专利名称：寡聚半乳糖醛酸诱导子的制备方法及促进黄花蒿发根青蒿素生产的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物诱导子的制备方法及其促进黄花蒿发根青蒿素生产的 应用，具体涉及寡聚半乳糖醛酸诱导子的制备方法及促进黄花蒿发根青蒿素生 产的方法。
背景技术：
青蒿素是继氯喹、乙氨嘧啶、伯喹和磺胺后最热的抗疟特效药，尤其对脑 型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点，已成为世界卫生组织推荐的药品， 成为我国中药研究里的一枝奇葩。化学合成青蒿素这一复杂的天然分子是有机 化学家所面临的挑战，青蒿素全合成研究虽已取得一些明显的进展，但到目前 尚未显示出商业的可行性。
目前，生产青蒿素的方法主要有以下几种
(1) 从天然黄花蒿(4r&附/^1 fl K L.)中提取青蒿素，其环节多，耗时费 力，且产量受环境和季节的限制，从而使得青蒿素的生产成本髙、产量低(参 见中草药，1990， 21:38-41,青蒿素研究进展)；
(2) 利用生物技术来生产青蒿素是目前青蒿素研究的一个热点，可成为大规模 生产青蒿素的重要手段，但是对于用于大规模生产的细胞和发根培养，仍然存 在成本髙、产量低的问题，阻碍了黄花蒿生物技术生产商业应用的发展；
(3) 近年来，利用生物诱导子，尤其是真菌诱导子来促进植物组织次生代谢物 合成的研究愈来愈多，人们对不同的植物组织培养体系，采用不同的诱导物质 进行了实验，取得了良好的效果。就青蒿素生物技术生产来说，目前，采用的 诱导物质有固醇生物合成抑制剂双氯苯咪唑和氯化氯胆碱(参见中国生物化 学与分子生物学报，1999, 15: 479-483，黄花蒿培养细胞中青蒿素合成代谢的 体外调节)、高油菜素内酯(参见:Biotechnology Letters 2002， 24:1573-1577， Improved artemisinin accumulation in hairy root cultures of Artemisia annua by (22S, 23S)-homobrassinolide)、病原真菌(大丽花轮枝孢、葡枝根霉)细胞
3壁粗提物等(参见植物学报，2000， 42: 905-909)。但是对于用于大规模生产的发根培养，仍然存在成本髙、产量低的问题，阻碍了黄花蒿毛状根离体培养商业应用的发展。
近年来，利用生物诱导子，尤其是真菌和植物细胞壁分解物质来促进植物组织次生代谢物合成的研究愈来愈多，其中寡聚半乳糖醛酸(Oligogalacturonides， OGA)是由植物或真菌细胞壁重要组成成分a-l， 4-D-多聚半乳糖醛酸及其部分甲酯化衍生物构成的果胶经降解所得到的寡聚糖。它能诱导双子叶植物的抗性反应，调节它们的生长发育及细胞表面的快速反应。OGA在诱导植物产生各种应激反应的同时，对其次生代谢产物也具有调节作用。但关于OGA诱导子的研究主要集中有效诱导浓度的筛选和诱导机制的研究，而关于OGA诱导子的制备方法的报道较少，OGA诱导子对青蒿素生物合成的诱导活性研究则无报道。
发明内容
本发明目的是提供寡聚半乳糖醛酸诱导子的制备方法及应用寡聚半乳糖醛酸诱导子促进黄花蒿发根生产青蒿素的方法，降低黄花蒿发根大规模培养的成本，提高产量。
为达到上述目的，本发明具体技术方案是， 一种制备寡聚半乳糖醛酸诱导子的方法，将多聚半乳糖醛酸经过果胶酶酶解，通过葡聚糖凝胶Sephadex G-10层析，得到寡聚半乳糖醛酸诱导子，具体包括以下步骤
(1) 多聚半乳糖醛酸用果胶酶20" 30'C酶解10 30min,然后然后IOO'C煮沸3 8min，过滤，浓缩后冷冻干燥，得到冻干样品；
