专利名称：虾碱性磷酸酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及碱性磷酸酶，具体涉及到源自北方长额虾(Pandalus borealis)的这种酶和编码该酶的核酸分子。
碱性磷酸酶(E.C.3.1.3.1)，又称为碱性磷酸单酯酶，磷酸单酯酶或甘油磷酸酶，是在碱性条件下有最适宜的酶活性的正磷酸-单酯磷酸水解酶。碱性磷酸酶(ALP)的底物为DNA，RNA，和核(糖核)苷与脱氧核(糖核)苷三磷酸。水解产生醇和正磷酸盐。换一角度来说，ALP使DNA，RNA，rNTP，dNTP去磷酸化。不同ALP的蛋白质去磷酸化作用也有报道。ALP在自然界中广泛存在，在从细菌到人类的多种生物中都可以找到。复杂生物一般既含有组织特异性ALP又含有非特异性ALP。这些多肽的大小从15kDa到170kDa不等。其中一些蛋白结合或“锚定”在细胞膜上。最常见的是，这些酶必需二价的金属阳离子，例如Mg2+，或Zn2+。
现在在分子生物学中对ALP的应用集中在，但并不局限于，三种主要的分析或制备DNA的方法1)在限制性酶消化后，使载体DNA去磷酸化，以便消除克隆载体的自我连接，从而有利于使插入子与载体连接并产生重组构建体，2)在PCR扩增后使dNTP去磷酸化，结合应用单链核酸外切酶水解引物使之变成dNTP，从而省略了PCR产物直接进行DNA测序前的杂质清除的步骤，或3)使DNA末端去磷酸化，而方便随后用[γ-32P]NTP和T4多核苷酸激酶进行32P标记。所描述的ALP酶反应是DNA分析过程的中间步骤。本技术领域已知的其它重要应用包括那些把酶活性当作标示的应用，例如在酶联免疫吸附试验(ELISA)中，在基因融合或基因传递系统中，或与寡核苷酸偶联用做杂交探针时。
市售产品中所用的三种主要ALP是；I)小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)II)产自北极的北方长额虾的虾碱性磷酸酶(SAP)III)细菌碱性磷酸酶(BAP)动物的CIAP和SAP有着相近的比活性，为2000-4000单位/mg蛋白，而BAP蛋白的比活性为50单位/mg，因此前两种酶作为高效酶更有吸引力。如下面所述，SAP在中等加热条件下失活，所以它优选应用于一些在进行后续步骤之前需要将酶活性除去的应用中。
已有人报道了一种基因工程化温度敏感型BAP变体[Shandilya，H.AndChatterjee，D.K.，1995.一种用于DNA去磷酸化的基因工程热敏感型碱性磷酸酶。Focus，17(3)93-95]，但没有给出其工程化细节。这种由LifeTechnologies，Inc.出售的突变酶(TsAP)在只有EDTA存在的情况下因加热(65℃，15分钟)失活(95％或更多)。这种突变体和野生型酶的建议反应温度也是65℃。TsAP的酶活性比野生型BAP的酶活性高40倍。由于TsAP很高的比活性，使得它几乎可以与其它的ALP如CIAP和SAP相当。
两种嗜冷微生物的热敏感型ALP已经被纯化并定性[de Prada，P.，andBrenchley，J.E.，1997，来自一种嗜冷性节杆菌(Arthrobacter)分离株的两种细胞外碱性磷酸酶的纯化与鉴定，Appl.Env.Microbiol.，63(7)2928-2931]。两种酶的底物特异性和动力学特征不同，它们显示出不同的热敏感性，其中对热最敏感的一种具有与SAP相似的热敏感性。没有关于它们的以单位/mg表示的比活性和一级结构的报道。
一种大西洋鳕的适冷型ALP被分离出并定性[Asgeirsson，B.，Hartemink，R.，and Chlebowski，J.F.，1995，大西洋鳕(Gadus morhua)碱性磷酸酶。能显示其对低温的适应的动力学和结构性质。Comp.Biochem.Physiol.，110B(2)315-329]。这种酶显示出与SAP相似的热敏感性。没有提供其基因/蛋白的一级结构。
一项关于鲑鱼的ALP同工酶的研究[Whitmore，D.H.，and Goldberg，E.，1972，Trout intestinal alkaline phosphatase II.The effect of temperatures uponenzymatic activity in vitro and in vivo.J.Exp.Zool.，18259-68]表明，环境温度会影响同工酶模式，并且一些同工型是热敏感型的。
台湾周围温水海域中的虾含有几种ALP[Lee，A.-C.，and Chuang，N.-N.，Characterization of different molecular forms of alkaline phosphatase in thehepatopancreas from shrimp Penaeus monodon(CrustaceaDepacoda).Comp.Biochem.Physiol.，99B(4)845-850]，这些酶被定论为热稳定型。没有提供一级结构。
在捕虾工业处理废水中发现含有一种来自北极的北方长额虾肝胰脏的碱性磷酸酶[Olsen，R.L.，Johansen，A.，and Myrnes，B.，1990，Recovery ofenzymes from shrimp waste.Process Biochem.2567-68]，后来这种酶被从肝胰脏中纯化出来[Olsen，R.L.， K.and Myrnes，B.，1991，Alkalinephosphatase from hepatopancreas of Shrimp(Pandalus Borealis)a dimericenzyme with catalytically active subunits.Comp.Biochem.Physiol.99B(4)755-761]。这种纯化蛋白的表观分子量为65kDa(每个亚单位)，且显示为一种具有催化活性亚单位的二聚体酶，而其它大多数动物性ALP与它相反，它们必需经过二聚化才能发挥活性。根据该报道，SAP的等电点为3.7。虽然5’突出末端比平末端或5’凹陷末端反应性更强，这种虾酶可以从限制性内切酶产生的任何DNA链末端(5’和3’突出末端或平末端)有效地去除5’末端磷酸。
相对于CIAP，SAP活性所需的温度稍低，但并不认为它是真正的低温激活。在大约40℃时酶活性达到最高(CIAP为45℃)，在10℃或50℃时酶活性保留了几乎40％，而与之相比的CIAP分别保留了10％和90％的活性。虽然SAP活性达到最高时的温度接近40℃，但该酶在高于37℃的条件下预热15分钟就会开始失去活性。在65℃的条件下预热后，酶活性会失去95％或更多，而在70℃预热后活性就检测不出来了。与之相比，CIAP经过相似的热处理还能分别保留40％和20％的活性。
所以，相对于它的商业竞争产品，SAP是热敏感的，并且是低温激活，使得它特别适用于那些多步骤的实验室方案，在这样的方案中一个简单的加热步骤就可以使SAP失活，使它不参与以后的方法步骤。
BIOTEC ASA， Norway，从捕虾工业废水中生产商用SAP。在捕虾船上，刚捕的鲜虾被冻成大块。船靠岸后，这些虾被再循环的冷水小心地解冻。每4000千克虾大约用1000升水。在冷冻与解冻的过程中，虾的肝胰脏破裂，里面的物质就释放到水中。然后这些废水被回收，再经过几次层析步骤来纯化SAP。
