专利名称：一种优化的碱性果胶酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种喊性果胶酶(alkalinepolygalacturonate lyase,E. C. 4. 2. 2. 2，简称PGL)及其应用，特别是一种优化的高产碱性果胶酶及其基因工程菌。
背景技术：
近年来，随着化学工业的大规模扩张，全球的生态平衡受到严重威胁，环境质量快速恶化，几乎每个国家都在大力发展绿色环保工艺与清洁生产工业。纺织业规模巨大，与全人类生活息息相关。传统的纺织品前处理大致可分为上浆，退浆，精炼和漂白四个步骤，每个步骤都需要消耗大量的化学物质和热能，产生的废水也富含高C0D，对环境造成了严重的污染，已不适应整个社会的发展。目前亟待解决的问题有传统纺织品处理工艺中，多种化学品超量使用形成大量工业废水，水资源与能源消耗巨大，且处理织物中毒害物质残留超标，多国政府已经出台相关条款法令，明文指出纺织品中有毒有害物质，并予以禁止。所以， 利用新型的生物方法对传统工艺进行改革便成为了当今热门话题，原因是相比于传统的化学处理法，生物酶法具有低能耗、无污染、品质高等优点，并且生物酶来源于动植物和微生物，是一种绿色的可再生资源。碱性果胶酶(E. C. 4. 2. 2. 2，简称PGL)，在碱性环境下具有高活性，可以利用反式消去作用切断聚乳糖醛酸的α-1，4_糖苷键，同时释放出Λ4:5不饱和寡聚半乳糖醛酸。该酶可应用于纺织精炼，去除棉纤维初生胞壁中的果胶质或作为煮练助剂。以该酶为主的生物酶精炼工艺更替传统的化学工艺，可以降低热能与化学品的消耗、减缓环境污染，而且被处理织物的柔软性与染色均匀性均优于传统工艺。1972年，Horikoshi K发表了第一篇关于Bacillus sp. P-4-N生产碱性果胶酶的论文。随后，学术界出现了大量有关不同野生菌株发酵生产碱性果胶裂解酶的报道，主要包括菜豆炭疽菌Colletotrichum lindemuthionum、多形拟杆菌Bacteroidesthetaiotaomicron、软腐欧文氏菌 Erwinia carotovora、Amucala sp.、丁香假单胞菌大豆致病变种 Pseudomonas syringae pv. glycinea、炭疽菌 Colletotrichum magna、软腐细菌E. chrysanthemi'Bacillus sp、Bacillus sp. DT-7、蒸枝炭疽病菌 C. gloeosporioides。虽然经过发酵优化可以把碱性果胶酶提高到一定的产量，但野生菌的生产能力普遍处于较低的水平。我国从上世纪90年代初开始也对碱性果胶酶进行了研究，一般均停留在野生菌种筛选、诱变及对酶特性研究阶段。诸葛斌等将来源于Bacillus sp. WSHB04-02的原核碱性果胶裂解酶基因利用穿梭载体PPIC9K在P. pastoris GS115中整合分泌表达，经过发酵过程优化与控制研究，现在碱性果胶酶产量已达世界领先水平。房淑颖等将来源于Bacillussp. WSHB04-02的碱性果胶酶基因利用质粒载体pET_20b (+)在E. coli BL21 (DE3)中整合分泌表达，经过发酵优化与控制研究，碱性果胶酶在原核生物中的产量也达到世界领先水平。但是据报道，到目前为止，碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达量却是极低，产量仅仅只有60U/mL左右。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种优化的碱性果胶酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I 所示。碱性果胶酶基因(Pgl)编码序列来源于Bacillus sp. WSHB04-02 (2004年保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO M204082)中，通过基因定点突变消除pgl中两个BamHI限制性内切酶酶切位点，将HindIII限制性内切酶酶切位点加在碱性果胶酶基因序列的3'端，通过PCR的方法将碱性蛋白酶信号肽基因(bpr)的DNA序列加到碱性果胶酶基因的DNA序列的5'端，消除信号肽基因与碱性果胶酶基因之间的碱基序列，再次通过PCR的方法将优化过的RB S碱基序列加到信号肽基因(bpr)的DNA序列的5'端，然后将出发质粒PP43NMK中启动子上游从BamHI限制性内切酶酶切位点到RBS为止的一段碱基序列通过融合PCR的方法加到前述优化过的RBS碱基序列的5'端，使用BamHI限制性内切酶酶切位点和HindIII限制性内切酶酶切位点将上述构建好的序列加到质粒PP43NMK中，构成重组质粒表达载体PP43NMK1217。