(2) 将冻干样品用蒸馏水配成1 5mg/mL溶液，经葡聚糖凝胶G-10柱处理，旋转蒸发仪减压浓縮富集，最后用0.22fim微孔滤膜过滤除菌，得到平均聚合度为5 20的寡聚半乳糖醛酸诱导子。
上述技术方案主要是通过分子筛作用，把不同聚合度的寡聚半乳糖醛酸分段，而寡聚半乳糖醛酸诱导子是否具有活性只取决于其平均聚合度。
一种应用寡聚半乳糖醛酸诱导子促进黄花蒿发根生产青蒿素的方法，包括以下步骤(1) 黄花蒿发根保存在液体培养基中，120 130rpm摇床上液体培养，培养温度为25 27'C，光照时间每天16h,光照度20001x左右，每2周继代一次；
所述液体培养基为MS液体培养基(全称是Murashige and Skoog Stock液体培养基)，是Miirashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较髙，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量髙，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基；其组成为MS组分，蔗糖30g/L，赤霉素0.01mg/L，水解酪蛋白0.5g/L; MS组分有固定配方，属于本领域技术人员公知的技术。
(2) 将步骤(1)中的培养的发根作为接种材料，取2cm左右的黄花蒿发根根尖，接种在液体培养基中，120 130rpm摇床上液体培养，继代培养20 25天，培养温度、光照条件如步骤(l)所述；
所述液体培养基为步骤(l)所述MS液体培养基；
黄花蒿发根的接种量为每50mL的MS液体培养基中接种O.lg鲜重的发
根；
(3) 将灭菌的寡聚半乳糖醛酸诱导子以10 60li g/mL (总糖含量/培养基)的浓度加入到步骤(2)培养的黄花蒿发根培养液中，诱导培养处理1 6天后收获发根，提取青蒿素。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点
(1) 由于本发明应用寡聚半乳糖醛酸诱导子与黄花蒿发根共培养，促进黄花蒿生产青蒿素，提髙了青蒿素的产量；
(2) 寡聚半乳糖醛酸诱导子为生物型诱导物，对黄花蒿发根生长无明显抑制；对后期青蒿素分离提取过程无干扰；并且寡聚半乳糖醛酸诱导子的制备方法简单易实现，从而降低了该方法的成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述实施例中各性能测试方法如下
1.本诱导子终糖浓度的测定采用硫酸-咔唑法(参见甘肃农业大学学报，1999, 34 ( 1): 75-78,果胶的咔唑硫酸分光光度测定法研究)。
2. 黄花蒿发根培养中培养基采用MS配方(参见Physiol. Plant. 1962, 15:473-497. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobaccotissue cultures )
3. 青蒿素提取测定参照Zhao S S和Zeng M Y ( 1985)的HPLC法(参见Planta Med. 1985， 51: 233-237, Spkectrometrische hochdruck-fliissigkeits陽chromatographische (HPLC)untersuchungen zur analytik von Quinghaosu)。
实施例一
1、 寡聚半乳糖醛酸诱导子的制备
(1) 多聚半乳糖醛酸(50 fig/mL， FIuka公司货号81325)用果胶酶(30Hg/mL， Fluka公司货号17389) 25'C酶解20min， 100'C煮沸5min,使酶失活，然后过滤(09cm中速滤纸)，浓縮后冷冻干燥。
