专利名称：鸡柔嫩艾美耳球虫ma1基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及鸡柔嫩艾美耳球虫姻2蛋白(位姻7蛋白)的膜外功能域蛋白Wii^i-Outside domain)及其编码基因、含有该基因的载体、重组菌株及其应用；还涉及鸡柔嫩艾美耳球虫姻7蛋白及其编码基因、含有该基因的载体、重组菌株及其应用。
背景技术：
鸡球虫病是一种严重危害集约化养鸡业、世界性流行的寄生虫病，在无预防措施或预防失败(如因抗药性问题致药物无效)的情况下，鸡发病率可达30%-100%，致死率可高 达80%。全球每年因球虫病引起的经济损失超过35亿美元以上，我国因球虫病所致养鸡业的经济损失估计可高达35亿元人民币以上。目前，世界公认的鸡球虫有7种柔嫩艾美耳球虫(疋te/^77a)，毒害艾美耳球虫(￡· neca trix ),巨型艾美耳球虫(i . maxima )，堆型艾美耳球虫(i . acervulina )，布氏艾美耳球虫iE. brunette),早熟艾美耳球虫iE. praecox),和缓艾美耳球虫(M. mitis),其中柔嫩艾美耳球虫主要侵害盲肠，是毒力最强、危害最大的鸡球虫，也是研究最多的虫种。长久以来，国内外鸡球虫病的预防一直采用“在饲料中添加抗球虫药、实行以饲料厂为中心控制环节”的技术方法，但该方法已遭遇到球虫抗药性的严峻挑战，在某些地区甚至已到无药可用的困难境地。免疫控制技术作为一种“新型的(novel)可持续的(sustainable) ”的球虫病控制方法已得到越来越多的应用。尽管以鸡球虫病活卵囊疫苗为主要技术载体的免疫控制技术正在逐步推广应用，但这类疫苗完全以鸡体作为唯一制苗载体，普遍存在生产成本高、保存运输困难、接种使用后对鸡体生长有明显抑制、散毒危险和难以质量控制等几乎不可逾越的障碍。因此，开发新药或新型分子疫苗是球虫病研究的主要方向，然而迄今为止，人们对艾美耳球虫的药物靶标分子或候选疫苗分子都知之甚少。顶膜抗原(Apical Membrane Antigen, ΑΜΑ)是一种在顶复门原虫中高度保守的微线分泌蛋白，可以和棒状体分泌的颈部蛋白共同形成“运动结合体(Moving Junction)”,共同完成虫体与宿主细胞的粘附作用，是协助虫体进入宿主细胞的关键物质。近几年，通过对鸡球虫基因文库和蛋白质组的研究，开始对鸡球虫AMAl有所了解，但目前为止未有系统性研究的报道。Ng等在对柔嫩艾美耳球虫的子孢子和裂殖子的cDNA文库比较研究时发现，子孢子阶段有一条EST序列(基因登陆号BG589)与AMAl具有相似性，而在裂殖子文库中未找到相同的EST序列。在Bromley等的蛋白组学研究中发现，柔嫩艾美耳球虫不只一种顶膜抗原，并且出现在不同的发育阶段，所以分析可能这些蛋白分别在不同的入侵阶段发挥着类似的作用。Blake等利用基因图谱法对球虫中免疫力最强的巨型艾美耳球虫保护性抗原进行筛选，将两株具有不同生物学特性的巨型艾美耳球虫在鸡体内进行杂交后的基因组，与柔嫩艾美耳球虫的基因组进行比对，结果发现与AMAl具有同源性的抗原可以优先刺激机体产生免疫力，可以优先作为疫苗和药物开发的研究靶标。本课题组在对广东株柔嫩艾美耳球虫裂殖子cDNA的克隆时，获得了多个类似顶膜抗原的基因，其中鸡柔嫩艾美耳球虫蛋白(万—2」的氨基酸序列与EtAMAl具有高度保守的序列，推测为EtAMAl的家族蛋白。在对其功能进行研究时，发现免疫蛋白的膜外功能结构域可以有效预防鸡体感染鸡球虫病。而迄今为止，尚无任何其他关于该蛋白对艾美耳球虫免疫保护性的研究。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种鸡柔嫩艾美耳球虫蛋白(MMA1蛋白)。