生产商们通过一些知名的公司例如USB，Boehringer-Mannheim或Amersham Pharmacia Biotech，向全球市场供应SAP。
由于它的高比活性和DNA末端的多功能性，和它的相对热敏感性，SAP经常被用于在连接反应之前使克隆载体去磷酸化，在DNA测序反应之前对PCR扩增产物混合物进行处理，如美国专利5,741,676和5,756,285所述。
现在的SAP生产受到了捕虾废水质量不稳定的困扰，影响了生产效率。产生质量不稳定的因素有，I)虾体内酶的生产随自然季节而变化，和II)虾源冷冻之前或期间的操作以及解冻期间或之后对虾或水的操作。
还存在对废水的未来可利用性的担忧；I)虾作为一种自然资源，并不能保证一直都能有供应；II)捕虾工业正在寻找一种新的冷冻虾的方法，也就是，单冻法，通过这种方法可检测出废水中酶，例如SAP的含量十分小。
除了这些实际的问题，市场还有对重组SAP产品的需求，因为重组产品经常被优选应用于分子生物学技术中，特别是当产品纯度成为要注意的问题时，例如，在生产基于DNA的治疗药物时或在法医学领域中。SAP在酶学与物理化学性质上有着很大的优势，所以在应用它的实验室操作中是优选的酶。所以，市场会对单一纯化形式的合成或重组SAP有可观的需求。然而，SAP的DNA和氨基酸序列此前还没有被阐明。
为了分离基因然后克隆并生产重组SAP，已有多人尝试获取纯化蛋白的N末端序列。但是这些尝试都没有成功。序列分析显示，每一具体N末端位点有多个(4个或多个)可替换的氨基酸。所以，即使用上了高度简并寡核苷酸探针，也没有得到可用来获得SAP基因的蛋白质序列信息。在表面上看来均相的酶制品中出现非同源N末端的原因就只有推测了。可能是因为这些SAP同工型是由不同基因产生，经过不同剪接，或经过不同的蛋白质翻译后修饰，再或SAP被蛋白酶攻击过，但检测不到分子量的减少。
本发明人还发现，北极的北方长额虾肝胰脏碱性磷酸酶与已经过测序的其他物种的碱性磷酸酶之间有限的同一性，妨碍了使用常规方法分离编码北方长额虾碱性磷酸酶的核酸序列。
虽然要得到SAP的相关共有氨基酸序列有这些困难，本发明人还是令人惊奇的从北方长额虾的cDNA文库中分离出了编码SAP的cDNA，从而阐明了SAP的编码序列。本发明涉及SAP cDNA的制备和它在提供这种酶的另一新来源中的应用。
SEQ ID NO.1对应于该酶除去5’端一小部分序列后的cDNA全序列。然而，包含了这段序列的核酸分子的表达产物被认为拥有天然酶全部或至少大部分(就是至少60％，70％，80％或通常至少90％)的活性。这个序列末端丢失的几个N末端氨基酸不包括底物或辅助因子的结合位点。
所以一般认为这里涉及的SAP或热敏感型碱性磷酸酶还包括那些比自然产生的ALP小，但是却有相同或基本相同酶活性的分子。更加有利的是，这些本发明的表达产物和其它重组ALP酶可以比分离出的自然产生的酶有更强的活性。优选比活性高于SAP公布值1900 U mg-1。测量酶活性所适用方法按[Olsen et al.]中所描述。
因此在一方面，本发明提供了一种(分离的)核酸分子，该分子包括(优选组成为)SEQ ID No.1所示核苷酸序列，或者与之有至少55％的序列同一性的序列，和/或能在中严紧度条件下与SEQ ID No.1的互补序列杂交的序列，或与上述序列的互补序列，其中所述核苷酸序列编码一热敏感型碱性磷酸酶或与该酶编码序列互补序列杂交的序列。
依照本发明的核酸分子因此可以是单链或双链的DNA，cDNA，或RNA。
本发明的核酸分子可以是分离的核酸分子(或换句话说就是从自然界中常见的多种成分中分离出)，或可以是重组的或合成的核酸分子。
这里涉及基本上由SEQ ID No.1组成的序列和其变体。因此两个末端也可能有侧翼区。特别是，5’端侧翼区可能有1-81或1-60个核苷酸，更特别的是1-30个核苷酸，这些侧翼区带有用于指导转录/翻译过程中对酶的活性成熟形式进行加工的信号序列。3’侧翼区通常包含1-60，如1-30个额外的核苷酸。
任一给出序列的互补序列将是可以按照碱基配对原则来确定的唯一确定序列。
优选上述核苷酸序列与SEQ ID No.1或其互补序列有至少65％的，更优选至少75％，例如至少85％或至少95％的序列同一性。同样地，所述核苷酸序列优选在高严紧条件下与SEQ ID No.1或其互补序列杂交。本发明是基于对SAP的氨基酸序列和cDNA序列的鉴定，但在本领域所共识的是，这些序列的变体，例如等位基因变体和经单个或多个碱基取代、插入或缺失所修饰过的，并且在功能上与新鉴定的序列等价的相关序列是存在并且可以产生的。
本发明一个特别优选的实施例是一种分离的编码真核细胞热敏感型碱性磷酸酶和这些酶的衍生物的核酸分子，优选所述酶来自虾。所述衍生物可以包含保守的氨基酸取代，其中，天然酶的氨基酸可以被具有相似功能特性的氨基酸取代，所述特性例如大小，亲脂性，极性。氨基酸上与功能相关的基团为本领域技术人员已知。另外可包括不会明显影响酶的催化活性的插入、缺失或取代。一般而言，酶衍生物与野生型酶相比会有1-50，优选1-30，例如1-15个非保守改变。
“功能等价”一词是指核酸分子编码的多肽具有碱性磷酸酶活性，优选它们的比活性与从北方长额虾中分离出的野生型酶相比，相同或更高。换句话说，功能等价的核酸序列编码的多肽可以催化去除由，例如，限制性内切酶产生的DNA链末端(5’和3’突出末端或平末端)的末端5’磷酸基团的反应。
编码碱性磷酸酶的核苷酸序列的变异可以发生在北方长额虾物种的不同群体之间，不同地域的相似群体之间，也可以发生在相同生物中。这些变异包括在了本发明涉及的范围中。
为了定义严紧度的程度，中严紧度包括了在42℃至65℃之间，0.2xSSC-2xSSC缓冲液，1％(w/v)SDS的条件下进行的杂交和/或洗涤，高严紧度包括了在至少55℃以上，0.1xSSC-0.2xSSC缓冲液，0.1％(w/v)SDS的条件下进行的杂交和/或洗涤。杂交和洗涤的条件是本领域技术人员熟知的。
本发明范围内还包括能在高严紧度条件下与SEQ ID No.1或其互补序列，再或其部分序列(就是衍生自SEQ ID No.1的杂交探针)杂交并编码碱性磷酸酶或其部分的核酸序列。高严紧度的条件可以容易地根据本领域熟知的技术来选择，如Sambrook et al.，1989，分子克隆实验手册第二版所述。本发明范围内包括的杂交序列在非严紧条件(室温，6xSSC/50％甲酰胺)下发生结合，在高严紧度条件(例如，0.1xSSC，68℃)下进行洗涤。其中SSC＝0.1 5M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.2。
杂交探针可以是SEQ ID No.1(或互补序列)的部分序列，它的碱基长度和组成应足以使它能与样品或测试的核酸序列杂交，从而判断在高严紧度杂交是否发生。所以，探针长度至少有15个碱基，优选至少30，40，50，75，100或200个碱基的长度。有代表性的探针长度从而包括30-500个碱基的长度，例如30-300，50-200，50-150，75-100个碱基。