(2) 将冻干样品用蒸馏水配成lmg/mL溶液，经葡聚糖凝胶Sephadex G-10柱(1.6x20cm)处理，每次上样lOmL,流速控制在0.25~0.35mL/min,自动部分收集器收集，收集并且富集第40 120min的流出溶液，旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂RE-5299型)减压浓縮，最后用0.22 jim微孔滤膜过滤除菌，得到诱导子。
2、 黄花蒿发根的保存和培养
(1) 以本实验室诱导的黄花蒿发根HR3系为培养材料，发根保存在MS液体培养基中，培养基的组成为MS，蔗糖30g/L，赤霉素0.01mg/L，水解酪蛋白0.5g/L。 120 130rpm摇床上液体培养，培养温度为25 27"，光照时间每天16h，光照度2000 1x左右，每2周继代一次。
(2) 将保存在摇瓶培养中的发根作为接种材料，取2 cm左右的发根根尖，接种在培养基中，培养基的组成为MS,蔗糖30g/L,赤霉素0.01mg/L，水解酪蛋白0.5g/L。培养瓶为250mL三角瓶，内盛有50mL液体培养基，每瓶接种量为O.lg鲜重的发根。120~130rpm摇床上液体培养，培养温度为25 27'C，光照时间每天16h,光照度2000 1x左右。
3、 黄花蒿发根和寡聚半乳糖醛酸诱导子的诱导培养在培养第23天的黄花蒿发根培养基中加入寡聚半乳糖醛酸诱导子，加入 剂量为40 jig/mL，加入后继续以原培养温度和光照条件在摇床(120~130rpm) 上震荡培养。
4、 黄花蒿发根的收获
黄花蒿发根加入寡聚半乳糖醛酸诱导子后继续培养4天后收获，用100 目尼龙网过滤，分离培养基和发根，发根用蒸馏水冲洗干净后，于50C烘干。
5、 黄花蒿发根中青蒿素的提取与分析
(1) 烘干的黄花蒿发根，研成细粉，称取0.5g，加石油醚(30 60'C)30mL ， 在超声波浴中提取30min，过滤，水浴蒸干石油醚。残渣用2mL乙醇溶解， 3000g离心lOmiii，上清液滤入10mL容量瓶中，乙醇定容，用于青蒿素的测 定。(2) 取提取液200L于10mL试管中加800L乙醇、4mL的质量分数0.2%的 NaOH溶液，摇匀。于501C水浴中反应30min。流水中冷却至室温后，取出0.5 mL反应液于1.5mL离心管中，加入100L乙醇、400L的0.16mol/L醋酸，混 匀，3000g离心lOmin，上清液用于测定青蒿素。按照同样方法制备青蒿素对 照品溶液，对照品浓度分别为O、 4、 8、 12、 16、 20、 24g/mL,青蒿素购自中 国药品生物制品检定所。
液相色谱测定条件色谱柱为Hypersil BDS C8柱，150X4.6mm,流动 相为甲醇/0.01mol/L NaAc/HAc缓冲液(pH=7.0)(40 : 60 ， V/V)，流速为 110mL/min。髙压液相色谱仪为Waters 600E HPLC系统。紫外检测器波长设 在260nm。注射体积IOL。
实施例二
1、寡聚半乳糖醛酸诱导子的制备
(1) 多聚半乳糖醛酸用果胶酶30"酶解30min，然后IOO"C煮沸8min,过滤， 浓縮后冷冻干燥，得到冻干样品；
(2) 将冻干样品用蒸馏水配成5mg/mL溶液，经葡聚糖凝胶G-10柱处理，流 速控制在0.25 0.35mL/min,自动部分收集器收集，收集并且富集第40 120min 的流出溶液，旋转蒸发仪减压浓縮，最后过滤除菌，得到寡聚半乳糖醛酸诱导子。
实施例三
1.寡聚半乳糖醛酸诱导子对黄花蒿发根培养中青蒿素生产的影响
多聚半乳糖醛酸(50jig/mL)用果胶酶(30fig/mL) 25X:酶解20min, 100 'C煮沸5min，浓缩后冷冻干燥。将冻干样品用蒸馏水配成lmg/mL溶液，经 葡聚糖凝胶Sephadex G-10柱(1.6x20cm)处理，每次上样10mL，流速控制 在0.25 0.35mL/min,自动部分收集器收集，每管收集3mL,共收集30管， 富集第5-10管溶液，减压浓缩，最后用0.22nm微孔滤膜过滤除菌，得到寡聚 半乳糖醛酸诱导子。
