羊抗HBsAg多克隆抗体‑碱性磷酸酶交联物及其制备方法和检测试剂盒与流程

本发明涉及体外诊断免疫分析领域。具体地说，本发明涉及羊抗HBsAg多克隆抗体-碱性磷酸酶的交联物及其制备方法和包含所述交联物的化学发光检测试剂盒。

背景技术：

免疫分析法是利用抗原-抗体的特异性结合反应检测各种物质(例如药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法。

目前临床上进行免疫分析的方法主要有胶体金法、免疫比浊法、免疫荧光法、化学发光免疫分析法等。胶体金法的缺点在于无法准确进行定量，且批间差异较大；免疫比浊法的缺点在于试剂灵敏度较差；免疫荧光法存在反应时间较长，对环境要求较高，易受空气尘埃影响，使用稀土标记物等缺点。化学发光免疫分析法是一种较为先进的免疫学方法，具有反应时间短、灵敏度高、特异性好、线性范围宽、重复性好等优点，因此是市场应用前景最好且诊断最可靠的方法学为化学发光免疫分析法。

化学发光免疫分析法需要利用抗体与酶交联物，例如碱性磷酸酶的交联物，包括酶标记免疫球蛋白G(ImmunoglobulinG,IgG)多克隆抗体、酶标记IgG单克隆抗体、酶标记免疫球蛋白M(ImmunoglobulinM,IgM)单克隆抗体或酶标记的抗原。酶标记物中比较常见的是酶标记IgG，它是通过适当的交联剂及合适的化学或物理处理方法将IgG标记到酶上面。酶标记抗体主要应用于酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和化学发光酶免疫分析(chemiluminescence enzyme immunoassay,CLIA)的定量及定性分析。

目前酶标记IgG的方法主要有以下三种(BioconjugateTechnoqies,2013年第三版)：

1.过碘酸钠法：用于标记含糖量比较高的酶，此法适用于辣根过氧化物酶和含糖的重组碱性磷酸酶。主要原理是利用过碘酸钠的氧化性，氧化酶分子表面的多糖基团形成易被亲核试剂进攻的醛基基团，在酶标记实验中通常所谓的亲核试剂就是待标记蛋白上赖氨酸残基上的伯氨基团，也就是说被过碘酸钠氧化的酶和IgG交联后形成希夫氏碱(Schiff base)，从而达到交联效果。该方法缺点是操作周期比较长，而且过程复杂，在标记过程中对酶活性有一定损伤，交联形成的希夫氏碱(Schiff base)不稳定，需要加入还原剂才能形成稳定的比较化学键。

2.碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺法：该方法利用一种能够将羧基与氨基相互交联的零长度交联剂(碳二亚胺类盐酸盐)，碳二亚胺首先与待标记的免疫球蛋白G上的羧基基团反应形成一个可以氨基反应的O-酰基异脲中间体，该中间体能够迅速与一个氨基基团形成酰胺键并且释放一个没有反应活性的异脲副产物。中间体在水溶液中十分不稳定，需要依赖于N-羟基琥珀酰亚胺进行稳定化。未与氨基反应的中间体会水解生成羧基和N-取代尿素。该方法的缺点是由于标记过程使用的是没有臂长的零长度交联剂，导致所形成的酶抗体交联物会存在空间位阻，从而使标记酶的抗体对于待测物的特异性反应受到一定阻碍，在标记多克隆抗体的实验中影响尤为明显，从而导致免疫分析实验的灵敏度偏低。

3.戊二醛法：该方法在碱性磷酸酶标记实验中也比较常见，戊二醛含有两个易被亲核试剂进攻的醛基基团，标记过程中，以戊二醛为桥，分别使酶与待标记的IgG分子上的氨基基团结合，从而形成偶联物。戊二醛法的缺点是容易发生蛋白的自交联现象，会形成单一组分的多聚体，导致酶标记物的活性和标记效率较低，影响免疫分析实验的灵敏度。

因此，酶标记抗体的质量直接影响免疫分析最后的测定结果，是影响化学发光免疫试剂检测灵敏度的关键技术。酶交联物的质量取决于酶本身的活性、IgG的特异性和先进的制备工艺。

目前市面上的化学发光试剂质量参差不齐，影响临床检测。

因此，本领域急需灵敏度高、标记后的交联物各组分的活性及特异性保持良好、并且制备周期短的酶标记免疫球蛋白。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种羊抗HBsAg多克隆抗体交联碱性磷酸酶交联物，所述交联物应具备交联效率高，多克隆抗体识别捕获抗原的能力不受影响，检测灵敏度高，其中各组分的活性及特异性保持良好，以及制备周期短、操作简便等优点。

