专利名称：一种高通量富集、捕获副溶血性弧菌的方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，具体涉及ー种高通量富集、捕获副溶血性弧菌的方法。
背景技术：
副溶血性弧菌是ー种重要的食源性致病菌，人一旦食用被该菌污染的水产品，易引起腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发热等典型胃肠道症状。因此，对副溶血性弧菌的检测是水产品安全检测的重要内容，如在进出口水产品检测的项目，在饮用水、食品检测和食品中毒源、传染病源调查等工作中，都需对该菌进行检测。副溶血性弧菌的传统检测需经过增菌、 选择性培养、生理生化鉴定和血清学反应等过程，操作繁琐、耗时长、检出率低，不利于及时诊断和流行病学溯源。近年来随着生物技术的发展，PCR,DNA探针、ELISA等相关技术已应用于副溶血性弧菌的检测，但是食品样品和临床样品中的复杂组分往往会干扰副溶血性弧菌检测的准确性；且在低污染水平下，通常需要经过增菌培养以达到检测限，因此检测时间也大大的延长。免疫磁分离(Immonumagnetic Separation, IMS)技术是一种对细胞和微生物进行分离和富集捕获的免疫学方法。它具备快速富集捕获目的靶标和減少其它杂质干扰的优势。免疫磁珠由载体微球和免疫配基通过共价基团偶联而成。目标菌体细胞表面抗原与连有磁珠的抗体结合形成菌体细胞和免疫磁珠复合物，该复合物在磁场作用下会发生定向移动，聚集在磁场周围，从而与其它物质分离。IMS可以有效的分离目的细胞，井能够有效的去除食品样品或临床样品中的抑制因子，是有效的样品前处理方法。该技术和PCR，ELISA等技术连用能够有效的提高检出率和灵敏度。目前，利用MS对目的细菌的分离多采用人工操作的方法进行，操作过程繁琐，容易污染样品，反应耗时长，单个样品的处理量有限，且不能实现样品的批量处理。Pathatrix 系统是由英国Matrix公司根据免疫磁富集的原理研发设计，可进行高通量细胞分选和免疫富集的仪器。它由两部分构成，一次性反应套装和反应支架；反应套装包括反应管和洗脱管，通过无菌管路连接，安装在反应支架上，在磁场的作用下，经过富集和洗脱，将磁珠和菌体细胞的复合物聚集，从而完成免疫富集。该系统完全自动化操作， 16min内完成頂S，单个样品的处理量可达25_50ml，并可同时处理5个样品，可实现高通量处理样品，且较好地避免了人工操作MS引起的资源损耗和样品污染等问题。目前，采用 Pathatrix 进行免疫富集的报道仅有甲型肝炎病毒HAV(Efstathia et al，2008)、沙门氏菌 (Warren BR et al，2007)、大肠杆菌 0157:H7 (Willis et al，2011)。借助Pathatrix :系统对副溶血性弧菌高通量富集捕获的相关研究尚未见报道。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是在于提供ー种免疫磁珠，该免疫磁珠适用于 Pathatrix 系统高通量富集捕获副溶血性弧菌。这种高通量富集、捕获副溶血性弧菌的方法，采用副溶血性弧菌的多克隆抗体，利用EDC/NHS活化法将所述副溶血性弧菌的多克隆抗体偶联在表面包被着羧基的磁珠上，获得制备副溶血性弧菌的免疫磁珠；重悬已偶联多抗的免疫磁珠，将其加入到反应管中，再加入反应液和样品液，在洗脱管中加入洗涤液，采用Pathatrix 系统进行免疫富集。免疫磁珠的制备方法磁珠活化用2-(N-吗啉代)こ磺酸(pH 5)洗涤磁珠1-3次，然后加入50mg/ml 的碳ニ亚胺溶液和50mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温反应20-40分钟，得到活化的磁珠；磁珠与多抗偶联将副溶血弧菌多抗加入到活化的磁珠中，室温培养2-4小时；加入含有1% (w/v)牛血清白蛋白的PBS溶液，封闭反应20-40分钟；加入以含0.02% (w/v) 叠氮化钠NaN3、0. 