专利名称：一株用于碱性果胶酶生产的工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株用于碱性果胶酶生产的工程菌及其应用。
背景技术：
果胶是植物细胞壁的重要组成成分，包括原果胶，果胶酸和果胶酯酸。果胶物质的存在可以增加植物细胞壁的坚硬度，有利于维持植物的特定外形结构，但增加了对植物进行深加工的工业操作的难度。果胶酶是指能够分解果胶质的一类酶，普遍存在于自然界的高等植物和微生物中，是重要的工业酶制剂。碱性果胶酶(EC :4. 2. 2. 2)是一类在碱性条件下，以反式消去作用断开果胶质主链，产生不饱和的寡聚半乳糖醛酸的酶，在纺织工业的麻类脱胶、棉织品精炼等领域内有着广泛的应用。相比于传统的高碱、高温处理手段，使用碱性果胶酶不仅对果胶质有较好的去除作用，对天然纤维素纤维损伤较小，而且可以减少材料消耗和环境负担，为纺织工业开辟了 一条绿色清洁之路。国内对于碱性果胶酶的的研究大多集中在野生产酶菌株的筛选以及发酵条件优化等方面，但野生菌的生产能力与工业应用的需求尚有一定的距离。利用工程菌生产碱性果胶酶可以很好的填补这一空白。近年来，出现了用重组毕赤酵母表达碱性果胶酶的报道， 但这种技术发酵周期长、能耗大。因此构建发酵周期短、操作简单的工程菌株成为碱性果胶酶工业化应用的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一株用于碱性果胶酶的工程菌及其应用。本发明提供的工程菌属于大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，命名为BL21 (DE3) PGL04,已于2012年I月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCC No. 5697。大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)PGL04 CGMCC No. 5697简称大肠埃希氏菌BL21 (DE3) PGL04。所述大肠埃希氏菌BL21 (DE3)PGL04可用于生产碱性果胶酶。本发明还保护一种生产碱性果胶酶的方法，包括如下步骤(I)将大肠埃希氏菌BL21 (DE3) PGL04接种至发酵培养基，得到OD6tltol = O. 1-0. 2 (如O. 1-0. 15或O. 15-0. 2)的发酵初始体系；(2)将发酵初始体系进行如下发酵先35-37°C (如35_36°C或36_37°C )振荡培养3-5小时(如3-4小时或4-5小时)，然后加入IPTG至终浓度为50-100 μ M(如50-75 μ M 或 75-100 μ Μ)，25-30°C (如 25-28。。或 28-30°C )继续振荡培养 40-48 小时(如 40-45 小时或45-48小时)，得到碱性果胶酶。所述发酵培养基制备方法如下取10_15g(如10_12g或12_15g)胰蛋白胨、15-23g(如 15-19g 或 19-23g)酵母提取物、5_10g(如 5_7g 或 7-10g)氯化钠、10_15g(如
10-12g 或 12-15g)甘油、10-17mM(如 10_14mM 或 14_17mM)磷酸二氢钾和 65_75mM(如 65-70mM或70-75mM)磷酸氢二钾，用水溶解并定容至1L。所述发酵培养基的pH可为7. 0-7. 2 (如7. 0-7. I或7. 1-7. 2)。所述大肠埃希氏菌BL21(DE3)PGL04可以以种子液的方式接种至所述发酵培养基。所述种子液的制备方法如下将大肠埃希氏菌BL21(DE3)PGL04接种至种子培养基，35-370C (如 35-36。。或 36-37°C )振荡培养至 OD600nm = 3-6 (如 3-4. 5 或 4. 5-6)，即为种子液。所述种子培养基的制备方法如下取10_15g(如10_13g或13_15g)胰蛋白胨、 5-8g (如5-7g或7-8g)酵母提取物和5-10g (如5_7g或7_10g)氯化钠，用水溶解并定容至 1L。所述种子培养基的pH可为7. 0-7. 2 (如7. 0-7. I或7. 1-7. 2)。以上任一所述振荡培养可为100-200r/min(如 100_150r/min 或 150_200r/min)
