专利名称：一种依诺肝素钠酶解方法
技术领域：
本发明属于肝素钠生产领域，具体涉及一种依诺肝素钠的酶解方法。
背景技术：
肝素钠是粘多糖硫酸酯类抗凝血药，是由猪或牛的肠粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属粘多糖类物质。近年来研究证明肝素钠还具有降血脂作用。低分子肝素钠是指利用各种方法，由肝素钠为原料裂解制得的分子量较低的肝素钠，依诺肝素钠就是其中的一种低分子肝素钠。肝素钠通过与ATIII结合并抑制IIa因子和fe因子活性而发挥抗栓、抗凝作用， 而与ATIII的结合事是通过随机分布于肝素钠分子中特定的五糖分子调控的。肝素钠与 ATIII、Xa结合，使fe失活而发挥抗栓作用，这一过程需5个糖基单位即可；同样肝素钠与 ATIII、IIa结合，使IIa失活而发生抗凝作用，但这一过程需要18个糖基单位为条件。而肝素钠总量中大于18个糖基单位的量约占90%，而低分子肝素钠总量中大于18个糖基单位的量不超过50%，这就决定了低分子肝素钠具有较高的抗因子活性及较低的抗IIa因子活性。低分子肝素由于制备方法的不同，其生化与药理性质有显著的区别，体内抗栓活性及出血副作用也不同。低分子肝素是由普通肝素经裂解而得的片段，NMR研究证明，不同低分子肝素在分子量、分子量分布、末端结构、硫酯化的类型等方面存在差异，而这些差异可导致相应的生物活性的不同，包括与ATIII结合的能力、抗IIa因子活性和fe因子活性。由于低分子肝素钠的结构比较多样性，故低分子肝素钠的结构确定非常重要。依诺肝素钠作为一种低分子肝素钠，其中一项检测项目为结构检测，由于依诺肝素钠的分子量较大，利用高效液相色谱检测时样品紫外吸收峰重叠严重，计算得出的峰面积数据不准确，故需要将其结构利用肝素酶裂解为小片段后再进行检测。这一步骤中涉及到肝素酶 I、II和III，USP中三种酶用量为h印arinase I (肝素酶I) heparinase II (肝素酶 II) heparinaseIII (III) = 1 1 1，肝素酶 I、II 和 III 的市场价格大约为 6000 元 /单位，由于这三种酶的市场价格相当高，酶解成本也据高不下。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上提供一种成本更低且效果更佳的依诺肝素钠酶解方法。本发明的目的可以通过以下措施达到一种依诺肝素钠酶解方法，其具体为向依诺肝素钠溶液中加入乙酸钠/钙溶液和混合酶溶液，在温度为四 31°C下酶解66 72小时；其中所述乙酸钠/钙溶液的pH 值为7，所述混合酶中各酶的酶活比例为肝素酶I 肝素酶II 肝素酶III =0.95 1. 05 1 0. 45 0. 55。混合酶中各酶优选的酶活比例为肝素酶I 肝素酶II 肝素酶III =1 1 0· 5。所述依诺肝素钠溶液(即水溶液)的浓度为15 25mg/ml，优选20mg/ml。乙酸钠/钙溶液的体积是依诺肝素钠溶液体积的3 4倍，优选3. 5倍。本发明所指的混合酶溶液由肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III溶解于磷酸缓冲溶液中制成，或者肝素酶I溶液、肝素酶II溶液和肝素酶III先分别溶解于磷酸缓冲溶液中， 再混合后制成，所述混合酶溶液中各酶的浓度为0. 09 0. 4IU/mL，优选0. 1 0. 2IU/mL。本法中混合酶溶液的体积是依诺肝素钠溶液体积的4. 