专利名称：水产养殖鲇鱼杂种的rag2分子标记rflp鉴定方法
技术领域：
本发明涉及鱼类杂种的鉴定方法，具体涉及水产养殖鲇鱼杂种的RAG2分子标记RFLP鉴定方法。
背景技术：
鲇形目鱼类属肉食性底层鱼类，是鱼类进化中最发达的真骨鱼类之一。南方鲇(又叫大口鲇)iSilurus meridionalis Chen)和鲇asotus Linnaeus)均属于鲇形目、鲇科、鲇属，两者味道鲜美、营养价值高，是我国各地主要养殖的高附加值经济鱼类。南方鲇分布于我国珠江、闽江、湘江、长江等水系，是一种大型凶猛的肉食性鱼类，具有生长 快、个体大、抗病力强等特点，喜栖息于开敞水体，以及湾花、河底砾石河段，怀卵量大，产卵期长。鲇分布于除青藏高原及新疆外的全国各水系，体色随栖息环境不同而有所变化，主要栖息于江河干流或较大的支流、大型湖泊和水库等水体的中下层，其适应性强，栖息于静水或缓流水域，个体较小，生长快。南方鲇和鲇形体轮廓相似，小个体的南方鲇与鲇成体混同杂居，大个体与鲇隔离生活。据报道，人工繁殖的南方鲇群体中雄性比例非常低。调查显示，当雄性南方鲇缺乏时，可能进行了雌性南方鲇与其他雄性鲇属种类的杂交，从而在鲇鱼生产中出现了物种间的杂交育种。为了满足社会生产的需要，获得兼有以上2种鱼优良性状的苗种，王朝明等(大口鲇与鲇鱼的杂交试验，淡水渔业，2004，34 (6): 4广43 ;三种鲇遗传多样性的RAPD分析，淡水渔业，2005，35 (4) : 14 17)开展了南方鲇与鲇的杂交育种试验，并做了一定的杂种鉴定工作，筛选出22个随机引物用于南方鲇、鲇及其杂交F1代三个群体多样性分析，结果发现杂交F1代继承了大口鲇的52条特征带和鲇的32条特征带。然而，其鉴定工作所采用的RAH)标记，受方法本身的限制，检测效率低且重复性不高，严重影响了这一方法的推广使用。此外，仅有龙华等(鲇、大口鲇及其杂交鲇血液生理生化指标比较及转铁蛋白等位基因分析，长江大学学报(自科版)，2006，3 (2): 161^164 ；鲇、大口鲇及其杂交鲇的血型分析，水利渔业，2007，27 (3) : 19 20)对南方鲇、鲇及其杂交鲇的血液生理、血型分析及同工酶等方面的研究。可见，有必要开展南方鲇、鲇及其杂交子代的分子标记及鉴定技术研究，为南方鲇养殖和育种实践中的杂种鉴定提供可靠方法。PCR-RFLP作为传统的分子标记，在杂种鉴定领域，方法为依据目的基因序列，找出近缘种中同一基因的差异位点，设计限制性内切酶酶切位点，通过酶切产生长度不等的酶切片段，进行限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析，可以有效研究种群种质、鉴定杂种。
发明内容
本发明的目的为鉴定南方鲇与鲇的杂种，从分子生物学层面上将形态上不易区分的杂种和纯种进行分辨。本发明以南方鲇、鲇及其杂交子代为研究对象，在鲇属鱼类中筛选设计了 RAG2基因片段作为分子标记，首次应用RAG2基因片段的RFLP分析，成功鉴定了南方鲇、鲇及其杂交子代。
RAG2基因片段是核重组活化蛋白基因外显子片段，这一基因种内变异低并广泛用于评价种内遗传和关系。本发明将RAG2基因片段的RFLP分析用于南方鲇、鲇及其杂交子代的鉴定，具有实验快捷，操作简便，鉴定直观，无需测序的优点。为实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案
水产养殖鲇鱼杂种的RAG2分子标记RFLP鉴定方法，其特征在于应用PCR扩增后的基因片段在南方鲇与鲇之间存在的种间序列差异，据此筛选合适的限制性内切酶，分析鉴定南方鲇、鲇及其杂交子代。所述的水产养殖鲇鱼杂种的RAG2分子标记RFLP鉴定方法，包括以下步骤
A分别取南方鲇、鲇及其杂交子代样本，提取基因组DNA ；
B分别以南方鲇、鲇及其杂交子代样本的基因组DNA为模板，在RAG2基因片段特定引物的引导下进行PCR扩增；
C分别对南方鲇、鲇及其杂交子代样本的RAG2基因片段进行限制性内切酶Stu I和Xho I的酶切反应；