本发明的另一目的是提供包含所述羊抗HBsAg多克隆抗体交联碱性磷酸酶交联物的检测试剂盒。

在第一方面，本发明提供一种抗体-碱性磷酸酶交联物，所述交联物由羊抗HBsAg多克隆抗体、通式I所示的双功能交联剂或它的盐和碱性磷酸酶构成，

式I中，R为取代或未取代的C_2-10烷基链，优选C_2-6烷基链，更优选C₂烷基链，烷基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、硫基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基和羧基；

或者，式I中，R是取代或未取代的环己烷基、苯基、聚乙二醇(PEG)_n，其中n可以为2、4、6、8、12、24，优选n为2、4、6，更优选n为2。

在具体的实施方式中，R为聚乙二醇(PEG)₂。

在第二方面，本发明提供本发明第一方面所述的抗体-碱性磷酸酶交联物的制备方法，包括：

1)用式I所示双功能交联剂标记碱性磷酸酶分子；

2)用蛋白酶酶解羊抗HBsAg多克隆抗体分子，从而得到Fab片段和Fc片段；

3)将步骤1)得到的双功能交联剂标记的碱性磷酸酶分子与步骤2)得到的经蛋白酶酶解的羊抗HBsAg多克隆抗体分子对接反应，形成标记有碱性磷酸酶的羊抗HBsAg多克隆抗体。

在具体的实施方式中，所述蛋白酶是木瓜蛋白酶。

在优选的实施方式中，本发明的抗体-碱性磷酸酶交联物的制备方法在以下工艺参数范围内实施：

在步骤1)中，所述双功能交联剂的摩尔数是碱性磷酸酶分子摩尔数的5-500倍，优选5-50倍；

在步骤2)中，所述蛋白酶，例如木瓜蛋白酶分子摩尔数是羊抗HBsAg多克隆抗体分子摩尔数的0.1-100倍，优选0.1-10倍；

在步骤3)中，所述双功能交联剂标记的碱性磷酸酶分子摩尔数和经木瓜蛋白酶酶解的羊抗HBsAg多克隆抗体分子摩尔数的比例为1:1-20:1，优选1:1-5:1。

在第三方面，本发明提供本发明第一方面所述的抗体-碱性磷酸酶交联物在制备乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)检测试剂盒中的用途。

在第四方面，本发明提供种乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)检测试剂盒，所述试剂盒装有本发明第一方面所述的抗体-碱性磷酸酶交联物。

在具体的实施方式中，所述试剂盒装有试剂1(R1)，包含乙型肝炎病毒表面抗体单抗包被的磁微粒、缓冲液、防腐剂；试剂2(R2)，包含小牛血清、权利要求1或2所述的抗体-碱性磷酸酶交联物、缓冲液、防腐剂；和定标品A，包含小牛血清、乙型肝炎病毒表面抗原、缓冲液、防腐剂。

在第五方面，本发明提供本发明第四方面所述的检测试剂盒的制备方法，所述方法包括：

将本发明第一方面所述的抗体-碱性磷酸酶交联物制成检测试剂盒。

在第六方面，本发明提供一种检测方法，所述检测方法包括利用本发明第一方面所述的抗体-碱性磷酸酶交联物或本发明第三方面所述的检测试剂盒体外检测人血清或血浆样本中的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。

附图说明

图1显示了利用双功能交联剂(琥珀酰亚胺酯-马来酰亚胺交联剂)标记碱性磷酸酶分子的过程；其中，分子式1表示琥珀酰亚胺酯-马来酰亚胺双功能交联剂；分子式2中，R₁代表碱性磷酸酶分子、NH₂是碱性磷酸酶分子表面赖氨酸残基上的伯氨基团；分子式3是N-羟基琥珀酰亚胺，交联反应的副产物，其可以通过脱盐步骤去除；分子式4是标记有马来酰亚胺基团的碱性磷酸酶分子，该基团能够与巯基基团反应；

图2显示经过蛋白酶酶解的羊抗HBsAg多克隆抗体，分别为Fab段(含有巯基基团)和Fc段；

图3显示将经过双功能交联剂(琥珀酰亚胺酯-马来酰亚胺交联剂)标记碱性磷酸酶分子与经过蛋白酶酶解的多克隆抗体分子对接反应，从而得到标记有碱性磷酸酶的羊抗HBsAg多克隆抗体；其中分子式4是标记有马来酰亚胺基团的碱性磷酸酶分子，该基团能够与巯基基团反应；分子式5中，R₂表示经过蛋白酶酶解的羊抗HBsAg多克隆抗体的Fab段，它含有暴露在分子表面的巯基基团(-SH)；分子式6表示标记了碱性磷酸酶的羊抗HBsAg多克隆抗体，R₁代表碱性磷酸酶分子，R₂表示羊抗HBsAg多克隆抗体的Fab片段；