核苷酸序列同一性的判断可以应用University of Wisconsin设计的Genetics Computer Group(GCG)Version 10软件包的BestFit程序。该程序的使用Smith和Waterman的局部同源性运算法并设定以下默认值Gap生成罚分值＝50，Gap延伸罚分值＝3，平均匹配值＝10,000，平均错配值＝-9.000。
产生本文所述具体变体的方法，例如定点诱变，随机诱变，或酶裂解和/或核酸连接的方法，还有通过，例如杂交，确定如此改造过的核酸是否与主题序列有显著同源性的方法，这些方法都是本领域所熟知的。
换个角度来看，本发明提供了一种分离的编码了或互补于热敏感型碱性磷酸酶编码序列的核酸分子，其中所述碱性磷酸酶包含SEQ ID No.2的氨基酸序列或其变体，该变体的序列至少50％，优选至少60％，如至少70％或80％与SEQ ID No.2相同。
本发明还提供了一种cDNA，它编码包含图2中氨基酸序列(SEQ ID No.2)的热敏感型碱性磷酸酶，或拥有热敏感性和碱性磷酸酶活性的该酶的变体或片段，优选该cDNA衍生自北方长额虾。
本发明还提供了一种cDNA，它编码一种热敏感型碱性磷酸酶，该酶由在SEQ ID No.2序列上缺失，替换或插入一个或多个氨基酸残基的序列组成，优选该cDNA衍生自北方长额虾。
本发明更进一步提供了一种由本发明里定义过的核酸分子所编码的多肽。根据本发明定义的核酸分子，使得能够以从前所达不到的数量与纯度来获取重组碱性磷酸酶，特别是SAP和它的变体，从而能够持续供应这种酶，导致完全能在任何时间、于可控制的条件下或按指定标准的条件下进行大规模生产。
因此，本发明内容还扩展到重组多肽，它包括(或基本组成为)由
图1所示核酸序列(SEQ ID No.1)编码的构成热敏感型碱性磷酸酶的氨基酸序列，或其功能等价的变体。从另一角度看，本发明还提供了基本上不含北方长额虾其它成分的重组多肽，它包括由图1所示核苷酸序列(SEQ ID No.1)编码的构成热敏感型碱性磷酸酶的氨基酸序列，或其功能等价的变体。
这里所使用的术语“多肽”包括全长的蛋白质，和相对短的肽序列。
上面描述多肽氨基酸序列所用的“功能等价”限定了与上述多肽序列相关或来源于上述多肽序列、但其中的氨基酸序列已经被修饰的、仍保留催化活性的多肽，其中对多肽的修饰包括一个或多个氨基酸的取代，添加或缺失，或化学修饰如糖基化或去糖基化。这样的功能等价的变体可以由自然的生物变异所产生，也可以用已知的技术制备，例如功能等价的重组多肽可以用已知的定点诱变，随机诱变，或酶裂解和/或氨基酸连接技术制备。
本发明这一方面的合成多肽可以通过宿主细胞中的表达来制备，该宿主细胞包含重组DNA分子，该分子包括与表达调控序列可操纵连接的上文广泛讨论的核苷酸序列，或者宿主细胞包含带有上述重组DNA分子的重组DNA克隆载体，例如，质粒，粘粒，噬菌体分子或者酵母人工染色体。另外，还可以把本发明的裸DNA分子直接注射到宿主细胞中来表达多肽。
如上述方法表达出的合成多肽可以是融合多肽，该多肽包含碱性磷酸酶有催化功能的部分，以及由与之融合的重组分子的DNA所编码的另一种多肽。例如，可以按照期望产生一种融合蛋白，它包含合成型碱性磷酸酶或另一种本发明多肽，它与诸如β-半乳糖苷酶，磷酸酶，谷胱甘肽-S-转移酶，尿素酶等蛋白融合。绝大多数融合蛋白通过重组基因的表达来产生，在该重组基因中，两种编码序列连接在一起，它们的读码框是同时协调的。还可以按照期望，把本发明的合成肽与具有配体结合功能的蛋白或肽(如抗体)相融合，从而产生例如酶联报告抗体，这也是本技术领域所熟知的。这类编码碱性磷酸酶的核酸分子和它们各自的氨基酸序列的所有这类融合或杂合衍生物都包括在本发明中。这类适当的重组DNA和多肽表达的技术在，例如，Sambrook et al.，1989中描述。另外，本发明多肽还可以用化学方法，例如众所周知的Merrifield固相合成方法产生。
更具体地，在这一方面本发明提供了一种包含(或基本组成为)如下部分的重组多肽(a)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的全部或部分；或(b)与SEQ ID No.2的全部或部分有至少60％序列同一性的氨基酸序列的全部或部分。
术语‘重组的’把上述分子与天然多肽区分开，并且强调这样的分子是用‘重组DNA技术’(本领域所熟知的名词)产生的。具有SEQ ID No.2氨基酸序列的酶被认为是北方长额虾中天然酶的截短型，因此如果在重组生产中使用相应的核酸，那么生产出的重组酶无论如何都不会与自然产生的非重组分子相同。
具体地，上面提到的氨基酸序列可显示出与SEQ ID No.2多肽至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或98％的同一性。或者，上面提到的氨基酸序列可显示出与SEQ ID No.2多肽至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或98％的相似性。
具体地，上面提到的变异可能发生在N末端。本发明的多肽在N末端还可包括额外的4-20个氨基酸残基，例如5-10个。还应注意的是，SEQ IDNo.1的不完整cDNA序列对应于SEQ ID No.2的氨基酸序列，但仅始于第7个残基，天冬氨酸。在重组多肽中，氨基酸变异，特别是取代，可能会发生在这前6个氨基酸(见图2的序列)中。更进一步，图2的N末端赖氨酸可被精氨酸取代。
可产生对应于SEQ ID No.2氨基酸序列的cDNA序列，它由SEQ ID No.1和5’末端的衍生核苷酸序列共同组成。这一区域的大部分是由正向引物SEQ ID No.7提供的，该引物是源自天然虾碱性磷酸酶(SAP)的测序片段。由于遗传密码的简并性，不可能根据氨基酸KAYWNK确定出比AArGCnTAyTGGAAyAAr[SEQ ID No.19]更加准确的序列，其中r＝A或者G，n＝T，C，A或者G，y＝C或者T。对应SEQ ID No.2的cDNA全序列(包括SEQID No.19和SEQ ID No.1)在这里被归为SEQ ID No.20。
然而，如在实施例4所进行的测序工作已近确立了北方长额虾(Pandalus brealis)碱性磷酸酶的cDNA全序列。因此，上面讨论的关于SEQID No.19不确定性的问题就被解决了，编码KAYWNK的cDNA按如下所示AAAGCATATTGGAACAAA[SEQ ID No.21]。这个序列可以在SEQ IDNo.1 5中代替SEQ ID No.19，连同SEQ ID No.17中编码氨基酸序列NPITEED的部分一起产生准确的编码重组酶的cDNA序列。该全序列被归于SEQ ID No.22。
氨基酸序列的同一性或相似性可以用University of Wisconsin的Genetics Computer Group(GCG)Version 10软件包的Bestfit程序来确定。该程序使用Smith和Waterman的局部同一性运算法，其默认值为Gap生成罚分值＝8，Gap延伸罚分值＝2，平均匹配值＝2.912，平均错配值＝-2.003。