的振荡培养。以上任一所述方法生产得到的碱性果胶酶均属于本发明的保护范围。所述碱性果胶酶可用于降解多聚半乳糖醛酸。所述碱性果胶酶可用于以多聚半乳糖醛酸为底物生产不饱和多聚半乳糖醛酸。所述碱性果胶酶为具有如下功能的物质在碱性环境(如pH9. 4)中，将多聚半乳糖醛酸转化为不饱和多聚半乳糖醛酸。本发明提供工程菌和方法可用于生产碱性果胶酶，具备潜在工业化价值(如麻类脱胶、生物制浆、环境保护等行业)，为后续的工业化研究奠定了基础。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例I、工程菌的获得和保藏一、工程菌的获得I、提取土壤的全基因组DNA。2、根据碱性果胶酶相关基因序列，设计简并引物。3、以全基因组DNA为模板，用步骤2设计的简并引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。4、将步骤3的PCR扩增产物测序，发现一个新基因。5、将新基因插入载体pET28b的NcoI和XhoI酶切位点之间，得到重组质粒。6、将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)，得到一株重组菌(工程菌)，命名为 BL2UDE3)PGL04。二、工程菌的保藏
BL21(DE3)PGL04 属于大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。BL21 (DE3)PGL04 已于2012年I月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC， 地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCC No. 5697。大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)BL21 (DE3)PGL04 CGMCC No. 5697简称大肠埃希氏菌BL21 (DE3)PGL04。实施例2、应用工程菌生产碱性果胶酶一、培养基的制备种子培养基(pH7. O) -M IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g氯化钠，用水溶解并定容至 IL ;121°C灭菌 30min。发酵培养基(pH7. O):取IOg胰蛋白胨、15g酵母提取物、5g氯化钠、IOg甘油、IOmM 磷酸二氢钾和65mM磷酸氢二钾，用水溶解并定容至IL ;121°C灭菌30min。二、应用工程菌生产碱性果胶酶I、将大肠埃希氏菌BL21(DE3)PGL04接种至种子培养基，35°C振荡培养(IOOr/ min)至OD6citlnm = 3,即为种子液。 2、将步骤I的种子液接种至40mL发酵培养基(采用250mL摇瓶)，得到OD6tltlnm =
O.I的发酵初始体系；发酵过程如下(共43小时)先35°C振荡培养(100r/min)3小时，然后加入IPTG至终浓度为50 μ M继续25°C振荡培养(100r/min)40小时。3、将完成步骤2的发酵体系离心(12000r/min, 5min)收集上清液。三、酶活测定将步骤二得到的上清液用甘氨酸-NaOH缓冲液(O. 2mol/L, pH9. 4)稀释后进行酶活测定，具体方法如下实验组在2ml溶液甲中加入20 μ L待测溶液，45°C反应15min，加入3mL0. 03mol/ L H3PO4水溶液(终止液)，测定235nm的吸光度值；对照组在2ml溶液甲中依次加入3mL O. 03mol/L H3PO4水溶液和20 μ L待测溶液，测定235nm的吸光度值。溶液甲的配方含O. 2g/100ml多聚半乳糖醒酸(购自Sigma-Aldrich公司，货号 81325-50G)和 O. 44mmol/L CaCl2 的甘氨酸-NaOH 缓冲液(O. 2mol/L, ρΗ9· 4)。碱性果胶酶一个标准酶活单位(IU)定义为在上述条件下，Imin反应时间内使 PGA产生I μ mo I的不饱和聚半乳糖醛酸所需的酶量。碱性果胶酶酶活(U/mL)计算公式如下
PGL咖+_ =獅ΥΙΟ、稀释倍数X'
IO3 χ χ4600χ χ V1 Δ OD235 =实验组235nm的吸光度值-对照组235nm的吸光度值；4600为不饱和聚半乳糖醒酸在235nm处的摩尔吸光系数,单位为L · moF1 · cnT1 ；t为酶促反应时间(在酶反应的线性范围内)，单位为min，本实验中为15min ；b为比色杯厚度，单位为cm，本实验中为Icm ；V0为体系总体积数，单位为mL，本实验中为5. 02mL ；V1为酶液体积数，单位为mL，本实验中为0. 02mL。步骤二得到的上清液的碱性果胶酶酶活力为600U/mL。
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实施例3、应用工程菌生产碱性果胶酶一、培养基的制备种子培养基(pH7. 2) -M 15g胰蛋白胨、8g酵母提取物和IOg氯化钠，用水溶解并定容至IL ;121°C灭菌30min。发酵培养基(pH7. 2):取15g胰蛋白胨、23g酵母提取物、IOg氯化钠、15g甘油、 17mM磷酸二氢钾和75mM磷酸氢二钾，用水溶解并定容至IL ;121°C灭菌30min。二、应用工程菌生产碱性果胶酶I、将大肠埃希氏菌BL21(DE3)PGL04接种至种子培养基，37°C振荡培养(200r/ min)至OD6citlnm = 6,即为种子液。2、将步骤I的种子液接种至20mL发酵培养基(采用250mL摇瓶)，得到OD6tltlnm =