上述碱性果胶酶基因编码序列、信号肽碱基序列(下划线区域)、优化后 RBS 序列(斜体区)如下AAAGGAGGAATATATATGAGGAAAAAAACGAAAAACAGACTCATCAGCTCTGTTTTAAGTACAGTTGTCATCAGTTCACTGCTGTTTCCGGGAGCAGCCGGGGCAGCTGATTTAGGCCACCAGACGTTGGGGTCCAATGATGGCTGGGGCGCGTACTCGACCGGCACGACAGGCGGGTCAAAAGCATCGTCCTTAAATGTGTATACCGTCAGCAACAGAAACCAGCTTGTCTCGGCATTAGGGAAGGAAACGAACACAACGCCAAAAATCATTTATATCAAGGGAACGATTGACATGAACGTAGATGACAATCTGAAGCCGCTTGGTCTAAATGACTATAAAGATCCGGAGTATGATTTGGACAAATATTTGAAAGCCTATGATCCTAGCACATGGGGCAAAAAAGAGCCGTCGGGAACACAAGAAGAAGCGAGAGCACGCTCTCAGAAAAACCAAAAAGCACGGGTTATGGTGGATATCCCTGCAAACACGACGATCGTCGGTTCAGGGACTAACGCTAAAGTCGTGGGAGGAAACTTCCAAATCAAGAGTGATAACGTCATTATTCGCAACATTGAATTCCAGGATGCCTATGATTATTTTCCGCAATGGGGTCCGACTGACGGAAGCTCAGGAAACTGGAACTCACAATACGACAACATCACGATAAACGGCGGCACACACATCTGGATTGATCACTGTACATTTAACGACGGTTCGCGTCCGGACAGCACATCACCGAAATATTATGGAAGAAAATATCAGCACCATGACGGCCAAACGGATGCGTCCAACGGCGCTAACTATATCACGATGTCCTACAACTATTATCACGATCATGATAAAAGCTCCATTTTCGGATCAAGTGACAGCAAAACCTCCGATGACGGCAAATTAAAAATTACGCTCCATCATAACCGCTATAAAAATATTGTCCAGCGCGCGCCGAGAGTCCGCTTCGGGCAAGTGCACGTATACAACAACTATTATGAAGGAAGCACAAGCTCTTCAAGTTATCCTTTCAGCTATGCATGGGGAATCGGAAAGTCATCTAAAATCTATGCCCAAAACAATGTCATTGACGTACCGGGACTGTCAGCTGCTAAAACGATCAGCGTATTCAGCGGGGGAACGGCTTTATATGACTCCGGCACGTTGCTGAACGGCACACAGATCAACGCATCGGCTGCAAACGGGCTGAGCTCTTCTGTCGGCTGGACGCCGTCTCTGCATGGATCGATTGATGCTTCTGCTAATGTGAAATCAAATGTCATAAATCAAGCGGGTGCGGGTAAATTAAATTAAAAGCTT。本发明还提供了一种用于表达碱性果胶酶基因的质粒，其RBS序列经过特定改造，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述质粒的构建方法为将含有碱性果胶酶基因(pgl)序列、碱性蛋白酶信号肽基因(bpr)序列、优化后的RBS序列的载体pET-20b(+)与要使用的表达载体pP43NMK进行BamHI和HindIII双酶切，连接得到含有碱性果胶酶基因(pgl)、碱性蛋白酶信号肽基因(bpr)和优化后RBS序列的重组质粒PP43NMK1217，为了使碱性果胶酶基因能够在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtis)WB600中高效表达，选用带有P43启动子的枯草芽孢杆菌表达载体，所述表达载体优选 pP43NMK (Zhang, 2005. High-Level Expression and Secretion ofMethyl Parathion Hydrolase in Bacillus subtilis WB800. Applied and EnvironmentalMicrobiology)。