图4是本发明所用的琥珀酰亚胺酯-马来酰亚胺交联剂的结构示意图。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现利用特定的双功能交联剂和特定的蛋白酶酶解技术相结合，进行标记碱性磷酸酶分子与多克隆抗体分子时，交联效率高，得到的标记有碱性磷酸酶的羊抗HBsAg多克隆抗体稳定、检测特异性和灵敏度高并且反应操作简便，酶标记物的活性和标记效率也得到显著提高。在此基础上完成了本发明。

本发明的双功能交联剂

如上所述，发明人出乎意料地发现利用特定的双功能交联剂和特定的蛋白酶酶解技术相结合，进行标记碱性磷酸酶分子与多克隆抗体分子时，能够产生显著的技术效果。

本发明所用的双功能交联剂是琥珀酰亚胺酯-马来酰亚胺交联剂，其如式I所示：

式I中，R为取代或未取代的C_2-10烷基链，优选C_2-6烷基链，更优选C₂烷基链；烷基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、硫基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基和羧基；

或者，式I中，R是取代或未取代的环己烷基、苯基、聚乙二醇(PEG)_n，其中n可以为2、4、6、8、12、24，优选n为2、4、6，更优选n为2。

本领域技术人员基于本发明的教导以及本领域的公知常识，可以根据需要确定R的具体选择。例如，在具体的实施方式中，本发明利用的双功能交联剂是式I所示的琥珀酰亚胺酯-马来酰亚胺双功能交联剂，其中R为聚乙二醇(PEG)₂。

羊抗HBsAg多克隆抗体-碱性磷酸酶交联物及其制备方法

本发明的抗体-碱性磷酸酶交联物由羊抗HBsAg多克隆抗体、上述的双功能交联剂和碱性磷酸酶构成。

本发明的羊抗HBsAg多克隆抗体-碱性磷酸酶交联物如下所述制备：

步骤一：

利用双功能交联剂(琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇(PEG)₂-马来酰亚胺交联剂)标记碱性磷酸酶分子，该交联剂的一端琥珀酰亚胺酯能够与碱性磷酸酶分子表面上赖氨酸残基的伯胺基团反应，从而形成标记有马来酰亚胺基团的碱性磷酸酶分子。

上述步骤一如图1所示，其中，分子式1表示琥珀酰亚胺酯-马来酰亚胺双功能交联剂；分子式2中的R₁代表碱性磷酸酶分子，NH₂就是碱性磷酸酶分子表面赖氨酸残基上的伯氨基团；分子式3是N-羟基琥珀酰亚胺，其是交联反应的副产物，可以通过脱盐步骤去除；分子式4表示标记有马来酰亚胺基团的碱性磷酸酶分子，该基团能够与巯基基团反应；

步骤二：

抗体分子可以用适当的蛋白酶(优选木瓜蛋白酶)酶解，将羊抗HBsAg多克隆抗体经过酶解后得到Fab片段和Fc片段，Fab片段含有完整的抗原识别区域从而不会影响最后的交联产物的活性。同时，经过蛋白酶酶解的多克隆抗体分子含有暴露在分子表面的巯基基团，该基团具有能够与马来酰亚胺基团反应的特性。

图2显示了经过蛋白酶酶解的羊抗HBsAg多克隆抗体，分别为Fab段(含有巯基基团)和Fc段。

步骤三：

最后，将经过双功能交联剂(琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇(PEG)₂-马来酰亚胺交联剂)标记的碱性磷酸酶分子，与经过木瓜蛋白酶酶解的多克隆抗体分子对接反应，经过一定的摩尔比混合，在特定的反应条件下形成标记有碱性磷酸酶的羊抗HBsAg多克隆抗体。

上述步骤三如图3所示，其中，分子式4为标记有马来酰亚胺基团的碱性磷酸酶分子，该基团能够与巯基基团反应；分子式5中的R₂表示经过蛋白酶酶解的羊抗HBsAg多克隆抗体的Fab段，它含有暴露在分子表面的巯基基团(-SH)；分子式6表示标记了碱性磷酸酶的羊抗HBsAg多克隆抗体，其中R₁代表碱性磷酸酶分子，R₂表示羊抗HBsAg多克隆抗体的Fab片段。