O.2的发酵初始体系；发酵过程如下(共53小时)先37°C振荡培养(200r/min)5小时，然后加入IPTG至终浓度为100 μ M继续30°C振荡培养(200r/min)48小时。3、将完成步骤2的发酵体系离心(12000r/min, 5min)收集上清液。三、酶活测定同实施例2的步骤三。步骤二得到的上清液的碱性果胶酶酶活力为800U/mL。实施例4、应用工程菌生产碱性果胶酶一、培养基的制备种子培养基(pH7. I):取13g胰蛋白胨、7g酵母提取物和7g氯化钠，用水溶解并定容至 IL ;121°C灭菌 30min。发酵培养基(pH7. I):取12g胰蛋白胨、19g酵母提取物、7g氯化钠、12g甘油、14mM 磷酸二氢钾和70mM磷酸氢二钾，用水溶解并定容至IL ;121°C灭菌30min。二、应用工程菌生产碱性果胶酶I、将大肠埃希氏菌BL21(DE3)PGL04接种至种子培养基，36°C振荡培养(150r/ min)至 OD6citlnm = 4. 5,即为种子液。2、将步骤I的种子液接种至30mL发酵培养基(采用250mL摇瓶)，得到OD6tltlnm =
O.15的发酵初始体系；发酵过程如下(共49小时)先36°C振荡培养(150r/min)4小时， 然后加入IPTG至终浓度为75 μ M继续28°C振荡培养(150r/min)45小时。3、将完成步骤2的发酵体系离心(12000r/min, 5min)收集上清液。三、酶活测定同实施例2的步骤三。步骤二得到的上清液的碱性果胶酶酶活力为700U/mL。
权利要求
1.大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21 (DE3)PGL04，它的保藏编号为CGMCC No.5697。
2.权利要求I所述大肠埃希氏菌BL21(DE3)PGL04在生产碱性果胶酶中的应用。
3.—种生产碱性果胶酶的方法，包括如下步骤(1)将权利要求I所述大肠埃希氏菌BL21(DE3)PGL04接种至发酵培养基，得到OD6tltol =O. 1-0. 2的发酵初始体系；(2)将发酵初始体系进行如下发酵先35-37°C振荡培养3-5小时，然后加入IPTG至终浓度为50-100 μ M，25-30°C继续振荡培养40-48小时，得到碱性果胶酶。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵培养基制备方法如下取10-15g 胰蛋白胨、15_23g酵母提取物、5-10g氯化钠、10-15g甘油、10-17mM磷酸二氢钾和65_75mM 磷酸氢二钾，用水溶解并定容至1L。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述大肠埃希氏菌BL21(DE3)PGL04以种子液的方式接种至所述发酵培养基。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述种子液的制备方法如下将所述大肠埃希氏菌BL21 (DE3)PGL04接种至种子培养基，35-37°C振荡培养至OD6tltol = 3-6,即为种子液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述种子培养基的制备方法如下取 10_15g胰蛋白胨、5-8g酵母提取物和5-10g氯化钠，用水溶解并定容至 >1L。
8.权利要求3至7中任一所述方法生产得到的碱性果胶酶。
9.权利要求8所述碱性果胶酶在降解多聚半乳糖醛酸中的应用。
10.权利要求8所述碱性果胶酶在以多聚半乳糖醛酸为底物生产不饱和多聚半乳糖醛酸中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株用于碱性果胶酶的工程菌及其应用。本发明提供的工程菌属于大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，命名为BL21(DE3)PGL04，保藏号为CGMCC No.5697。本发明还保护一种生产碱性果胶酶的方法，包括如下步骤(1)将大肠埃希氏菌BL21(DE3)PGL04接种至发酵培养基，得到OD600nm＝0.1-0.2的发酵初始体系；(2)将发酵初始体系进行如下发酵先35-37℃振荡培养3-5小时，然后加入IPTG至终浓度为50-100μM，25-30℃继续振荡培养40-48小时，得到碱性果胶酶。本发明提供工程菌可用于生产碱性果胶酶，进一步可用于麻类脱胶产业。
文档编号C12P19/14GK102586158SQ201210064448
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月13日 优先权日2012年3月13日
发明者宋江宁, 李小曼, 王辉林, 马延和 申请人:天津工业生物技术研究所