1% (w/v)牛血清白蛋白BSA的PBS作为保存液，配成终浓度为15mg/ml 的免疫磁珠溶液。本发明中还需要解决的技术问题是提供ー套适用于Pathatrix 系统运行的方案， 用于对副溶血性弧菌高通量富集捕获。解决上述技术问题的方案为应用pathatrix 系统高通量富集捕获副溶血性弧菌的方法，其反应步骤如下(I)取浓度为15mg/ml的免疫磁珠溶液不少于50 yl于PBS洗涤缓冲液中反复洗涤1-3次，再加入100 U I PBS重悬免疫磁珠。(2)安装反应套装将50ml反应液和如步骤⑴所述100 U I免疫磁珠置于样品管，在洗脱管中加入35ml的洗脱液。(3)打开Pathatrix 仪器，将反应套装安装在反应支架中，进行富集捕获。优选地 步骤⑴中免疫磁珠的用量为15mg/ml，100 U I ;步骤⑵中反应液为pH 6. 4的Tris-HCl， 洗脱液为 PBS+0. 05% Tween-20。应用上述方法捕获副溶血性弧菌后，可以采用选择性培养或PCR的方法检测该方法对副溶血性弧菌的富集捕获能力和特异性。本发明的方法同现有技术相比，建立了基于Pathatrix 系统对副溶血性弧菌的高通量富集捕获方法，操作过程简便、耗时短、特异性强、灵敏度高，且能与诸多检测技术联合使用，有效地提高检出率和灵敏度。该发明所需免疫磁珠制备简易，且能在4°C保存数月， 有较好的稳定性；Pathatrix 系统单个样品的处理容量比普通方法扩大25-50倍，能有效的分析样品带菌状态；且该系统能实现高通量处理样品，大大节省劳动力。该方法可广泛应用于各级食品药品监瞀管理机构、疾病预防控制实验室等对水产品和临床病人胃肠道呕吐物、血液、粪便等样品中副溶血性弧菌的富集捕获和后续检測。它可为灵敏、快速、早期诊断副溶血性弧菌污染及感染状况提供可靠的实验证据。
具体实施例方式实施例I一、副溶血性弧菌多抗的制备取副溶血性弧菌ATCC33846新鲜菌液，离心收集菌体，紫外灯下灭活处理后，免疫新西兰大白兔(购自于西普尔必凯公司)，间接ELISA检测血清，待效价> I : 4000，終止免疫，10天后取血。采用硫酸铵多步沉淀法纯化兔抗血清，并采用SDS-PAGE检测抗血清的分子量和纯度。ニ、免疫磁珠的制备羧基磁珠偶联副溶血性弧菌多克隆抗体的具体操作如下取Iml磁珠于2ml的离心管中，用25mM的2_(N-吗啉代)こ磺酸MES(pH5)洗涤磁珠两次。再加入500 u I EDC (碳ニ亚胺，50mg/ml)和500 u I NHS (N-羟基琥珀酰亚胺， 50mg/ml),混合均勻，室温反应30min。将200 U 16. 39mg/ml的多抗加入到经过活化的磁珠， 再加入MES补足1ml，混合均匀，室温下培养3h。加入Iml封闭液(含有I %牛血清白蛋白 BSA的PBS)，封闭未反应位点30min。加入Iml PBS洗涤两次。加入保存液(含0. 02%叠氮化钠NaN3,0. I %牛血清白蛋白BSA的PBS) I. 5ml，配置成终浓度为15mg/ml的免疫磁珠溶液，4 °C冰箱保存备用。三、应用Pathatrix 系统(英国Matrix公司)对副溶血性弧菌进行富集捕获，步骤如下I.取免疫磁珠溶液100 ill于灭菌的2ml离心管中，置于磁力架上，静置2min，待磁珠完全吸附在带磁场的ー侧后，去除上清液，再加入同样体积的PBS，混合均匀，于垂直混合仪上洗漆5min。2.取 Tris-HCl (pH 6. 4) 50ml 置于一次性样品管(sample tube)中，加入 Iml 试验用菌液和IOOu I磁珠，在洗脱管(elution tube)中加入35ml的PBST(PBS+0. 05% Tween-20),将一次性套装(consumable)用无菌管路连接。3.打开Pathatrix 仪器，待显不“Pathatrix ”时，即可取下反应槽(cartridge), 将已安装好的一次性套装放置在反应槽中，按下红色按钮，15min后，待红绿灯交替显示吋， 再按一次，约Imin后完成IMS。4.取下整套装置，取出洗脱管，置于磁力管架上，待磁珠被吸附在ー侧时，去除上清液，加入200 u I PBS,保存在_20°C。