D利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR-RFLP产物，在一个泳道上同时出现南方鲇和鲇的两条基因条带，即为南方鲇和鲇的杂交种。本发明所用样本分为3类，鲇、南方鲇和杂交鲇(即子代)，针对以上样本分别使用上述2种限制性内切酶进行2步酶切(一步用一种，参见下述具体方案)，每种限制酶单独酶切。如图I和图2所示的电泳图是所有3类样本依次用两种限制酶酶切的图谱。所述的步骤B中的RAG2基因片段特定引物，其碱基序列为
正向引物(SEQID NO:3) 5，-TTAGTGTTGACAATCGTGG-3，；
反向引物(SEQID NO:4) 5’-TCTTCTAGAGGTGCAGAATC-3’。所述的RAG2基因片段特定引物，所扩增出的南方鲇的基因片段的核苷酸序列为SEQID NO:I。所述的RAG2基因片段特定引物，所扩增出的鲇的基因片段的核苷酸序列为SEQIDN0:2。所述的步骤C中，使用PCR仪进行酶切，酶切反应体系为15 UL，限制性内切酶Stu I酶切RAG2基因片段的步骤为5 ii L RAG2-PCR扩增产物，加入I u L酶切反应缓冲液，0.5 UL限制性核酸内切酶Stu I，酶切位点为AGG丨CCT，酶切反应参数为37°C、5飞min,酶的失活参数为80°C、10 11 min ；
所述的步骤C中，使用PCR仪进行酶切，酶切反应体系为15 u L，限制性内切酶Xho I酶切RAG2基因片段的步骤为5 ii L RAG2-PCR扩增产物，加入I U L酶切反应缓冲液，0. 5UL限制性核酸内切酶Xho I，酶切位点为C丨TCGAG，酶切反应参数为37°C、5飞min，酶的失活参数为80°C、5 6 min。本发明通过寻找种间序列差异，在种间差异中找到合适的限制性内切酶识别位点，从中选择只能限制性酶切南方鲇RAG2基因片段的限制性核酸内切酶和只能限制性酶切鲇RAG2基因片段的限制性核酸内切酶。针对RAG2基因片段，本发明依次找到ZAo I限制性酶切南方鲇目的基因和泣"I限制性酶切鲇目的基因。当内切酶为I，酶切基因片段为鲇RAG2，酶切位点为AGG丨CCT。当内切酶为通o I，酶切基因片段为南方鲇RAG2，酶切位点为C I TCGAG。
当酶切杂交子代RAG2基因片段时，由于其RAG2基因来自双亲，使得2种限制性内切酶可以同时发挥作用。因此，依次使用内切酶泣《 I和通o I酶切杂交子代RAG2基因片段，其参数条件与亲代相同。本发明的有益效果表现为
(I)本发明由于采用DNA序列作为分子标记，因此可以准确快速地将形态上不易区分的鲇鱼杂种和鲇鱼纯种进行分辨,并确定出南方鲇和鲇的杂交种。
(2)本发明首次采用RAG2基因片段的RFLP分析鉴定南方鲇、鲇及其杂交子代，具有实验快捷，操作简便，鉴定直观，无需测序的优点。(3)本发明针对鲇和南方鲇RAG2基因序列的特征，筛选出合适的限制性内切酶Stu I和ZAo I，并分别设计了一套适用的酶切反应体系，使鲇鱼杂种的鉴定更快捷、更准确。
图I为通o I酶切分析南方鲇，鲇及其F1正反交子代的RAG2基因条带图。图2为泣y I酶切分析南方鲇，鲇及其F1正反交子代的RAG2基因条带图。图中标记为图I的左侧数字与图2右侧数字均表示DNA片段的分子量，Dl D4为南方鲇样本，Al A4为鲇样本，Zl Z7为正交后代，Fl F7为反交后代，DO和AO为没有经过酶切的基因，M为Marker，本发明所用为DL2000 DNA Marker (Tiangen公司)。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。实施例I
水产养殖鲇鱼杂种的RAG2分子标记RFLP鉴定方法，以南方鲇、鲇及其杂交F1代作为研究对象，包括以下步骤
第一步，分别取南方鲇、鲇及其杂交子代样本，提取基因组DNA。因为杂交鱼苗个体很小，所以用海洋组织DNA提取试剂盒(Tiangen公司)提取鱼苗样本基因组DNA。用传统的酹-氯仿抽提法(Sambrook & Russell, 2001)提取亲本南方鲇和鲇鳍条样本的基因组DNA