上述SEQ ID No.2氨基酸序列的“部分”或其变体包含至少20个连续的氨基酸，优选包含至少30，40，50，70，100，150，200，300，400或者450个连续的氨基酸。具有超过200个，特别是超过300个氨基酸的部分被认为是‘显著部分’，这些部分通常带有本发明鉴定出的酶活性位点，优选带有辅助因子的结合位点。
重组多肽优选具有上文定义的功能性活性，如，酶活性。或者它本身不具有功能性活性，但其为整体提供了具有功能性特点的区域，例如，代表酶活性所需要的活性位点或辅助因子结合位点。
正如上面讨论的，SEQ ID No.1和SEQ ID No.2不对应天然SAP的完整cDNA或者氨基酸序列。具有与天然SAP相同或基本相同的酶活性，并且保留此酶的热敏感性的截短型多肽构成了本发明的另一方面。插入本文所述截短序列中的完整cDNA分子或重组多肽，或者它们的功能等价变体，都是本发明进一步优选的方面。
本发明还有一方面提供了具有与SAP相同或基本相同的催化活性和热特性但缺少了它的N-末端区的多肽。优选这些多肽缺少N末端氨基酸以及在天然酶中和与它毗连的2-50个氨基酸，特别是5-30个，如5-10个。‘基本相同的催化活性’是指多肽拥有天然SAP的至少75％，优选至少85％，更优选至少90％的酶活性。除了这些缺失的N末端部分，所述多肽优选与SEQ ID No.2所示多肽有至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或98％的同一性。
根据本发明，当碱性磷酸酶经过65℃温育15分钟(优选10分钟)后，其催化活性检测不出时，可认为它是热敏感的。
测定本发明酶的催化活性所适用的方法按照Olsen et al.[R.L.Olsen，K. and B.Myrnes(1991)北方长额虾肝胰脏的碱性磷酸酶具有催化活性亚单位的二聚体酶(Alkaline phosphatase from the hepatopancreas of shrimp(Pandalus borealis)a dimeric enzyme with catalytically active subunits)，Comp.Biochem.Physiol.，998755-761]。碱性磷酸酶活性通过与6mM对硝基苯磷酸酯在37℃，pH 10.4的0.1M甘氨酸/NaOH缓冲液中温育而测定，缓冲液中还含有1mM MgCl2和1mM ZnCl2，总容积为0.5ml。15分钟后，用0.5ml的2M NaOH终止反应，所释放出的对硝基苯的量通过测量405nm(ε405＝18.5mM-1cm-1)处的吸光度来判定。一个单位的酶活性力每分钟能产生1μmol对硝基苯。SAP不受锌的不良影响，在最小浓度以上对镁也没有显著量的需求。
本发明的范围内还包括SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的变体，该变体编码或者包含保留并展示SAP的催化性质，但却是热稳定的蛋白，就是说这些蛋白在70℃加热15分钟后，不会完全丧失活性。
本发明还提供了制备本发明重组核酸分子的方法，包括把包含本发明核苷酸序列的核酸分子插入到另一核酸分子，例如，载体核酸，如载体DNA中。
所以本发明还提供了重组载体，该载体是携有DNA片段的载体DNA，所述DNA片段包含本发明任意cDNA。
在重组载体中，载体DNA优选是一种表达载体，并且能够在如大肠杆菌，酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母这样的宿主细胞中繁殖。
本发明的表达载体可包括合适的调控序列，例如翻译调控元件(例如起始密码子和终止密码子，核糖体结合位点)和转录调控元件(如启动子-操纵子区域，末端终止序列)，这些元件与本发明核酸分子在匹配的阅读框中相连接。
本发明载体可以包括本领域已知并在文献中记载的质粒和病毒(包括噬菌体和真核生物的病毒)，并且可以在不同的表达系统中表达，这也是本领域已知并有文献记载的。
现在已知许多技术可以用来把这类载体导入原核或真核细胞进行表达，或把这类载体导入生殖细胞系或体细胞中用于产生转基因动物。适用的转化或转染技术在文献中有很完善的描述。
包含本文所述本发明核酸分子并使其与启动子序列可操纵地连接的遗传构建体构成了本发明的另一方面。
本发明还包括了被转化或者被转染的原核或真核宿主细胞，或者包含了上面提到过的本发明核酸分子的转基因生物体。为了方便，这里不区分转化和转染。这样的宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌，链霉菌和其他细菌，或真核细胞例如酵母(例如巴斯德毕赤酵母)，或杆状病毒-昆虫细胞系统，被转化的哺乳类细胞和转基因动植物。这里优选原核宿主细胞。
所以本发明还提供了转化体，其是本发明重组体载体所转化的细胞。
另一方面，本发明提供了一种重组细胞或生物，它具有含SEQ ID No.1或20所示核苷酸序列的核酸分子，或该分子的如本文定义的功能等价变体，并且表达或能够表达热敏感碱性磷酸酶。‘重组的’细胞或生物是说细胞或生物含有并非该生物自然产生的遗传物质(在本例中编码热敏感碱性磷酸酶)，所以北方长额虾被排除在外，因为它虽然表达热敏感碱性磷酸酶，但其基因是自然存在于该物种的。
从另一角度看，那些表达热敏感碱性磷酸酶的细胞或生物可被视为“修饰过的”，即具有自然界中并不存在的基因型和表型的细胞或生物。因此，所述细胞或生物也可被称为“非天然”细胞或生物， 因为它包含非天然遗传物质，并且能够产生该物种或细胞类型的天然成员不产生的蛋白(热敏感碱性磷酸酶)。
上述细胞和生物可以被称为转化体，它们或它们的祖先通过导入本文描述的编码热敏感碱性磷酸酶的遗传物质而被转化。
本发明还提供了另一种转化体，该转化体是被重组载体转化的大肠杆菌或酿酒酵母。细菌，真菌和其它培养细胞的适宜表达品系是本领域所熟知的。
本发明还提供了产生热敏感型碱性磷酸酶的方法，包括在培养基中培养本发明转化体，从培养的转化体中分离热敏感型碱性磷酸酶。更具体地，本发明还提供了生产热敏感型碱性磷酸酶的方法，包括用含有如下序列的表达载体转化宿主细胞SEQ ID No.1或20所示的核苷酸序列，或与其至少有55％同一性的序列，和/或能够在中等严紧度条件下与SEQ ID No.1或20的互补序列杂交的序列，或上述序列的互补序列；在培养基中维持宿主细胞，和从所述细胞分离所表达出的热敏感型碱性磷酸酶。培养细胞的方法为本领域所熟知并通常允许细胞繁殖并且同时或随后表达ALP基因。基因产物可在细胞内或细胞外积累。回收和提纯由这条途径产生的蛋白的方法是本领域所熟知的。
我们进行了进一步的工作并得到了更加准确的序列信息。修正过的cDNA和蛋白质序列相比原来变化很小。修正过的cDNA序列如图4所示，被命名为SEQ ID No.15。除了加入额外的5’序列(其等价的氨基酸序列出现在SEQ ID No.2中)，新的序列还缺少了9个核苷酸，如图7的序列对比所示。比较显示序列有99.4％相同。
在蛋白质水平上有稍大的改变，因为修正使得蛋白质的一小部分中的阅读框中发生了改变。修正过的氨基酸序列如图5所示，并被命名为SEQ IDNo.16。图8中给出了与起始氨基酸序列的对比。该对比显示序列有96％相同。