5 5. 5倍，优选5倍。本发明中磷酸缓冲溶液的配制方法为将磷酸二氢钾和牛血清白蛋白一同溶解于水中后，调节PH值至7. 0，加水稀释后用滤膜过滤；所述磷酸二氢钾和牛血清白蛋白的质量比为6. 7 7 1，优选6.8 1，磷酸缓冲溶液中磷酸二氢钾的浓度为1.3mg/ml Ijmg/ ml，优选为1. 36mg/ml ；滤膜孔径在0. 45 μ m以下。本发明中乙酸钠/钙溶液的配制方法为将牛血清白蛋白和乙酸钙溶解于水中， 加入冰醋酸后用氢氧化钠调节PH值为7.0，加水稀释后用滤膜过滤；牛血清白蛋白与乙酸钙的质量比为1 3.0 3.4，优选1 3.2，牛血清白蛋白与冰醋酸的质量体积比为 1 55 60mg/yL，优选1 58mg/μ L，乙酸钠/钙溶液中乙酸钙的浓度为0. 30 0. 3%ig/ ml，优选0. 32mg/ml ；滤膜孔径在0. 45 μ m以下。本发明的有益效果本方法得到的酶解产物通过HPLC检测，测得共有17组峰的峰面积面积大于总面积的0. 3%，明显优于其他条件测得的结果。本发明提供的优化的酶解依诺肝素钠工艺，肝素酶III的用量明显减少，节约成本并且工艺简单、提高检测速度。
具体实施例方式仪器高效液相色谱仪(Agilent 1200,紫外检测器)，XS-205电子天平(梅特勒)， PURELAB Classic超纯水机，超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，玻璃砂芯抽滤漏斗 (天津津腾玻璃仪器有限公司)，PHS-3C型pH计。试剂依诺肝素钠标准品(USP)，肝素酶I，肝素酶II，肝素酶III，超纯水，磷酸二氢钠 (分析纯)，高氯酸钠(分析纯)，磷酸(分析纯)，乙酸钙(分析纯)，牛血清白蛋白(生化试剂)，冰醋酸(分析纯)，氢氧化钠(分析纯)，氢氧化钾(分析纯)。试剂的配制流动相A 精密称取0. 280g磷酸二氢钠，加950ml超纯水溶解后用磷酸调节pH至 3.0，稀释至1000ml，即得。流动相B 精密称取0. 280g磷酸二氢钠和140g高氯酸钠，加950ml超纯水溶解后用磷酸调节PH至3.0，稀释至1000ml，即得。流动相A和流动相B用0. 45 μ m滤膜过滤后，脱气后使用。磷酸缓冲溶液(pH7. 0)精密称取磷酸二氢钾68mg，加牛血清白蛋白10mg，置50ml 容量瓶中，加30ml超纯水溶解，测定pH，如有需要用氢氧化钾调节pH7. 0，用超纯水稀释至刻度，摇勻，用0. 45 μ m滤膜过滤后使用。
乙酸钠/钙溶液(pH7. 0)精密称取牛血清白蛋白IOmgJn 32mg乙酸钙，加60ml 的超纯水溶解后，加580 μ L冰醋酸，用2Μ的氢氧化钠调节PH为7. 0，把溶液转移至IOOml 容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，摇勻。用0. 45 μ m滤膜过滤后使用。肝素酶I溶液取肝素酶Il瓶，加磷酸缓冲溶液(pH7. 0)适量，溶解得到0. 4IU/ ml的溶液(有效期-20°C 3个月，使用前取出)。肝素酶II溶液取肝素酶IIl瓶，加磷酸缓冲溶液(pH7. 0)适量，溶解得到0. 4IU/ ml的溶液(有效期-20°C 3个月，使用前取出)。肝素酶III溶液取肝素酶IIIl瓶，加磷酸缓冲溶液(pH7.0)适量，溶解得到 0. 4IU/ml的溶液(有效期-20°C 3个月，使用前取出)。色谱条件
权利要求