四.副溶血性弧菌捕获量的检测对捕获到的菌体细胞和磁珠的复合物，分别取100 U I重悬液直接涂布TCBS平板， 于37°C恒温培养箱中培养16-18h后进行菌落计数，计算捕获量。实施例2富集副溶血性弧菌的免疫磁珠最优化选择羧基免疫磁珠的制备步骤參照实施例I。甲苯磺酰基磁珠D-280-T、链酶亲和素磁珠D-280-S和D-100-S的制备步骤參照使用说明(三种磁珠均购自于美国Invitrogen公司)。采用Pathatrix 系统富集捕获副溶血性弧菌和对其进行的显色培养步骤參照实施例I。免疫磁珠对副溶血性弧菌捕获能力的检测结果见表1，在起始菌液量为6. 641og CFU/ml时，各个磁珠捕获副溶血性弧菌的量均在4-51og CFU/ml水平。羧基磁珠捕获能力最优，为5. 761og CFU/ml，因此选用羧基免疫磁珠富集副溶血性弧菌。表I :免疫磁珠捕获能力的检测
权利要求
1.一种高通量富集、捕获副溶血性弧菌的方法，其特征在于采用副溶血性弧菌的多克隆抗体，利用EDC/NHS活化法将所述副溶血性弧菌的多克隆抗体偶联在表面包被着羧基的磁珠上，获得制备副溶血性弧菌的免疫磁珠；重悬已偶联多抗的免疫磁珠，将其加入到反应管中，再加入反应液和样品液，在洗脱管中加入洗涤液，采用Pathatrix 系统进行免疫富集。
2.根据权利要求I所述的一种高通量富集、捕获副溶血性弧菌的方法，其特征在于所述免疫磁珠的制备方法为磁珠活化用2-(N-吗啉代)乙磺酸(pH 5)洗漆磁珠1-3次,然后加入50mg/ml的碳二亚胺溶液和50mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温反应20-40分钟，得到活化的磁珠；磁珠与多抗偶联将副溶血弧菌多抗加入到活化的磁珠中，室温培养2-4小时；加入含有1% (w/v)牛血清白蛋白的PBS溶液，封闭反应20-40分钟；加入以含O. 02% (w/v)叠氮化钠NaN3、0. 1% (w/v)牛血清白蛋白BSA的PBS作为保存液，配成终浓度为15mg/ml的免疫磁珠溶液。
3.根据权利要求I所述的一种高通量富集、捕获副溶血性弧菌的方法，其特征在于应用Pathatrix 系统高通量富集捕获副溶血性弧菌的反应过程如下A.取免疫磁珠溶液于PBS洗涤缓冲液中反复洗涤1-3次，再加入100μ I PBS重悬免疫磁珠；B.安装反应体系将50ml反应液和如步骤A所处理后的免疫磁珠溶液置于样品管,加入待检测样品拍打液，在洗脱管中加入35ml的洗脱液；C.打开Pathatrix 仪器，将反应套装安装在反应支架中，进行免疫富集。
4.根据权利要求3所述的一种高通量富集、捕获副溶血性弧菌的方法，其特征在于应用Pathatrix 系统进行高通量富集捕获副溶血性弧菌的反应条件为免疫磁珠的用量为不少于 O. 75mg ;反应液为 Tris-HCl 或PBS ;洗脱液为 PBS、PBS+0. 05% Tween-20 或 PBS+0. 1% Tween-20。
5.根据权利要求4所述的一种高通量富集、捕获副溶血性弧菌的方法，其特征在于应用Pathatrix 系统高通量富集捕获副溶血性弧菌的最优化反应条件，具体为免疫磁珠的用量为 I. 5mg ;反应液为 pH 6. 4 的 Tris-HCl ;洗脱液为 PBS+0. 05% Tween-20
全文摘要
本发明涉及的一种高通量富集、捕获副溶血性弧菌的方法，其特征在于采用副溶血性弧菌的多克隆抗体，利用EDC/NHS活化法将所述副溶血性弧菌的多克隆抗体偶联在表面包被着羧基的磁珠上，获得制备副溶血性弧菌的免疫磁珠；重悬已偶联多抗的免疫磁珠，将其加入到反应管中，再加入反应液和样品液，在洗脱管中加入洗涤液，采用系统进行免疫富集。
文档编号C12N1/20GK102586157SQ20121006321
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月12日 优先权日2012年3月12日
发明者卢瑛, 孙晓红, 潘迎捷, 苏晨曦, 赵勇 申请人:上海海洋大学