列为mipsvlilslgalaaa (SEQ ID N0.3).
本发明提供了编码上述多聚半乳糖醛酸酶基因PG8fn，具体地，该基因的基因组序列(含有两个内含子)如SEQ ID N0.4所示。Atgattccgtcggtcctcattctttccctcggcgccctggcggcggccaacccgctccccgccaagcgcgcgagctgcacctttaccgatgctgcctctgccatcagcggcaagaagagctgcagcaccatcaccctcaaggacatcaccgtccccgccggcaccacgttggacctcacaaagctcaacgacggcaccaaggtcatcttctccggcaagacctccttcggctacaaggaatgggccgggcctctcatctccgtctccggcaacaacatccacgtcgagggcgcccccggccatgtcatcgacggcaacggtgccaagtggtgggacaccaagggtagcaatggcggcaagaagaagcccaagtatggctgtccttcctcctcgaaaatccagcggtgactgaccattttgcaggttcttctacgcccatagcatgaagaactccaacatcaagggactcaacgtgaagaacacgcccgtccaggccttcagcatcaacggcgctgaaaacctcggagtgtgagtgataccttgcgtcgctaccttcagagaccacgcctaacacgtcacttaggtacgacgtccacctcgacaactcggccggcgactcccagggcggccacaacaccgacgcgttcgacgtcggttcgtccaacggcgtctacatctcgggtgccgtggtcaagaaccaggacgactgcctggccatcaactccggcaccaacatcaccttcaccggcggctcgtgcagcggcggccacggcctgtccatcggctcggtcggcgggcgcaaggacaacacggtcaagacggtgcgcatcctcaactegtccatcagcaactcgcagaacggcgtgcgcatcaagaccgtctacggcgccaagggctccgtgtcggacgtcgagtactcgggcatcacactgtccaacatcagcaagtacggcatcgtcatcgagcaggactacgagaacggctcgcccaccggcaagcccaccaacggcgtgcccatcaccgacctgaccgtcaagggcgtcaccggcaccgtcaagtcgggcgccaccgacgtctacatcctctgcgccaagggcgcctgctccaactggaagtggtctggcgtcagcgtcaccggcggcaagaagtcgtccaagtgctccaacgttcccagccctgcctcttgctag该基因的cDNA序列如SEQ ID N0.5所示。Atgattccgtcggtcctcattctttccctcggcgccctggcggcggccaacccgctccccgccaagcgcgcgagctgcacctttaccgatgc tgcctctgccatcagcggcaagaagagctgcagcaccatcaccctcaaggacatcaccgtccccgccggcaccacgttggacctcacaaagctcaacgacggcaccaaggtcatcttctccggcaagacctccttcggctacaaggaatgggccgggcctctcatctccgtctccggcaacaacatccacgtcgagggcgcccccggccatgtcatcgacggcaacggtgccaagtggtgggacaccaagggtagcaatggcggcaagaagaagcccaagttcttctacgcccatagcatgaagaactccaacatcaagggactcaacgtgaagaacacgcccgtccaggccttcagcatcaacggcgctgaaaacctcggagtgtacgacgtccacctcgacaactcggccggcgactcccagggcggccacaacaccgacgcgttcgacgtcggttcgtccaacggcgtctacatctcgggtgccgtggtcaagaaccaggacgactgcctggccatcaactccggcaccaacatcaccttcaccggcggctcgtgcagcggcggccacggcctgtccatcggctcggteggcgggcgcaaggacaacacggtcaagacggtgcgcatcctcaactcgtccatcagcaactcgcagaacggcgtgcgcatcaagaccgtctacggcgccaagggctccgtgtcggacgtcgagtactcgggcatcacactgtccaacatcagcaagtacggcatcgtcatcgagcaggactacgagaacggctcgcccaccggcaagcccaccaacggcgtgcccatcaccgacctgaccgtcaagggcgtcaccggcaccgtcaagtcgggcgccaccgacgtctacatcctctgcgccaagggcgcctgctccaactggaagtggtctggcgtcagcgtcaccggcggcaagaagtcgtccaagtgctccaacgttcccagccctgcctcttgctag去除信号肽序列后核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