所以，所有以前引用SEQ ID No.1和2的地方分别可以用SEQ ID No.15和16替代。这些序列包括了那些本发明已经描述过的较佳实施方案。
除此之外，SAP全长cDNA序列已于近期被阐明，所以其整个分子对应于SEQ ID No.17然后接SEQ ID No.15，SAP全长氨基酸序列(加上信号序列)对应SEQ ID No.18然后接SEQ ID No.2或16。据信，在SEQ ID No.18的47个氨基酸中，最后7个氨基酸(NPITEED)或者其中的几个，举例来说，PITEED或者TEED可见于成熟SAP蛋白的N末端。剩下的氨基酸被认为是信号肽。具有这些序列的分子组成了本发明的另一方面。在本发明的一个较佳实施方案中，重组的碱性磷酸酶在其N末端具有氨基酸序列NPITEED。
下面将要用一些非限制性实施例来进一步描述本发明，其中图1显示了编码来自北方长额虾(Pandalus borealis)的SAP的cDNA(去掉了5’末端的一小部分)。终止密码子和包括多腺苷酸尾部的cDNA下游序列标有下划线。
图2显示了图1所示的SAP cDNA编码的氨基酸序列(加入了一个额外的N末端区域)。与已测序的蛋白片段同源的部分用下划线标出并注明。酶的活性位点序列(根据已知的碱性磷酸酶)用粗体显示；并且图3显示了SAP序列与一些从Swiss-Port数据库找到的与其高度同源的组织非特异性ALP的序列比对，其中有鼠(登录号A.n.P09242)，人(A.n.P05186)，小鸡(A.n.Q92058)，和家蚕蛾(Bombyx mori)的ALP(A.n.P29523)。
图4显示了修正了的编码北方长额SAP的cDNA。多腺苷酸尾部表示为(A)23。由于扩增和测序使用了简并PCR引物，5’序列的5个核苷酸位置产生了误差，所以这几个位置没有特别说明。
图5显示了图4所示的SAP cDNA编码的氨基酸序列。与已测序蛋白片段同源的序列用下划线标出并说明。建议的酶活性位点序列用粗体显示。由于如图4讨论的简并PCR引物所产生的误差，N末端的赖氨酸残基(小写字母)可以用精氨酸替换。
图6对应上面的图3，但是加入了图5中的修正的氨基酸序列。
图7显示图4中修正的cDNA序列(上列)与图1中的起始序列(加入了最初仅在图2的等价氨基酸序列中出现的5’端)的序列比对。比对是使用Needle程序进行的，应用Needle-Wunsch global alignment算法来寻找两序列(包括空隙)的最佳列比[Needle et al.J.Mol.Biol.(1983)48，pp443-453]。矩阵Blosum为62，开放式空隙的罚分为10.0，空隙延伸值罚分为0.5。总体同一性百分比99.4％。
图8显示图5中修正的氨基酸序列(上列)与图2中的起始氨基酸序列的比对。比对是使用上述Needle程序进行的，矩阵Blosum为62，开放式空隙的罚分为10.0，空隙延伸值罚分为0.5。总体同一性百分比96.3％。
图9给出了北方长额虾碱性磷酸酶的推定的信号序列和N末端区域的cDNA[SEQ ID No.17]和氨基酸[SEQ ID No.18]序列。SAP氨基酸序列后接KAYWNK...，如图2和4所描述。
图10是一张照片，显示实施例4中表达培养物的总细胞蛋白提取物的SDS-PAGE，其中泳道1和10广域标准蛋白，泳道2和9SAP 1.5μg，泳道3阴性对照培养物，未进行诱导，泳道4阴性对照培养物，进行了诱导，泳道5SAP-培养物1，未进行诱导，泳道6SAP-培养物1，进行了诱导，泳道7SAP-培养物2，未进行诱导，泳道8SAP-培养物2，进行了诱导。广域标准蛋白中的蛋白质是肌球蛋白(200kD)，β-半乳糖苷酶(116kD)，磷酸化酶b(97.4kD)，血清白蛋白(66kD)，卵清蛋白(45kD)，碳酸酐酶(31kD)，胰蛋白酶抑制物(21.5kD)，溶菌酶(14.4kD)，抑酶肽(6.5kD)。
图11是一张照片，显示实施例4中表达培养的总细胞蛋白提取物的免疫印记，其中1道和8道SAP 50ng，2道阴性对照培养物，未进行诱导，3道阴性对照培养物，进行了诱导，4道SAP-培养物1，未进行诱导，5道SAP-培养物1，进行了诱导，6道SAP-培养物2，未进行诱导，7道SAP-培养物2，进行了诱导。
实施例实施例1-SAP蛋白的测序和SAP基因的分离蛋白分离，片段化和序列分析如[R.Olsen et al.，]所描述，把虾碱性磷酸酶(SAP)纯化至表现均一的程度。在10％NuPAGE Bis-Tris凝胶系统(Novex)中加入含0.1％SDS的50mM2-(N-吗啉)乙磺酸电泳缓冲液进行电泳后，用考马斯染色和银染都探测到单个的约55kD的蛋白质条带。
冻干1mg蛋白质，把其递交商业序列分析服务公司(Innovagen，Sweden)。在那里，蛋白质经胰蛋白酶处理成片段，这些片段用反相HPLC分离。产生了超过30个片段，选择其中4个作进一步分析。利用质谱分析来分析选定的片段的序列(H2318，H2330，5ReRP626，5ReRP617)，分别产生了12，10，8和5个氨基酸的序列。
合成来自蛋白质片段序列的寡核苷酸根据得到的氨基酸序列预测标准密码子，然后按惯例制成正向的简并寡脱氧核糖核苷酸引物和其反向互补序列(Eugogentec，Belgium)。
虾cDNA的合成解剖新鲜收获的北方长额虾，将单个的肝胰脏在液氮中储存备用。用PolyATract System 1000(Promega)从单个肝胰脏中分离出mRNA。分离的mRNA被用于在第二条链合成之前的第一条链cDNA的合成，cDNA的扩增按照SmartTMPCR cDNA合成试剂盒(Clontech)与Advantage cDNA合成试剂盒(Clontech)所给出的说明执行。
SAP-基因内部片段的PCR扩增和序列分析使用小量等份试样的合成cDNA为模版，用上述成对的蛋白衍生型寡核苷酸(正向与反向)为引物，进行PCR。具有标准混合物组成的扩增反应在Eppendorf梯度热循环仪中进行。PCR的产物用琼脂糖凝胶电泳方法检测。寡核苷酸17F和26R的引物组合得到了一种600bp的扩增产物，用ThermoSequenase radiolabelled terminator cycle Squencing Kit(Amersham)并且用同样的PCR引物测序。
cDNA末端快速扩增(RACE)根据PCR产物中发现的DNA序列，合成出新的特异性正向和反向引物用于5’和3’RACE反应，方法与用MarathonTMcDNA amplification kit(Clontech)从cDNA模版进行扩增的描述一样。
用SAP基因特异性正向引物MalpF以及试剂盒所含的AP1引物，产生出1.4kb的3’-RACE片段，其中所述AP1引物与所连的衔接子具有序列同一性。类似地，用反向基因特异性引物MalpR得到了0.5kb的5’RACE产物。对3’RACE产物的DNA序列分析证实，它与600bp PCR产物重叠。把3’RACE产物亚克隆到pCR-Script载体(Stratagene)中，用来制备pMalpF质粒，以便对包含在600bp PCR产物中序列区下游的cDNA基因进一步测序。
用新的基因特异性引物对600bpPCR产物和pMalpF插入序列从两个方向进行多次测序。