上文所述的羊抗HBsAg多克隆抗体-碱性磷酸酶交联物的制备方法可以在以下工艺参数范围内实施：

步骤一：在含有一定量的碱性磷酸酶溶液中加入琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇(PEG)₂-马来酰亚胺交联剂，其中碱性磷酸酶溶液浓度为1mg/mL-10mg/mL,优选2mg/mL-5mg/mL；碱性磷酸酶溶液需保存在PBS缓冲溶液中，缓冲溶液pH值为7.0-7.5(优选pH7.2-7.3)；该交联剂分子的摩尔数和碱性磷酸酶分子的摩尔数比例为2:1-30:1，优选10:1-20:1；反应条件为室温；加入交联剂后1小时内(优选15-30分钟)需进行纯化操作，纯化的方式可以为超滤纯化、脱盐柱纯化或透析纯化，优选超滤纯化；纯化完成后的碱性磷酸酶溶液可在2-8℃环境中保存。

步骤二：在含有一定量的羊抗HBsAg多克隆抗体溶液中加入木瓜蛋白酶，其中羊抗HBsAg多克隆抗体溶液的浓度为1mg/mL-10mg/mL，优选2mg/mL-3mg/mL；羊抗HBsAg多克隆抗体需保存在醋酸钠缓冲液中，缓冲溶液pH值为4.0-5.5(优选pH4.0-4.5)；木瓜蛋白酶分子的摩尔数和羊抗HBsAg多克隆抗体分子的摩尔数比例为1:10-100:1，优选1:10-10:1；反应条件为37℃；加入胃蛋白酶后12小时内(优选8-12小时)需进行纯化操作，纯化方式可以为超滤纯化、脱盐柱纯化或透析纯化，优选超滤纯化；纯化完成后的羊抗HBsAg多克隆抗体可在2-8℃环境中保存。

步骤三：将上述步骤一和步骤二得到的碱性磷酸酶溶液和羊抗HBsAg多克隆抗体混合后进行反应，碱性磷酸酶分子摩尔数和羊抗HBsAg多克隆抗体分子摩尔数比例为1:1-20:1，优选1:1-5:1；反应温度为4-37℃；反应时间为1.5-18小时；反应时间结束后即可得到羊抗HBsAg多克隆抗体-碱性磷酸酶交联物。

本发明的检测试剂盒

本发明的羊抗HBsAg多克隆抗体-碱性磷酸酶交联物可以用于制备HBsAg检测试剂盒或用于酶联免疫吸附测定或用于化学发光免疫分析。因此，本发明进一步提供一种检测试剂盒，所述试剂盒装有上文所述的抗体-碱性磷酸酶交联物。

鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员可以确定本文所述的检测试剂盒中的其它组分，例如，在具体的实施方式中，本发明的检测试剂盒组份包括：试剂1(R1)(乙型肝炎病毒表面抗体单抗包被的磁微粒，缓冲液，防腐剂)；试剂2(R2)(小牛血清，权利要求1或2所述的抗体-碱性磷酸酶交联物，缓冲液，防腐剂)；定标品A(小牛血清，乙型肝炎病毒表面抗原，缓冲液，防腐剂)。

本发明的检测试剂盒可如下所述制备，包括：将本发明的羊抗HBsAg多克隆抗体-碱性磷酸酶交联物制成检测试剂盒。在具体的实施方式中，本发明的检测试剂盒的制备方法包括将以下试剂制成检测试剂盒：试剂1(R1)(乙型肝炎病毒表面抗体单抗包被的磁微粒，缓冲液，防腐剂)；试剂2(R2)(小牛血清，权利要求1或2所述的抗体-碱性磷酸酶交联物，缓冲液，防腐剂)；定标品A(小牛血清，乙型肝炎病毒表面抗原，缓冲液，防腐剂)。所述检测试剂盒中还可装有使用说明书和用于移液的合适器件。

本发明的检测方法

在本发明的羊抗HBsAg多克隆抗体-碱性磷酸酶交联物以及包含其的检测试剂盒的基础上，本发明还提供一种检测检测离体人血清或血浆样本中的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的方法，所述方法利用本发明的羊抗HBsAg多克隆抗体-碱性磷酸酶交标记交联物，或本发明的羊抗HBsAg多克隆抗体-碱性磷酸酶交联物以及检测试剂盒检测离体人血清或血浆样本中的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。

