一种碱性普鲁兰酶的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种碱性普鲁兰酶的制备方法及应用。本发明以好热地芽孢杆菌Geobacillus?kaustophilus?MCCC1A02570的基因组DNA为模板，设计并合成引物，通过PCR扩增普鲁兰酶基因,将该基因克隆入pET-22b表达载体上，在大肠杆菌E.coli?BL21中进行诱导表达，采用Ni-Sepharose亲和层析纯化得到高纯度的重组普鲁兰酶蛋白。该酶的最适温度为70℃，最适pH为8.0，在碱性条件下具有较高的活性和良好的耐热性。该酶的最适底物为普鲁兰糖，并且其水解支链淀粉和糯米淀粉的能力明显高于直链淀粉，显示其具有较好的水解支链的能力。该酶在生产高麦芽糖浆和高葡萄糖浆以及在洗涤剂工业中有潜在的应用前景。
【专利说明】—种喊性普鲁兰酶的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及采用基因工程手段获得一种碱性普鲁兰酶及其制备方法，属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]淀粉中的葡萄糖残基主要以α-(1，4)糖苷键相连，支链淀粉中平均每24~30个葡萄糖单位中就有一个分支，分支处以α-(1，6)糖苷键相连，α-(1，6)糖苷键约占支链淀粉糖苷键总量的4~6%。工业生产常用的谷类淀粉中，支链淀粉含量高达70~95%。传统的淀粉酶仅能水解α-(1，4)糖苷键，因此在工业生产中无法实现对支链淀粉的高效利用。异淀粉酶能够水解α-(1，6)糖苷键，因此被广泛用于淀粉酶工业中，然而其不能水解由2~3个葡萄糖残基构成的短支链，仍然无法实现对支链淀粉的充分利用。普鲁兰酶不仅能专一性地水解α-(1，6)糖苷键，并且还能将最小单位的支链分解，因此可最大限度地利用淀粉原料。目前普鲁兰酶已被广泛地应用于淀粉糖化、生产高葡萄糖浆、生产高麦芽糖浆、生产环糊精等淀粉加工工业。有报道称鉴于普鲁兰酶具有较强的α-(1，6)糖苷键水解能力，有研究人员正在尝试将普鲁兰酶用于低热量啤酒的生产和牙菌斑的防治以及用作面包制作的抗氧化剂。
[0003]到目前为止，全世界用于工业生产的普鲁兰酶主要由丹麦NOVO公司和美国杰能科公司供应，其生产的酸性普鲁兰酶在市场上具有垄断地位。目前我国的普鲁兰酶还仅限于实验室研究，工业生产上严重依赖进口，定价权掌握在少数外国公司手中，导致国内普鲁兰酶价格昂贵。碱性普鲁兰酶在碱性条件下有较稳定的酶活，且耐热性也比较好，可显著提高淀粉原料的利用率。另外，碱性普鲁兰酶还可作为有效添加剂应用于洗涤剂中，从而拓宽了普鲁兰酶在工业生产中的应用。高温碱性普鲁兰酶具有广阔的市场前景，然而其在世界范围内都尚处于研究阶段。
[0004]嗜热菌是一类生活在高温环境中的微生物，其产生的高温酶具有很高的热稳定性，是获取高温碱性普鲁兰酶的良好来`源。嗜热微生物最适生长温度很高，发酵工艺非常困难，因此利用基因工程技术改造菌株成为生产普鲁兰酶的有效手段。好热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus MCCC1A02570)是一株从深海热液口分离得到的嗜热细菌，其最适生长温度为55°C。该菌对极端环境具有较好的适应性，其可在pH2-12、温度5-78°C、盐度0-30%的极端环境中生长。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种高温碱性普鲁兰酶及其制备方法及产品。
[0006]该酶的最适温度为70°C，最适pH为8.0，在碱性条件下具有较高的活性和良好的耐热性。
[0007]该酶的核苷酸序列如下:(SEQ ID N01)
【权利要求】
1.一种表达普鲁兰酶的核苷酸序列，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。
2.一种核苷酸序列，其和权利要求1所述的核苷酸序列互补。
3.—种普鲁兰酶，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID N02所示。
4.如权利要求3所述的普鲁兰酶在生产高麦芽糖浆和高葡萄糖浆以及在洗涤剂工业中的应用。
5.如权利要求3所述的普鲁兰酶的制备方法，包括如下步骤: (1)设计并合成扩增碱性普鲁兰酶基因的引物，其序列如下:
上游引物 2570F:5’ -CTATCATATGCTTCACATCAGCCGA-3’
下游引物 2570R:5’ -GTTACTCGAGCCCTGCAGGATGG-3’ (2)PCR扩增及重组质粒的构建: 用2570F和2570R引物，以好热地芽抱杆菌(Geobacillus kaustophilusMCCC1A02570)的基因组DNA为模板进行扩增；PCR产物经限制性内切酶NdeI和XhoI酶切后被连接到经同样限制性内切酶酶切的表达载体pET-22b上，将连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5ci，筛选含有普鲁兰酶基因的重组质粒，并进行双酶切和测序验证； (3)普鲁兰酶的表达与纯化 将含有普鲁兰酶基因的重组质粒转化入大肠杆菌E.coli BL21，用IPTG诱导普鲁兰酶蛋白表达，之后蛋白纯化得到普鲁兰酶。
6.如权利要求5所述的普鲁兰酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)PCR扩增条件如下:95°C预变性 5min ；98°C 10s，`55。。30s, 72°C 140s，30 个循环。
7.如权利要求5所述的普鲁兰酶的制备方法，其特征在于，纯化蛋白采用N1-Sepharose 亲和层析。
【文档编号】C11D3/386GK103571862SQ201310250392
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年6月21日 优先权日:2013年6月21日
【发明者】周梅先, 陈逍遥, 阮灵伟 申请人:国家海洋局第三海洋研究所