本发明的另一个目的在于提供编 码上述万_2蛋白的基因。本发明的目的在于提供一种位姻7膜外功能域蛋白(i ii^7_0utside domain)。本发明的另一个目的在于提供编码上述膜外功能域蛋白的基因。本发明的另一个目的在于提供含有万_2蛋白基因或万_7膜外功能域蛋白基因的克隆载体。本发明的另一个目的在于提供一种万_2膜外功能域蛋白的制备方法。本发明的另一个目的在于提供万_2蛋白和/或万_2膜外功能域蛋白在制备抗艾美耳球虫药物中的应用。本发明所采用的技术方案是
鸡柔嫩艾美耳球虫姻7蛋白(扮M7蛋白)，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示，或者是SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等活性的蛋白。编码上述位姻7蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO : I所示。位姻7膜外功能域蛋白(i ii^7_0utside domain),其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，或者是SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等活性的蛋白。编码上述位姻7膜外功能域蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。一种克隆载体，含有万—2蛋白的编码基因或万—2膜外功能域蛋白的编码基因。一种表达载体，含有万_2蛋白的编码基因或万膜外功能域蛋白的编码基因。缺EtMAl膜外功能域蛋白的方法，包括将上述的表达载体导入宿主细胞中，表达得到万_7膜外功能域蛋白。EtMAl蛋白或万_7膜外功能域蛋白在制备抗艾美耳球虫药物中的应用。本发明的有益效果在于
通过免疫膜外功能域蛋白，能有效控制鸡体感染柔嫩艾美耳球虫病，大大降低养鸡场抗球虫药的使用量，有效控制鸡球虫病。
图I是万.tenella裂殖子总RNA电泳结果；
图2是位姻7基因全长ORF的PCR扩增鉴定结果(M. DL 2000 Marker ; I.位姻7的PCR产物);图3是EtMAl的菌液PCR鉴定结果(M. DL 2000 Marker ；1:位姻7阳性菌)
图4是EtMAl信号肽切割位点分析 图5是EtMAl膜外结构域位点分析 图 6 是位姻7-Outside domain 的 PCR 产物电泳图(M. DL 2000 Marker ；1,2.EtMAl-Qutside domain 的 PCR 产物)；
图 7 是位姻7-Outside domain 的菌液 PCR 鉴定电泳图(E DL 2000 Marker ;5，6.EtMAl-Outside domain 菌液 PCR 结果)；
图8是pColdl -EtMAl-Qutside domain的酶切鉴定电泳 图9是pColdI~5Yi^7-0utside domain表达产物SDS-PAGE电泳分析图(Μ.蛋白质分子质量标准；I.未诱导菌液；2.诱导后菌液；3-9.纯化的融合蛋白；10. Western blot)。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等都采用常规的方法，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002,北京科学出版社)。及《现代分子生物学实验技术》(卢圣栋主编，第2版，北京中国协和医科大学出版社，1999.)