将保存在摇瓶培养中的黄花蒿发根作为接种材料，取2cm左右的发根根 尖，接种在含0.01mg/L赤霉素、0.5g/L水解酪蛋白和3%蔗糖的MS培养基 中。培养瓶为250mL三角瓶，内盛有50mL液体培养基，每瓶接种量为O.lg 鲜重的发根。120 130rpm摇床上液体培养，培养温度为25 27'C ，光照时间 每天16h，光照度2000 lx左右。在培养第23天的黄花蒿发根培养基中加入寡 聚半乳糖醛酸诱导子，加入剂量为40pg/mL,加入后继续以原培养温度和光照 条件在摇床(120~130rpm)上震荡培养4天后收获。
以加入蒸馏水培养的发根为对照。
收获的发根50"C烘干。以青蒿素为标准品，采用Zhao S S和Zeng M Y (1985)的HPLC法测定发根中青蒿素含量，并根据每升培养基中发根生物 量计算出每升培养基中青蒿素的总产量。
实验结果表明经过平均聚合度为15的寡聚半乳糖醛酸诱导培养后，发 根中青蒿素含量可达最髙值1.09mg/g (干重)，比同期蒸馏水对照组提髙 49.32%;青蒿素产量相应也达峰值13.51mg/L，比同期对照组产量髙出 51.63%。
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权利要求
1. 一种制备寡聚半乳糖醛酸诱导子的方法，其特征在于包括以下步骤(1)多聚半乳糖醛酸用果胶酶20℃～30℃酶解10～30min，然后100℃煮沸3～8min，过滤，浓缩后冷冻干燥，得到冻干样品；(2)将冻干样品用蒸馏水配成1～5mg/mL溶液，经葡聚糖凝胶G-10柱处理，得到平均聚合度为5～20的寡聚半乳糖醛酸诱导子。
2. —种应用寡聚半乳糖醛酸诱导子促进黄花蒿发根生产青蒿素的方法，包 括以下步骤(1) 黄花蒿发根保存在液体培养基中，120 130rpm摇床上液体培养，每2周 继代一次；(2) 将步骤(1)中的培养的发根作为接种材料，取2cm左右的黄花蒿发根根尖， 接种在液体培养基中，120 130rpm摇床上培养；其特征在于步骤(2)中所述培养黄花蒿发根根尖的培养时间为20 25天；(3) 将权利要求1所述寡聚半乳糖醛酸诱导子加入到步骤(2)培养的黄花蒿发 根培养液中，诱导培养处理1 6天后收获发根，提取青蒿素。
3. 根据权利要求3所述的促进黄花蒿发根生产青蒿素的方法，其特征在于(1) 步骤(l)、 (2)和(3)中培养条件为培养温度为25 27'C,光照时间每天16h， 光照度20001x左右；(2) 所述液体培养基为MS液体培养基，其组成为MS组分，蔗糖30g/L， 赤霉素0.01mg/L,水解酪蛋白0.5g/L;(3) 步骤(2)中黄花蒿发根的接种量为每50mL的液体培养基中接种O.lg鲜 重的发根(4) 步骤(3)中寡聚半乳糖醛酸诱导子的加入浓度为每lmL培养基加入10 60li g总糖含量的寡聚半乳糖醛酸诱导子。
全文摘要
本发明公开了一种利用寡聚半乳糖醛酸诱导子促进黄花蒿发根生产青蒿素的技术，首先通过酶解多聚半乳糖醛酸，经过柱层析纯化，得到平均聚合度为5～20的寡聚半乳糖醛酸诱导子，再将寡聚半乳糖醛酸诱导子加入到黄花蒿发根培养液中进行共同培养，提高黄花蒿发根中青蒿素含量，从而提高青蒿素产量。因此本发明可有效地刺激黄花蒿发根中青蒿素的合成，提高培养体系中青蒿素的生产，为青蒿素生物技术生产提供调控方法。
文档编号C12P19/04GK101481717SQ20091002890
公开日2009年7月15日 申请日期2009年1月21日 优先权日2009年1月21日
发明者王剑文, 婷 邹, 郑丽屏, 郭玉婷 申请人:苏州大学