完整cDNA基因的高保真PCR扩增用引物SapF和SapR，Pfu聚合酶(Stratagene)，以cDNA为模版进行最终的PCR反应，产生1.5kb的SAP cDNA基因扩增产物。对1.5kb PCR产物进行分析，以确认所得到的序列。结果发现，该cDNA基因包含一开放阅读框和一个3’序列，该开放阅读框编码了一个478个氨基酸的多肽-见图1和2，该3’序列包括公认的转录聚腺苷化信号。
PCR所使用的热循环特性下面的循环特性被用于扩增反应-总cDNA扩增 1x95℃，2分16x95℃，5秒65℃，5秒68℃，6分-内部600bp片段PCR 1x94℃，2分36x94℃，10秒51℃，10秒72℃，1分1x72℃，5分-5’RACE 1x94℃，30秒5x94℃，5秒72℃，4分1x94℃，30秒5x94℃，5秒70℃，4分1x94℃，30秒23x94℃，5秒68℃，4分-3’RACE 1x94℃，30秒36x94℃，5秒68℃，4分-高保真PCR 1x94℃，3分40x94℃，10秒
55℃，15秒72℃，3分1x72℃，5分结果SAP蛋白亚单位最初经估计分子量为65kDa。在USB的产品表中描述了一种59kDa的SAP蛋白，在发明人的SDS-PAGE体系中，SAP蛋白与分子量为55kDa的标准蛋白有相似的迁移模式。这些分歧可以用不同缓冲体系和所用凝胶的质量的多样性来解释。
分离的cDNA编码与所分析的SAP蛋白片段具有序列同一性的多肽见图2。
用SAP蛋白序列作为公共数据库中进行同源性搜索的查询序列。分别用BLAST和ClustalW程序来进行同源性搜索和多序列对比排列。将SAP序列与它的最高分值同系物进行对比排列，这些同系物是鼠(登录号P09242)，人(A.n.P05186)，鸡(A.n.Q92058)中找到的组织非特异性ALP和家蚕蛾的ALP(A.n.P29523)。对比排列见图3。通过公共数据库中的同源性搜索没有找到所得cDNA的等价序列。然而，衍生出的蛋白序列与一些已知的ALP有相对较高的同源性得分，在氨基酸序列上有44％同一性和60％的相似性。蛋白同源性在European Bioinforrnatics Institute的互联网服务器上的SWALL数据库(非重复蛋白质序列数据库；Swissport+Trembl+TremblNew)中通过运行FastA3程序来进行搜索，其使用默认参数(blosun50矩阵，gap开放罚分值＝-12，gap延伸罚分值＝-2，KTUP＝2)。[W.R.Pearson and D.J.Lipman(1988)，生物序列分析中的改进工具(“Improved tools for biological sequence analysis”)，PANS 852444-2448；W.R.Pearson，(1990)，应用FASTP和FASTA进行的快速灵敏序列比较(“Rapidand sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA”)，Methods inEnzymology 18363-98.]还有，cDNA编码的蛋白包含基序VTDSAASAT，它对应于该序列中由Prosite PSOO 123限定的ALP的活性位点模式。所以，来自虾肝胰脏的mRNA-转录物的分离cDNA代表了北方长额虾(P.borealis)的SAP基因。
经测序的蛋白质片段5ReRP626与cDNA衍生的序列之间有一个氨基酸不符。它可以解释为SAP基因的等位变异或者蛋白质序列分析中的一个错误。
实施例1中使用的序列蛋白质片段H2318 DINFRYASAAP(V)K[SEQ ID NO.3]H2330 HLITDWLDDK[SEQ ID NO.4]5ReRP626 VIMGGERR[SEQ ID NO.5]5ReRP617 AYWNK[SEQ ID NO.6]寡核苷酸17FGCIIAYTGGAAYAAR[SEQ ID NO.7]26RCKYTCICCICCCATDATIAC[SEQ ID NO.8]其中 D＝A+G+TI＝次黄嘌呤核苷K＝G+TR＝A+GY＝C+TMalpFATTTCGTGGGAAGAATTCGACTTTGC[SEQ ID NO.9]MalpRGATCTGCCAGCCTCCTGGAACCA[SEQ ID NO.10]SapFAARGCNTAYTGGAAYAARGAT[SEQ ID NO.11]SapRGAAGGTAATCATCTACATCTCA[SEQ ID NO.12]重复实施例1，使序列信息更精确。如图4和图5所示，所述cDNA基因含有编码475个氨基酸的蛋白质的开放阅读框。图4的cDNA理论上的分子量是53kDa，结果是与纯化型天然SAP在SDS-PAGE上的分子量估计值54-55kDa相比得到的。根据多序列对比排列结果认为，SAP在其N末端包含5-10个额外的氨基酸，使其分子量接近54kDa。正如早先讨论的，这个N末端区域被认为包含七肽NPITEED的部分或全部，见实施例4。
实施例2-cDNA衍生的蛋白质序列与天然SAP相比的氨基酸组成将冻干的SAP蛋白质溶解在6M盐酸中，110℃水解24小时。将盐酸蒸发之后，使重新样品悬浮于0.2M柠檬酸钠缓冲液，pH 2.2，然后进行HPLC分析，以鉴定水解产物中的氨基酸并测出其摩尔百分比。
注此系统不能区分天冬氨酸和天冬酰胺或者谷氨酸和谷氨酰胺。所以，天然SAP蛋白中这些氨基酸的数据是混合的。此外，也可能会低估半胱氨酸残基的数量，因为蛋白质没有被氧化。
％cDNA衍生的蛋白中 天然SAP中丙氨酸8.3 9.6天冬氨酸+天冬酰胺 (13.7)13.6天冬氨酸 10.0 -天冬酰胺 3.7 -谷氨酸+谷氨酰胺 (9.0) 11.7谷氨酸6.7 -谷氨酰胺 2.3 -半胱氨酸 1.0 0.2苯丙氨酸 4.1 4.1甘氨酸8.4 8.4组氨酸3.7 2.8异亮氨酸 5.2 5.4赖氨酸4.6 4.2亮氨酸7.3 8.0甲硫氨酸 1.6 1.9脯氨酸2.7 3.1精氨酸5.2 5.2丝氨酸4.6 4.6苏氨酸8.7 8.5缬氨酸5.4 4.9色氨酸1.6 -酪氨酸4.1 3.6
结论对于大多数氨基酸而言，每种氨基酸在cDNA衍生的蛋白质序列中的摩尔比与在纯化的天然蛋白质中的比例几乎相同。明显较小的差异如上讨论。
所以，分离的cDNA编码的蛋白质与SAP蛋白相比，氨基酸组成非常近似或完全一致。
对经修正的cDNA序列重复了本实施例和分析，其结果如下cDNA衍生的蛋白质序列与天然SAP相比的氨基酸组成。
％cDNA衍生的蛋白中 天然SAP中丙氨酸8.8 9.6天冬氨酸+天冬酰胺 - 13.6天冬氨酸 10.1 -天冬酰胺 3.4 -谷氨酸+谷氨酰胺 - 11.7谷氨酸7.1 -谷氨酰胺 2.3 -半胱氨酸 0.8 0.2苯丙氨酸 4.0 4.1甘氨酸8.0 8.4组氨酸3.3 2.8异亮氨酸 5.4 5.4赖氨酸4.6 4.2亮氨酸7.6 8.0甲硫氨酸 2.1 1.9脯氨酸2.7 3.1精氨酸4.8 5.2丝氨酸4.6 4.6苏氨酸9.0 8.5缬氨酸5.4 4.9
色氨酸 1.5-酪氨酸 4.03.6实施例3-SAP在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的重组表达编码SAP的cDNA被用于在适当的微生物中异源表达所述酶，以便通过发酵产生重组酶。有几种表达体系可供选择，其中优选真核表达体系，因为它可表达出相当水平的天然状态的酶。
