专利名称:一种产碱性果胶酶菌株及其发酵生产碱性果胶酶的方法
技术领域：
一种产碱性果胶酶菌株及其发酵生产碱性果胶酶的方法，属于生物工程技术领域：
。
背景技术：
目前碱性果胶酶在各个行业领域中应用广泛，其应用领域包括全棉织物的生物 精练，混纺织物以及功能织物的前处理精炼，植物韧皮纤维脱胶，食品加工行业，环保行业 (处理果胶废水)以及烟草行业等。根据已有的报道，中国专利(公开号CN 1480529A) 中公开了一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CCTCC NO =M 203042经液体深层发酵生 产碱性果胶酶，可用于棉纺织物精练处理。中国专利(公开号CN 1177003 A)中公开了 一株嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)CCTCC NO =M 96009能直接用于苎麻脱胶。中 国专利(公开号:CN 1113951 Α)中公开了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)CCTCC NO :M0213经高浓度液态发酵生产碱性果胶酶。我们从山东烟台葡萄榨汁工厂土壤中分离 筛选出一株嗜碱细菌，具有较高的产碱性果胶酶能力，经鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。本发明将该原始菌株进行紫外诱变，得到产碱性果胶酶的突变株，并通过后期流 加液体发酵获得碱性果胶酶，目前还没有这样的专利和报道。由于芽孢杆菌有良好的酶系， 以及外分泌体系在发酵后期由于蛋白酶的产生会影响其他酶的活力，通过大量试验发现流 加柠檬酸钠能够有效的抑制蛋白酶的生产而不影响碱性果胶酶的活力以及产量。
发明内容
本发明的目的是提供一株产果胶酶的短小芽孢杆菌(Baci 1 Ius pumiIus) BP-C0-01，其保藏编号为CCTCC NO =M 207194，并提供一种利用该菌株液体流加发酵产碱性 果胶酶的方法。
本发明的技术方案一株产碱性果胶酶的细菌，其分类命名为短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus)BP-CO-01,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO M 207194。
利用所述细菌生产碱性果胶酶的方法，采用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) BP-C0-01为出发菌株，经过种子培养和液体发酵培养，经后处理得到碱性果胶酶溶液；
菌种保藏一批20支甘油管保存在-70°C冰箱内。甘油管转接到琼脂培养基斜面， 培养基组成胰蛋白胨1.5%，酵母浸膏0.4%，葡萄糖0.3% ,K2HPO4O. 10%, Na2CO3 0.3%, 琼脂1.2%，用10% NaOH调pH到7. 5后，于115°C灭菌15分钟。
种子培养种子培养基以g/L计菜粕20-100、棉粕40-120、葡萄糖20-60、磷酸 氢二钾5-15、碳酸钠5-15，培养条件500L种子罐，60%装料量，初始pH7. 5-9. 0，培养温度 30-40°C，培养时间 8-16h ；
液体发酵培养液体发酵培养基以g/L计菜粕50-100、棉粕40-120、葡萄 糖20-60、磷酸氢二钾5-15、碳酸钠5-15，培养条件5吨发酵罐，60 %装料量，初始pH7. 0-9. 0，培养温度30-40°C，培养时间36-60h ；在发酵30h后流加柠檬酸钠溶液，流加的溶 液中柠檬酸钠浓度为0. 5-10g/L，总流加量为发酵液重量的1%，均勻流加至发酵结束。
发酵液后处理液态发酵后发酵液经高速离心或者压滤，滤液用截留分子量为IOOOODa的中空纤维管式超滤膜浓缩，收集浓缩液，即得碱性果胶酶溶液。
该菌株是将从葡萄榨汁工厂土壤中分离得到的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus) 产碱性果胶酶菌株，经紫外诱变得到的碱性果胶酶高产突变株(Bacilluspumilus) BP-C0-01，其产碱性果胶酶的能力比原始菌株提高150%，经连续培养性能稳定。菌种保藏 编号为 CCTCC NO :M 207194。
本发明的有益效果本发明将原始菌株进行紫外诱变，得到产碱性果胶酶的突变 株，并通过后期流加液体发酵获得碱性果胶酶，目前还未见相关的文献报道。由于芽孢杆菌 有良好的酶系，以及外分泌体系在发酵后期由于蛋白酶的产生会影响其他酶的活力，通过 大量试验发现流加柠檬酸钠能够有效的抑制蛋白酶的生产而不影响碱性果胶酶的活力以
及产量。
生物材料样品保藏