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，化学全合成或PCR扩增碱性果胶酶基因序列及碱性蛋白酶信号肽基因序列，构建重组质粒，优化该质粒RB S序列；转化重组质粒到枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) WB600受体，其来源于中国高校工业微生物资源和信息中心，从事科学研究的个人或机构均可以通过购买获得。采用构建的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtis) WB600生产碱性果胶酶的方法，具体步骤为从甘油管中按O. 4%的接种量接入25mL/250mL三角瓶，回旋式摇床转速200rpm，培养温度为37°C，培养14h ;发酵培养将培养好的种子培养液按8%(v/v)的接种量接种至25mL/250mL三角瓶中进行培养，培养温度为37°C，摇床转速200rpm，发酵2_3天。本发明通过分子生物学的手段，提供了一种新的碱性果胶酶基因。此外，构建了一株高产碱性果胶酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌，应用该菌种生产碱性果胶酶，具有生产·工艺简单、产品产量高等诸多优点，最高产量能达到460U/mL，其参量提高近8倍，结果超预期，解决了一个长期困扰果胶酶产量的问题。此外，该菌株生产的目的蛋白直接分泌到胞夕卜，没有形成包涵体，简化了碱性果胶酶工业生产时的下游纯化工作。本发明为碱性果胶酶的研究、开发、生产工作奠定了基础，也为碱性果胶酶在纺织行业等领域的应用提供了方便。
图I :重组菌 Bacillus subtilis WB600 (pP43NMK1217_pgl)高产碱性果胶酶的蛋白电泳验证M :蛋白质标准分子量；I :Bacillus subtilis WB600 (pP43NMK)发酵上清；2 :Bacillus subtilis WB600 (pP43NMK1217_pgl)发酵上清；3 :Bacillus subtilis WB600(PP43NMK)破壁上清；4 :Bacillus subtilis WB600 (pP43NMK1217_pgl)破壁上清
具体实施例方式实施例I :碱性果胶酶基因序列的获得碱性果胶酶基因(pgl)序列来源于Bacillus sp. WSHB04-02中，米用化学全合成的方法，合成碱性果胶酶编码区序列。实施例2 :重组质粒载体pP43NMK1217的构建将实施例I得到的碱性果胶酶基因和克隆载体pET-20 ( + )分别进行SalI和NcoI双酶切，酶切体系如下质粒 40 μ L，IOXbuffer 5 μ L, Sail 2. 5 μ L, NcoI 2.5yL。将上述组分轻轻混匀，37° C酶切20min。然后以O. 8%琼脂糖凝胶电泳验证并回收PCR扩增产物。后将酶切得到的克隆载体和目的基因进行连接，连接反应体系(10 μ L):目的基因pgl4μL，克隆载体pET-20b ( + )1 μ L，连接酶Solution〗 5yL，16° C，连接过夜。然后将连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，转化方法如下(I)取冷冻保藏的感受态细胞100 μ L冰浴融化；
(2)每管加入10 μ L连接液，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min ；(3)42°C热休克90s (准确)，不要摇动离心管；(4)快速将离心管转移至冰浴中，使细胞冷却2_3min ；(5)每管加入无抗生素的普通LB培养液ImL, 37° C, 200rpm,慢摇Ih ;(6)8000rpm离心菌液2min，吸出上清适量，剩余约100 μ L回收细胞菌体，散开；(7)将100 μ L菌液铺涂布于含100 μ g/mL的氨苄青霉素的琼脂平板上,37°C平放20min直至液体被吸收，然后倒置培养过夜，挑选阳性菌落。挑选阳性菌落进行酶切验证，确定基因序列连接至载体后，送上海生工测序验证，序列正确。