一例这样的表达体系是甲基营养型巴斯德毕赤酵母(Invitrogen)，据报道，其在细胞内表达重组蛋白的水平最高达12 g/L[Clare，J.J.Raiyment，F.B.，Ballantine，S.P.，Sreekrishna，K.and Romans，M.A.(1991)High-levelexpression of tetanus toxin fragment c in Pichia pastoris strains containingmultiple tandem integrations of the gene.Blo/Technology 9，455-460]，分泌到培养基中的蛋白水平最高达2.6g/L[Paifer，E.，Margolles，B.，Cremata，J.，Montesino.R.，Herrera，L.and Delgado，JM.(1994)Efficient expression andsecretion of recombinant alpha amylase in Pichia pastoris using two differentsignal sequences.Yeast 10.1416-1419]。
插入的基因受AOX1(醇氧化酶)启动子的调节，所以表达可被甲醇诱导。
把SAP cDNA插入商品载体pPIC9K中。重组SAP因在载体中与酿酒酵母α因子的信号肽序列融合而被表达为分泌产物。当整合到his-菌株(KM71或者GS115)中以后，通过在不含组氨酸的培养基中挑选出his+克隆，可选出重组菌株，因为his基因型由载体插入子予以弥补。另外，还可以根据对增高浓度的遗传霉素(G418，Invitrogen)的抗性来筛选重组体中的多基因插入子，其中的抗性源自质粒携带的卡那霉素抗性基因。
具体地，PCR产生的SAP cDNA被当作新一轮PCR反应的模板，用来产生含有合适的限制性位点的PCR产物，所述位点能使所述产物整合到载体pPIC9K中，与α因子信号序列位于相同阅读框内。作为PCR反应的正向引物，使用改进的“17F”引物[SEQ ID No.13]，其中以赖氨酸密码子(AAG)代替ATG密码子(Met)，以便重建可被胰蛋白酶酶切的公认的赖氨酸残基。反向引物[SEQ.ID.No.14]经构建可以在SAP cDNA序列的终止密码子的3’端加入一个NotI限制性位点。
产生的PCR产物被NotI酶切，然后连接到已被SnaBI和NotI酶切的pPIC9K载体中(从而产生质粒pPIC9K-SAP)。因为该载体经SnaBI酶切后5’端的连接位点是平末端，而且两末端都在阅读框中，所以不必对已修饰过的cDNA的5’末端再进行修饰。
然后用载体转化感受态大肠杆菌菌株如TOP10F’(Invitrogen)或等价菌株，使其繁殖，用对抗氨苄青霉素的抗性筛选重组体。分离的pP109K-SAP质粒然后可以用ScoI进行限制性酶切，使其线性化，以便产生一种可插入巴斯德毕赤酵母AOXI基因中的载体盒。将线性化的pPIC9K-SAP构建体转化入巴斯德毕赤酵母细胞(菌株GS115或KM71)之后，根据制造商方案从His+突变体中筛选出重组体。
然后再用制造商推荐的方法在甲醇存在条件下培养细胞，用来检测分离的菌落在培养基中的重组SAP的表达。如果需要，还可以从重组菌株中筛选含有多拷贝的所述重组基因的克隆，以获得进一步增加的酶的表达水平。这是通过在不断增加抗生素G418(Invitrogen)水平的环境中培养His+突变体来达到的。生长在高G418水平中的克隆很可能含有多拷贝的所述基因。
所有培养，转化，筛选的方法都在巴斯德毕赤酵母体系(Invitrogen，TheNetherlands)供应商提供的方案中有详细描述。
经修饰的SAP构建体产生了重组产物，其中添加了来自巴斯德毕赤酵母信号肽酶KEX2的剩余信号识别序列的5个氨基酸(EAEAY)。该N末端序列导致了最终产物被稍微截短，但与其他的碱性磷酸酶有相当的共性，仍然拥有巴斯德毕赤酵母信号肽酶的识别序列。
实施例3中使用的引物正向AAGGCITAYTGGAAYAAR[SEQ.ID No.13]其中I＝次黄嘌呤核苷R＝A+GY＝C+T反向TACAGCGGCCGCCATCTCATTTTTCG[SEQ.ID No.14]
实施例4-大肠杆菌TOP10中SAP的表达SAP信号序列的测定SAP的N末端信号序列是以cDNA为模板用5’-RACE来测定的。使用Oligotex Direct mRNA小量试剂盒(Qiogen)，按照制造商的方案，从100毫克虾肝胰脏中分离mRNA。虾肝胰脏cDNA是用SMART PCR cDNA合成试剂盒(Clontech)按照制造商的方案制备的。该cDNA是平端结尾，通过在50μl cDNA中加入40μg蛋白酶K，45℃保温45分钟和90℃保温8分钟，然后加入15U T4-DNA聚合酶(Promega)，16℃保温30分钟并于72℃保温10分钟而纯化。最后，cDNA在酚/氯仿中提取两次，再在乙醇中沉淀。再按照如Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech)所述方法，使该cDNA与RACE-衔接子连接。5’-RACE反应如下进行在终体积50μl中，用Advantage cDNA聚合酶混合物(Clontech)，AP1-引物(提供自Marathon cDNA扩增试剂盒)，SAP-特异性引物(5’-GCG TGG TGC ATA TGG TCA ATC CGTCC-3’)和5μl稀释50倍的连接了衔接子的cDNA模板进行反应。RACEPCR-反应在Biometra TGradient热循环仪中进行，初始变性步骤为94℃30秒，接着以94℃5秒和72℃3分钟循环5次，以94℃5秒和72℃3分钟循环5次，以94℃5秒和68℃3分钟循环30次。产生的1,200bp的SAP片段用琼脂糖凝胶纯化，用PCR再扩增并测序。
将SAP克隆入pBAD/gIII A表达载体为了将SAP基因克隆入pBAD/gIII A载体，用分别含有SacI和HindIII位点(下划线标明)的两种引物对SAP基因进行PCR扩增。根据得到的全长SAP序列(包括主序列和信号序列)设计引物，用来扩增以NPITEEDKAYWNK...氨基酸序列为N末端的SAP基因。另外，改变了引物1中的三个碱基(C变为A，A变为C，以及A变为C)，使得三个N末端密码子得到密码优化(在引物序列中用小写字母表示)(引物15’-ATG GAGCTC AAC CCa ATc ACc GAA GAA GAC AA-3’引物25’-ATG AAG CTTTCATTT TTC GTC ACA GAAAGT G-3’)。PCR反应如下进行在终体积为50μl中，含有分别为10μM的两种引物，1.5U Pfu聚合酶(Promega)和提供的缓冲液，0.2mM dNTP，并以10ng虾肝胰脏cDNA作为模板。PCR-的初始变性步骤为94℃30秒，接着以94℃15秒，55℃ 1分钟，72℃ 3分钟循环30次。PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。