aacccgctccccgccaagcgcgcgagctgcacctttaccgatgctgcctctgccatcagcggcaagaagagctgcagcaccatcaccctcaaggacatcaccgtccccgccggcaccacgttggacctcacaaagctcaacgacggcaccaaggtcatcttctccggcaagacctccttcggctacaaggaatgggccgggcctctcatctccgtctccggcaacaacatccacgtcgagggcgcccccggccatgtcatcgacggcaacggtgccaagtggtgggacaccaagggtagcaatggcggcaagaagaagcccaagttcttctacgcccatagcatgaagaactccaacatcaagggactcaacgtgaagaacacgcccgtccaggccttcagcatcaacggcgctgaaaacctcggagtgtacgacgtccacctcgacaacteggccggcgactcccagggcggccacaacaccgacgcgttcgacgtcggttcgtccaacggcgtctacatctcgggtgccgtggtcaagaaccaggacgactgcctggccatcaactccggcaccaacatcaccttcaccggcggctcgtgcagcggcggccacggcctgtccatcggctcggtcggcgggcgcaaggacaacacggtcaagacggtgcgcatcctcaactcgtccatcagcaactcgcagaacggcgtgcgcatcaagaccgtctacggcgccaagggctccgtgtcggacgtcgagtactcgggcatcacactgtccaacatcagcaagtacggcatcgtcatcgagcaggactacgagaacggctcgcccaccggcaagcccaccaacggcgtgcccatcaccgacctgaccgtcaagggcgtcaccggcaccgtcaagtcgggcgccaccgacgtctacatcctctgcgccaagggcgcctgctccaactggaagtggtctggcgtcagcgtcaccggcggcaagaagtcgtccaagtgctccaacgttcccagccctgcctcttgctag其中，信号肽的基因序列如SEQ ID N0.7所示。Atgattccgtcggtcctcattctttccctcggcgccctggcggcggcc本发明还提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶PGSfn的重组载体，优选为pPIC9r-PG8fn。本发明还提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶PGSfn的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。本发明还提供了一种制备高比活多聚半乳糖醛酸酶PGSfn的方法，包括以下 步骤:I)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组多聚半乳糖醛酸酶表达；3)回收并纯化所表达的多聚半乳糖醛酸酶PG8fn。此低温多聚半乳糖醛酸酶的理论分子量为35.5kDa。该多聚半乳糖醛酸酶PGSfn的最适pH为6.0，在pH4.5.0 6.0的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的70%以上。多聚半乳糖醛酸酶PG8fn在pH 3.0-8.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在60%以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性；最适温度45°C，在30°C _55°C范围内，酶活性均维持在最大酶活性的60%以上。多聚半乳糖醛酸酶PG8fn在35°C和45°C下处理60min后剩余酶活性在90%以上，这说明此酶具有很好的热稳定性。利用毕赤酵母表达后，比活高达28，122U/mg。本发明还提供了编码上述多聚半乳糖醛酸酶PGSfn的基因PG8fn。本发明通过PCR的方法分离克隆了这ー多聚半乳糖醛酸酶基因PG8fn，DNA全序列分析结果表明，多聚半乳糖醛酸酶PG8fn结构基因PG8fn全长1083bp，编码360aa和ー个終止密码子，N端16个氨基酸预测为信号肽序列。蛋白理论分子量为35.5kDa，等电点为
9.11，为ー个第二十八家族的催化结构域。在GenBank中的比对结果表明PG8fn是ー个新的内切多聚半乳糖醛酸酶。本发明还提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶基因的重组载体，优选为pPIC9r-PG8fn。将本发明的多聚半乳糖醛酸酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将多聚半乳糖醛酸酶基因插入到质粒pPIC9r上的8naB I和Not I限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pPIC9r-PG8fn。本发明还提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/PG8fn。本发明还提供了一种制备多聚半乳糖醛酸酶的方法，包括以下步骤:I)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组多聚半乳糖醛酸酶的表达；3)回收并纯化所表达的多聚半乳糖醛酸酶。其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞GS115，得到重组菌株GS115/PG8fn。
图1:在毕赤酵母中表达的重组多聚半乳糖醛酸酶的SDS-PAGE分析，其中，M:低分子量蛋白质Marker ；1:去糖基化处理的酶液；2:纯化的酶液。图2:重组多聚半乳糖醛酸酶的最适pH。图3:重组多聚半乳糖醛酸酶的pH稳定性。