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP-C0_01，已保藏于中国典型培养物保藏中 心，保藏单位简称CCTCC，保藏日期2007年12月6日，保藏编号为CCTCCNO =M 207194。
具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明的实施，不作为对本发明实施范围的限定。
实施例1
将在37 V培养箱中培养60小时的斜面短小芽孢杆菌(Baci 1 Ius pumi Ius) BP-C0-01在无菌台中转入IOOOmL瓶、装液量350mL的种子培养基中。
种子培养基组成(g/L计)菜粕45、棉粕40、葡萄糖25、K2HP045, Na2C035,培养条 件初始PH 7. 5，35°C，在500L种子罐(60%装料量)中培养10小时后转入5吨发酵罐 (60%装料量)中，培养基组成为(g/L计)，菜粕55、棉粕45、葡萄糖30、K2HP045、Na2C035, 培养条件初始PH 7.5，35°C，培养48小时。在发酵30小时后，进行流加柠檬酸钠溶液，溶 液中柠檬酸钠浓度为0. 5-10g/L，总流加量为发酵液重量的1%，均勻流加至发酵结束。
放罐时，经DNS法测定，碱性果胶酶活100u/mL(酶活力单位定义为在pH 10，温 度55°C条件下每分钟降解半乳糖醛酸钠产生1 μ mol半乳糖醛酸所需的酶量为1个酶活力 单位。)
发酵后处理液态发酵后高速离心，收集离心液，加入0.5%苯甲酸钠防腐剂，即 得清澈碱性果胶酶溶液。
实施例2
种子培养基组成(g/L计)菜粕85、棉粕100、葡萄糖55、K2HP0414，Na2C0313，培养 条件初始PH 8. 5，37°C，在500L种子罐(60%装料量)中培养10小时后转入5吨发酵罐 (60%装料量)中，培养基组成为(g/L计)，菜粕55、棉粕100、葡萄糖50、K2HP0414、Na2C0313， 培养条件初始PH 8.5，35°C，培养60小时。在发酵30小时后，进行流加柠檬酸钠溶液，溶 液中柠檬酸钠浓度为0. 5-10g/L，总流加量为发酵液重量的1%，均勻流加至发酵结束。
其余条件同实施例1。
权利要求
一株产碱性果胶酶的细菌，其分类命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP-CO-01，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM207194。
2.一种利用权利要求
1所述细菌生产碱性果胶酶的方法，其特征在于，采用短小芽孢 杆菌(Bacillus pumiluS)BP-C0-01为出发菌株，经过种子培养和液体发酵培养，经后处理 得到碱性果胶酶溶液；种子培养种子培养基以g/L计菜粕20-100、棉粕40-120、葡萄糖20-60、磷酸氢 二钾5-15、碳酸钠5-15，培养条件:500L种子罐，60 %装料量，初始pH7. 5-9. 0，培养温度 30-40°C，培养时间 8-16h ；液体发酵培养液体发酵培养基以g/L计菜粕50-100、棉粕40-120、葡萄糖20-60、磷 酸氢二钾5-15、碳酸钠5-15，培养条件5吨发酵罐，60%装料量，初始pH 7. 0-9. 0，培养温 度30-40°C，培养时间36-60h ；在发酵30h后流加柠檬酸钠溶液，流加的溶液中柠檬酸钠浓 度为0. 5-10g/L，总流加量为发酵液重量的1%，均勻流加至发酵结束。
3.根据权利要求
2所述的方法，其特征是发酵液后处理液态发酵后发酵液经高速离 心或者压滤，滤液用截留分子量为lOOOODa的中空纤维管式超滤膜浓缩，收集浓缩液，即得 碱性果胶酶溶液。
专利摘要
一种产碱性果胶酶菌株及其发酵生产碱性果胶酶的方法，属于生物工程技术领域：
。本发明提供了一株产碱性果胶酶的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP-CO-01突变株，并提供了用该菌株在液体流加培养基中发酵制备碱性果胶酶的方法。本发明菌种为从山东烟台某葡萄处理工厂土壤中分离后诱变得到，本发明以菜粕为碳源的诱导物，豆粕为氮源，添加适当葡萄糖、磷酸氢二钾、碳酸钠和水分，在发酵后期流加柠檬酸钠以控制发酵液中蛋白酶的含量，减少蛋白酶对短小芽孢杆菌表达的其他酶的分解，从而达到产碱性果胶酶。发酵液过滤后，滤液即碱性果胶酶溶液，超滤浓缩得到浓缩酶液或通过其他后加工方式得到不同的碱性果胶酶制剂，如微丸，颗粒或粉剂。
文档编号C12R1/08GKCN101514328 B发布类型授权 专利申请号CN 200810020636
公开日2010年11月3日 申请日期2008年2月19日
发明者周伟峰, 王清声, 陶丁伟, 魏晨飞 申请人:无锡德冠生物科技有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (2),