然后应用基因定点突变试剂盒(宝生物工程有限公司)，对碱性果胶酶基因进行定点突变，消除目的基因中含有的两个BamHI酶切位点，每次定点突变后均要送上海生工 测序验证，测序结果显示突变成功。然后通过两次PCR或化学全合成，将碱性蛋白酶信号肽基因(bpr)的DNA序列和优化后的RBS序列加到碱性果胶酶基因序列的5'端。然后通过融合PCR将质粒pP43NMK中启动子上游从BamHI限制性内切酶酶切位点到RBS为止的一段碱基序列加到前述优化过的RBS序列的5'端，并在碱性果胶酶基因序列(pgl)的3'端加入HindIII限制性内切酶酶切位点，获得完整的可高效表达的碱性果胶酶基因，序列如SEQID NO，I所示。上述过程均在克隆载体pET-20b ( + )中进行，每次PCR后均要进行胶回收，酶切，连接，转化，挑取阳性转化子酶切验证，测序验证，验证方法同前述方法，验证结果均显示正确。将得到的含有碱性果胶酶基因(pgl)序列、碱性蛋白酶信号肽基因(bpr)和优化后的RBS序列的克隆载体pET-20b ( + )和表达载体pP43NMK分别进行BamHI和HindIII双酶切，酶切体系同前述体系。将上述组分轻轻混匀，于37° C酶切20min后，以O. 8%琼脂糖凝胶电泳验证并回收PCR扩增产物。后将酶切得到的克隆载体和目的基因进行连接，连接体系和连接方法同前述。然后用连接液转化感受态大肠杆菌JM109，然后挑取阳性转化子进行酶切验证，验证正确，重组表达载体PP43NMK1217构建成功，其核苷酸序列如SEQ IDNO, 2所示。实施例3 :重组菌株的培养甘油管甘油浓度为20%;种子培养基组成为(g/L):蔗糖20，蛋白胨10，玉米浆30，磷酸氢二钾18. 4，磷酸二氢钾6，pH7.0,50yg/mL卡那霉素；发酵培养基组成为(g/L):玉米淀粉15，蛋白胨8，酵母膏10，磷酸氢二钾9. 2，磷酸二氢钾3，pH7. O, 50 μ g/mL卡那霉素；种子培养从甘油管中按O. 4%的接种量接入25mL/250mL三角瓶，回旋式摇床转速200rpm，培养温度为37°C，培养14h ;发酵培养将培养好的种子培养液按8%(v/v)的接种量接种至25mL/250mL三角瓶中进行培养，培养温度为37°C，摇床转速200rpm，培养2_3天，碱性蛋白酶产量可达460U/ml，SDS-PAGE如图I所示。
权利要求
1.一种优化的碱性果胶酶基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.用于表达权利要求I所述碱性果胶酶基因的质粒，其特征在于核苷酸序列如SEQIDNO. 2 所示。
3.一种产碱性果胶酶重组枯草芽孢杆菌，其特征在于含有权利要求2所述的质粒，高效表达权利要求I所述碱性果胶酶基因。
4.权利要求3所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，化学全合成或PCR扩增碱性果胶酶基因序列及碱性蛋白酶信号肽基因序列，构建重组质粒，优化该质粒RBS序列；转化重组质粒到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) WB600受体。
5.应用权利要求3所述枯草芽孢杆菌生产碱性果胶酶的方法，其特征在于从甘油管中按O. 4%的接种量接入25mL/250mL三角瓶，回旋式摇床转速200rpm，培养温度为37°C，培养14h ;发酵培养将培养好的种子培养液按8%(v/v)的接种量接种至25mL/250mL三角瓶中 进行培养，培养温度为37°C，摇床转速200rpm，发酵2_3天。
全文摘要
本发明公开了一种优化的碱性果胶酶基因及其应用，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。通过合成Bacillus sp.WSHB04-02中的碱性果胶酶基因(pgl)序列，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽(bpr)，构建了重组质粒pP43NMK1217，优化重组质粒pP43NMK1217的RB S序列，其可用于碱性果胶酶的高效表达，用其构建的高效分泌表达碱性果胶酶的基因工程菌WB600-pgl，其碱性果胶酶产量可达460U/Ml，高于现有水平8倍，具有广阔的应用前景。
文档编号C12R1/125GK102911956SQ20121027985
公开日2013年2月6日 申请日期2012年8月7日 优先权日2012年8月7日
发明者陈坚, 张俊娇, 康振, 堵国成 申请人:江南大学