图4:重组多聚半乳糖醛酸酶的最适温度。图5:重组多聚半乳糖醛酸酶的热稳定性。图6:用TOF-MS对重组多聚半乳糖醛酸酶以PGA为底物时的产物分析。毛壳菌(Chaetomium luteum sp) XZ8 (保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101，保藏日期:2012年9月10日)，其保藏号为:CGMCCN0.6545)
具体实施例方式试验材料和试剂1、菌株及载体:表达宿主Pichia pastoris GS115，表达质粒载体pPIC9r为本实
验室保存。2、酶类及其它生化试剂:内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司，多聚半乳糖醛酸购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基:(I) LB 培养基(g/1):酵母粉 5.0，蛋白胨 10.0，NaCl 10.0，pH7.0。(2)平板筛选培养基(g/1):酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0，琼脂15.0，pH7.0。实施例1 毛壳菌 XZ8 (Chaetomium luteum sp.XZ8)的分离毛壳菌Chaetomium luteum sp.XZ8用PDA培养基在45°C的条件下筛选自宁夏沙土样品。菌落呈圆形，边缘整齐，气生菌丝白色、较长，与培养基结合紧密。XZ8在19°C下几乎不生长，在30°C下需要3d才可生长，在45°C下只需l-2d即可生长，为典型的嗜热真菌。实施例2毛壳菌Chaetomiaceae sp.XZ8来源的多聚半乳糖醛酸酶编码基因PG8fn的克隆提取基因组DNA及RNA。根据第二十八家族内切多聚半乳糖醛酸酶真菌基因的保守[NQDDCL(V)A和NGVRI (V)KT]序列设计合成了简并引物G28n_F和G28n_R:G28n-F:5’-GAACCARGAYGAYTGYSTIGC-3’ ;G28n-R:5’-GGTCTTNAYNCKNACICCRTT-3’以上述的毛壳菌Chaetomium luteum sp.XZ8基因组DNA为模板进行PCR扩增。降落PCR 反应參数为:94°C变性 5min ;94°C变性 30sec，51-46°C退火 30sec，72°C延伸 lmin，10个循环(每个循环降落0.50C )，然后94°C变性30sec，46°C退火30sec，72°C延伸lmin，30个循环，72°C保温lOmin。得到ー约180bp片段，将该片段回收后与pEASY_T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物:设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在spl的内側，sp3位于sp2的内側。每两个引物之间的 距离没有严格規定，引物长度一般20 30nt，退火温度在61 °C。并将它们分别命名为8fn-uSPl，8fn-uSP2, 8fn_uSP3 (上游特异性引物)；8fn-dSPl, 8fn-dSP2, 8fn_dSP3 (下游特异性引物)见表I。按照改进的TAIL-PCR(Huanget al., 2010)中的程序对两端侧翼序列进行扩增。表1.多聚半乳糖醛酸酶PG8fn TAIL-PCR特异性引物
权利要求
1.种多聚半乳糖醛酸酶PG8fn，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1或2所示。
2.一种多聚半乳糖醛酸酶基因PG8fn，其特征在于，其编码权利要求1所述的多聚半乳糖醛酸酶PG8fn。
3.根据权利要求2所述的多聚半乳糖醛酸酶基因PG8fn，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4 或 SEQ ID N0.5 或 SEQ ID N0.6 所示。
4.包含权利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶基因PGSfn的重组载体。
5.包含权利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶基因PG8fn的重组载体pPIC9r-PG8fn。
6.包含权利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶基因PGSfn的重组菌株。
7.按权利要求2所述的重组菌株，其特征在于，其所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。
8.根据权利要求8所述的重组菌株，所述重组菌株为重组毕赤酵母菌株GS115/PG8fn。
9.权利要求1所述多聚半乳糖醛酸酶PG8fn的应用。
10.壳菌XZ8 (Chaetomium luteum sp.XZ8)，其保藏编号为 CGMCC N0.6545。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种多聚半乳糖醛酸酶PG8fn及其基因和应用。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。多聚半乳糖醛酸酶PG8fn在35℃和45℃下处理60min后剩余酶活性在90%以上，这说明此酶具有很好的热稳定性。利用毕赤酵母表达后，比活高达28,122U/mg。
文档编号C12R1/645GK103088002SQ20121046853
公开日2013年5月8日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者姚斌, 孟昆, 涂涛, 罗会颖, 石鹏君, 黄火清, 杨培龙, 王亚茹 申请人:中国农业科学院饲料研究所