实施例I
I万基因序列的克隆
I.I PCR引物设计根据预测的疋tenella棒状体颈部蛋白扮M2基因的cDNA序列用Premier Primer 5. O软件设计,上海英骏生物工程公司合成
上游引物 MAlF :5’ ATGGAGGCTCTACGGGAAGGCTTC 3’ (SEQ ID NO: 5);
下游引物 MAlR :5’ TTAGTAGTAGGCGTCGTGGGCGTTG 3’ (SEQ ID N0:6)。I. 2广东株万.裂殖子(由广东省农业科学院兽医研究所寄生生物研究室保存)的分离和纯化方法参照《鸡球虫病学》(索勋，李国清主编，北京中国农业大学出版社，1997.)。I. 3 E. tenella裂殖子总RNA的提取方法参照Invitrogen公司的TRIZOL LS Reagent试剂盒说明书。分光光度计测定RNA浓度为lPg/ml ;电泳结果显示分共为28S，18S和5S等3个大小不同的片段，条带清晰(如图I)。I. 4 RT-PCR 扩增 EtMAl 全长 ORF 序列
以上述步骤抽提的万.tenella裂殖子的总RNA作为模板，用Takara公司的PrimeScript lst Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒合成 cDNA ;以 cDNA 为模板，MA1F,MAlR为引物，TaKaRa LA Taq 酶进行PCR扩增，反应条件94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，72°C延伸10min，35个循环。产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果扩增获得一条约1600bp的片段(见图2)。将PCR产物纯化回收后按试剂盒说明书连接至PMD18-T载体(Takara公司)，再将连接产物转化入万.co7i DH5 α感受态细胞，得到E.coli DH5a (pMD18_T-位姻7 )。在Amp抗性平板上生长的白色菌落为可疑重组子，挑单菌落培养，以菌液为模板，以引物进行菌液PCR扩增，获得大小约为1600bp的条带(见图3)。阳性菌送上海生工生物工程公司测序，EtMAl序列全长为1617bp，如SEQID NO: I 所示。1.5序列的分析
利用在线 Translate tool (http://www. expasy. ch/tools/dna. html)翻译序列，推测出其氨基酸序列(SEQ ID NO. 2)。利用信号肽在线分析软件SignalP 4.0 Server分析信号肽，利用跨膜结构域在线分析软件TMHMM Server v. 2. O分析氨基酸序列，确定34aa 35aa为信号肽切割位点(图4), laa_443aa为膜外结构域(图5),根据分析结果，本实验选取35aa 443aa蛋白(SEQ ID NO:4所示，其编码基因为SEQ ID NO:3)作大EtMAl膜外功能域蛋白(EtMA1-Outside domain),进行表达和动物保护性实验。2 EtMAl 膜外功能域蛋白 (EtMA1-Outside domain)的制备 2. I EtMAl-QutsiAe domain 的扩增
扩增引物
EtMAl-QutsiAe domainF
5’ GGCGGATCCTCTAACGGCTCACAGGTAGCTTCC 3’ (SEQ ID NO:7)；
EtMAl-QutsiAe domain R
5’ GGCAAGCTTTTAAGGGATGCTGCTGCAGTTGCAGT 3’ (SEQ ID NO:8)。在引物的上游序列中分别引入及 " I酶切位点，在下游引物引入历酶切位点；并分别加“GGC”3个碱基以保证内切酶发挥作用。以上引物均由广东英俊生物技术公司合成。以厶coli DH5 a (pMD18_T-位姻7 )为模板，建立如下PCR反应扩增位姻7-Outsidedomain的序列
权利要求
1.鸡柔嫩艾美耳球虫蛋白(ぬ·i蛋白)，其氨基酸序列如SEQID NO: 2所示，或者是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加ー个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等活性的蛋白。
2.编码权利要求I所述蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
4.万(姻7膜外功能域蛋白(i ii^7_0utsidedomain),其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，或者是SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加ー个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等活性的蛋白。
5.编码权利要求4所述蛋白的基因。
6.根据权利要求5所述的基因，其核苷酸序列如SEQID N0:3所示。
7.ー种克隆载体，含有权利要求2、3、5或6所述的基因。
8.—种表达载体,含有权利要求2、3、5或6所述的基因。
9.电产EtMAl膜外功能域蛋白的方法，包括将权利要求8所述的表达载体导入宿主细胞中，表达得到^'膜外功能域蛋白。
10.权利要求I或4所述的蛋白在制备抗艾美耳球虫药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了鸡柔嫩艾美耳球虫MA1基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用。EtMA1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，或者是SEQIDNO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等活性的蛋白。本发明还公开了EtMA1膜外功能域蛋白(EtMA1-Outsidedomain)，其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，或者是SEQIDNO:4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等活性的蛋白。EtMA1蛋白和EtMA1膜外功能域蛋白可应用于制备抗艾美耳球虫药物，通过免疫EtMA1膜外功能域蛋白，能有效控制鸡体感染柔嫩艾美耳球虫病，大大降低养鸡场抗球虫药的使用量，有效控制鸡球虫病。
文档编号C12N15/30GK102816221SQ201210279040
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月6日 优先权日2012年8月6日
发明者戚南山, 孙铭飞, 吴彩艳, 廖申权, 吕敏娜, 温烈娜, 谢明权 申请人:广东省农业科学院兽医研究所