PBAD/gIII A载体和SAP PCR产物都分别用5U的SacI和HindIII限制性内切酶处理。在10μl的反应体系中，加入1U T4-DNA连接酶(USB)和分别约1mg的质粒和SAP PCR产物，用来把PCR产物连接到载体中。反应混合物在16℃温育16小时。然后向40μl电感受态大肠杆菌TOP10细胞加入连接混合物，1,800V条件下电穿孔，以便用连接混合物转化大肠杆菌TOP10细胞。电穿孔之后，马上加入1毫升SOC-培养基，在37℃温育1小时。然后把细胞涂到含有100mg/ml氨苄青霉素的LB平板上，以筛选转化的细胞。
SAP在大肠杆菌TOP10中的表达选择了两个含有重组pBAD/gIII A载体(含SAP基因)的大肠杆菌TOP10菌落进行表达。用含有pBAD/gIII A空载体的大肠杆菌TOP10作为阴性对照。
在三个含有50ml LB培养基的Erlenmeyer烧瓶中接种2.5毫升在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中过夜的培养物。细胞在30℃振荡培养，直至细胞浓度达到OD600≈0.5。然后把每份培养物分成两份(2×25毫升)，其中之一加入L-阿拉伯糖至终浓度0.05％(w/v)，以便进行诱导。其后所有的细胞培养物均在30℃振荡培养3小时，直至回收细胞。
表达培养物的分析每份表达培养物取200μl离心，弃去上清。向细胞沉淀物中加入100μl的1X SDS-PAGE样品缓冲液，100℃温育3分钟，然后18,000g离心3分钟。然后对细胞裂解产物直接进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。一份额外的SDS-PAGE凝胶进行电转印，使蛋白转移到硝酸纤维素印迹膜(0.45um，Bio-Rad)上，然后再用对抗从虾加工废水中纯化的SAP的抗体和山羊抗兔IgG(H+L)(吸收了人类IgG)辣根过氧化物酶偶联物(Bio-Rad)进行免疫染色。SDS-PAGE，电转印和免疫染色都按照标准方案进行。
如图10和11所示，以大肠杆菌TOP10细胞作为宿主用pBAD/gIII A载体表达了重组SAP。包含重组pBAD/gIII A-SAP载体的两种重组大肠杆菌菌株都产生重组SAP，而阴性对照在western印迹中没有给出任何信号(图11)。
权利要求
1.一种核酸分子，其包含SEQ ID No 1或20所示核苷酸序列，或与SEQ ID No 1或20有至少55％的序列同一性的核苷酸序列，和/或者能与SEQ ID No 1或2的互补序列在中等严紧度的条件下杂交的核苷酸序列，或所述序列的互补序列，其中所述核苷酸序列编码了或互补于编码一种不耐热碱性磷酸酶的序列。
2.权利要求1的核酸分子，其包含与SEQ ID No 1或20的核苷酸序列有至少75％的序列同一性的核苷酸序列。
3.权利要求1或2的核酸分子，其包含与SEQ ID No 1或20的核苷酸序列有至少85％的序列同一性的核苷酸序列。
4.一种分离的的核酸分子，其编码或互补于编码不耐热碱性磷酸酶的序列，所述碱性磷酸酶包含SEQ ID No.2的氨基酸序列或与该氨基酸序列至少50％同源的氨基酸序列变体。
5.权利要求3的核酸分子，其中所述碱性磷酸酶具有与SEQ ID No.2至少70％相同的氨基酸序列。
6.权利要求3的核酸分子，其中所述碱性磷酸酶具有与SEQ ID No.2至少80％相同的氨基酸序列。
7.前述任一项权利要求的核酸分子，其中所述碱性磷酸酶是北方长额虾碱性磷酸酶。
8.一种遗传构建体，其包含与启动子序列可操作连接的权利要求1-7任一项所述核酸分子。
9.一种重组表达载体，其包含权利要求1-7任一项的核酸分子，并且能在宿主细胞中繁殖。
10.权利要求9的载体，是质粒或病毒载体。
11.一种细胞，其被权利要求9-11任一项所述构建体或载体转化。
12.权利要求11的细胞，是原核细胞。
13.权利要求11的细胞，是真核细胞培养物的一部分。
14.一种重组细胞或生物，具有含权利要求1-3任一项定义的核苷酸序列的核酸分子。
15.一种重组不耐热碱性磷酸酶，包含a)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的全部或主要部分；或b)与SEQ ID No.2有至少60％同一性的氨基酸序列的全部或主要部分。
16.权利要求15的重组碱性磷酸酶，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或与SEQ ID No.2的序列有至少75％的序列同一性的氨基酸序列。
17.权利要求15或16的重组碱性磷酸酶，是北方长额虾碱性磷酸酶。
18.一种能表达不耐热碱性磷酸酶的重组细胞或生物，所述酶包含SEQID No.2的氨基酸序列或与SEQ ID No.2有至少60％序列同一性的氨基酸序列。
19.一种能表达不耐热碱性磷酸酶的重组细胞或生物，所述酶包含SEQID No.2的氨基酸序列或与SEQ ID No.2有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
20.一种制备不耐热碱性磷酸酶的方法，包括用权利要求9的表达载体转化宿主细胞，在培养基中培养该细胞，分离该细胞所表达的不耐热碱性磷酸酶。
21.一种核酸分子，其包含SEQ ID No.15所示核苷酸序列，或与SEQID No.15有至少55％的序列同一性的核苷酸序列，和/或能与SEQ ID No.15的互补序列在中等严紧度的条件下杂交的核苷酸序列，或所述序列的互补序列，其中所述核苷酸序列编码了或互补于编码不耐热碱性磷酸酶的序列。
22.一种重组不耐热碱性磷酸酶，其包含a)SEQ ID No.16所示氨基酸序列的全部或主要部分；或b)与SEQ ID No.16所示氨基酸序列有至少60％同一性的氨基酸序列的全部或主要部分。
23.权利要求22的重组碱性磷酸酶，具有SEQ ID No.16所示的氨基酸序列或与SEQ ID No.16有至少75％的序列同一性的氨基酸序列。
24.一种制备权利要求的表达载体的方法。
全文摘要
本发明涉及一种核酸分子，该分子包含SEQ ID Nos.1或20中所示的核苷酸序列，或与其有至少55％的同一性的序列，和/或者能与SEQ ID Nos.1或20的互补序列在中等严紧度的条件下杂交的序列，或所述序列的互补序列，其中所述核苷酸序列编码或互补于编码不耐热碱性磷酸酶的序列。本发明还涉及一种重组不耐热碱，其包含(a)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的全部或主要部分；或(b)与SEQ ID No.2所示氨基酸序列有至少60％的序列同一性的氨基酸序列的全部或主要部分，及其制造方法。
文档编号C07K14/435GK1553919SQ01820348
公开日2004年12月8日 申请日期2001年10月10日 优先权日2000年10月10日
发明者英奇·尼尔森, 克斯蒂·奥弗博, 奥拉夫·莱恩斯, 奥弗博, 莱恩斯, 英奇 尼尔森 申请人:生物科技医药公司