1.一种依诺肝素钠酶解方法，其特征在于向依诺肝素钠溶液中加入乙酸钠/钙溶液和混合酶溶液，在温度为四 31°C下酶解66 72小时；其中所述乙酸钠/钙溶液的pH 值为7，所述混合酶中各酶的酶活比例为肝素酶I 肝素酶II 肝素酶III = 0.95 1. 05 1 0. 45 0. 55。
2.根据权利要求1所述的依诺肝素钠酶解方法，其特征在于所述混合酶中各酶的酶活比例为肝素酶I 肝素酶II 肝素酶III = 1 1 0. 5。
3.根据权利要求1所述的依诺肝素钠酶解方法，其特征在于所述依诺肝素钠溶液的浓度为15 25mg/ml ；所述乙酸钠/钙溶液的体积是依诺肝素钠溶液体积的3 4倍。
4.根据权利要求1所述的依诺肝素钠酶解方法，其特征在于所述混合酶溶液由肝素酶 I、肝素酶II和肝素酶III溶解于磷酸缓冲溶液中制成，或者肝素酶I溶液、肝素酶II溶液和肝素酶III先分别溶解于磷酸缓冲溶液中，再混合后制成；所述混合酶溶液中各酶的浓度为 0. 09 0. 40IU/ml。
5.根据权利要求1或4所述的依诺肝素钠酶解方法，其特征在于所述混合酶溶液的体积是依诺肝素钠溶液体积的4. 5 5. 5倍。
6.根据权利要求4所述的依诺肝素钠酶解方法，其特征在于所述磷酸缓冲溶液的配制方法为将磷酸二氢钾和牛血清白蛋白一同溶解于水中后，调节PH值至7. 0，加水稀释后用滤膜过滤；所述磷酸二氢钾和牛血清白蛋白的质量比为6. 7 7 1;磷酸缓冲溶液中磷酸二氢钾的浓度为1. 3mg/ml 1. 4mg/ml ；所述滤膜的孔径在0. 45 μ m以下。
7.根据权利要求6所述的依诺肝素钠酶解方法，其特征在于所述磷酸二氢钾和牛血清白蛋白的质量比为6. 8 1 ；磷酸缓冲溶液中磷酸二氢钾的浓度为1. 36mg/ml ；滤膜孔径为 0. 45 μ m0
8.根据权利要求1或3所述的依诺肝素钠酶解方法，其特征在于所述乙酸钠/钙溶液的配制方法为将牛血清白蛋白和乙酸钙溶解于水中，加入冰醋酸后用氢氧化钠调节PH值为7.0，加水稀释后用滤膜过滤；牛血清白蛋白与乙酸钙的质量比为1 3.0 3. 4，牛血清白蛋白与冰醋酸的质量体积比为1 55 60mg/yL;乙酸钠/钙溶液中乙酸钙的浓度为 0. 30 0. 34mg/ml ；滤膜孔径在0. 45 μ m以下。
9.根据权利要求8所述的依诺肝素钠酶解方法，其特征在于牛血清白蛋白与乙酸钙的质量比为1 3. 2，牛血清白蛋白与冰醋酸的质量体积比为1 58mg/yL，乙酸钠/钙溶液中乙酸钙的浓度为0. 32mg/ml ；滤膜孔径为0. 45 μ m。
全文摘要
本发明公开了一种依诺肝素钠酶解方法，向依诺肝素钠溶液中加入乙酸钠/钙溶液和混合酶溶液，在温度为29～31℃下酶解66～72小时；其中所述乙酸钠/钙溶液的pH值为7，所述混合酶中各酶的酶活比例为肝素酶I∶肝素酶II∶肝素酶III＝0.95～1.05∶1∶0.45～0.55。本方法得到的酶解产物通过HPLC检测，测得共有17组峰的峰面积面积大于总面积的0.3％，明显优于其他条件测得的结果。本发明提供的优化的酶解依诺肝素钠工艺，肝素酶III的用量明显减少，节约成本并且工艺简单、提高检测速度。
文档编号C12P19/04GK102533906SQ20121006386
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月12日 优先权日2012年3月12日
发明者王春华, 王玎玮 申请人:南京健友生化制药股份有限公司