本领域技术人员知晓，本发明的检测方法可以用于诊断目的，但不限于诊断目的，例如，可用于科研目的等。

本发明的优点：

1.本发明的交联碱性磷酸酶和羊抗HBsAg多克隆抗体的方法不会造成各蛋白自身产生自交联现象，从而提高了两者的交联效率；

2.采用本发明的双功能交联剂不会发生因空间位阻导致的多克隆抗体识别捕获抗原的能力降低的缺陷；

3.本发明的羊抗HBsAg多克隆抗体交联碱性磷酸酶交联物具备优异的检测灵敏度；

4.本发明的羊抗HBsAg多克隆抗体交联碱性磷酸酶交联物中，各组分的活性、特异性及稳定性保持良好；

5.本发明的羊抗HBsAg多克隆抗体交联碱性磷酸酶交联物的制备周期短、操作简便。

实施例

实施例1

将10mg碱性磷酸酶溶解于4mL 10Mm PBS缓冲液(pH7.5)中,使碱性磷酸酶溶液终浓度为2.5mg/mL；同时将5mg琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇(PEG)₂-马来酰亚胺交联剂溶解于1mL超纯水中，使得交联剂终浓度为5mg/mL；在上述碱性磷酸酶溶液中加入150μl琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇(PEG)₂-马来酰亚胺溶液。25℃反应15分钟后，用15mL 10KD截留分子量的超滤管，以10Mm PBS缓冲液(pH7.5)作为换液缓冲液，5000rpm超滤3遍，除去游离的交联剂和交联反应副产物，得到标记琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇(PEG)₂-马来酰亚胺的碱性磷酸酶溶液。

将10mg羊抗HBsAg多克隆抗体溶解于3mL 15mM醋酸钠缓冲液(pH4.0)，在上述羊抗HBsAg多克隆抗体溶液中加入2mg木瓜蛋白酶。37℃反应8小时候后，用15mL 10KD截留分子量的超滤管，以10Mm PBS缓冲液(pH7.5)作为换液缓冲液，5000rpm超滤3遍，得到经过酶解的羊抗HBsAg多克隆抗体。

将上述处理后的羊抗HBsAg多克隆抗体溶液和碱性磷酸酶溶液混合后，即可得到交联物。

实施例2

参考BioconjugateTechnoqies,2013年第三版中的戊二醛法、过碘酸钠法和碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺法，制备碱性磷酸酶标记的羊抗HBsAg多克隆抗体溶液。将实施例1中得到的羊抗HBsAg多克隆抗体-碱性磷酸酶交联物溶液以及用戊二醛法、过碘酸钠法和碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺法得到的羊抗HBsAg多克隆抗体-碱性磷酸酶交联物溶液用于乙型肝炎病毒表面抗原的化学发光酶免疫分析检测。

本实验的待测样本为5IU/mL的乙型肝炎病毒表面抗原样本，0IU/mL的乙型肝炎病毒表面抗原样本，固相为包被有抗HBsAg的磁微粒，酶标记物为上述各个方法制备的羊抗HBsAg多克隆抗体-碱性磷酸酶交联物，化学发光底物为Lumiphos530(购自贝克曼库尔特公司)，用C1800型全自动化学发光免疫分析仪(上海科华实验系统有限公司)进行化学发光酶免疫分析检测；仪器设置参数为样本加样量100uL，磁微粒加样量50uL,酶标记物溶液50uL,化学发光底物200uL,仪器设置为一步法反应；用3份样本进行测量，取平均值，结果见表1。5IU/mL样本所得发光值越大，0IU/mL所得发光值越小，说明酶标记物的灵敏度高，特异性好。

表1.各方法标记的羊抗HBsAg多克隆抗体-碱性磷酸酶交联物检测发光值对比结果

由表1结果可知，采用本发明的标记工艺制备的羊抗HBsAg多克隆抗体-碱性磷酸酶交联物，试剂的活性显著优于常规的标记方法。

实施例3

将实施例1和实施例2中制备的羊抗HBsAg多克隆抗体-碱性磷酸酶交联物配置成乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)检测试剂盒(化学发光法)的试剂2(R2)工作溶液，将上述工作溶液分别在4℃和37℃环境下放置6天，同样按照实施例2中的方法进行乙型肝炎病毒表面抗原的化学发光酶免疫分析检测。本实验待测样本为5IU/mL的乙型肝炎病毒表面抗原样本，用3份样本进行测量，取平均值，结果见表2。

表2.各方法标记的酶交联物的热加速稳定性对比结果

由表2结果可知，采用本发明的标记工艺制备的羊抗HBsAg多克隆抗体-碱性磷酸酶交联物，试剂的稳定性明显优于常规的标记方法。

因此，本发明的出乎意料的技术效果是利用特定的双功能交联剂交联特定的酶，即，碱性磷酸酶和特定的抗体，即羊抗HBsAg多克隆抗体，优选木瓜蛋白酶处理的羊抗HBsAg多克隆抗体下取得的。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。