a取材取无水乙醇浸泡的鳍条样本少许，用酒精消毒的剪刀剪碎，放入I. 5 ml EP管中。b 消化加入 500 u L 裂解缓冲液(10 mmol/L Tris-Cl ；0. I mol/L EDTA ；0. 5 %SDS ；pH 8.0),5 ML蛋白酶K (20 mg/ml )，混合均匀，放入55 °C的摇床内，60-70 rpm消化过夜。c抽提I :取出EP管，待溶液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚(约500 ML)，缓慢混匀10 min, 12000 rpm离心10 min，用I ml枪头缓慢将上清液移至另一 EP管中。d抽提2 :重复抽提I的步骤，用饱和酚再抽提一次，将上清液转入另一 EP管中。e抽提3 :加入400 ML的酹-氯仿(I :1),缓慢混勻5 min, 12000 rpm离心10 min,
轻轻将上清液转入另一 EP管中。
f抽提4 :加入300 ML的氯仿，缓慢混匀5 min, 12000 rpm离心10 min,上清液转
移至另一 EP管中。g沉淀加入管内体积两倍体积的冰冻无水乙醇,于_20°C沉淀20 min。8000 rpm离心I min。h漂洗I :加入150 ML 75 %的冰冻酒精，漂洗后，8000 rpm离心I min。i漂洗2 同漂洗I步骤。j漂洗3:用150 ML冰冻无水乙醇再漂洗一次，8000 rpm离心I min后，弃掉上清，
自然风干。k溶解加入50 ML MilliQ超纯水，溶解沉淀的DNA。 琼脂糖凝胶电泳检测模板DNA
制备I %的琼脂糖凝胶，并将2 ML DNA溶液加入点样缓冲液并混匀上样电泳。100 V电压电泳30 min。电泳后根据紫外透射检测仪上电泳带的亮度来确定模板DNA的浓度，并相应稀释模板，使DNA模板的浓度最终约为5(Tl00 ng/ ML。第二步，分别以南方鲇、鲇及其杂交子代样本的基因组DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增。(I) PCR 扩增
PCR用来扩增南方鲇和鲇的重组活化蛋白基因2 (RAG2)。RAG2引物参考天竺细丝鲶Micronema apogon重组活化蛋白基因2序列(GenBank号DQ492372),应用引物设计软件Primer 5. 0 设计RAG2_F (SEQID NO: 3) (5’-TTAGTGTTGACAATCGTGG-3’)和 RAG2-R (SEQIDN0:4) (5，-TCTTCTAGAGGTGCAGAATC-3’)，均由 Invitrogen 公司合成。RAG2-F和RAG2-R为扩增RAG2目的片段的引物对，其中的F代表上游引物(或正向引物)，R代表下游引物(或反向引物)。反应体系为50 ML，将各组分按以下顺序依次在0. 2 mL的PCR管中混合
①超纯水36.5 ML
②Taq 酶 IOX buffer5 ML
③MgCl2 (I. 5 mM)4 ML
④dNTPs (2. 5 mM)I ML
⑤上游引物(25pM)I ML
⑥下游引物(25pM)I ML
⑦亲本模板DNA(约100 ng) I ML
⑧Taq DNA 聚合酶(2. 5 U U L-1) 0. 5 ML 扩增步骤为
①94° C预变性4 min
②94。C变性40 s
③58° C退火30 s
④72° C延伸I min
⑤重复步骤②-④31次
⑥72。C充分延伸10 min
(2)PCR产物纯化与测序用I %的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物片段，在紫外灯下切割目的条带并放入I. 5 ml的EP管中，回收采用DNA Agarose Extraction kit (Omega公司)回收试剂盒。经琼脂糖凝胶电泳检测回收产物后，取检测良好的样本用于后续连接转化。将PCR回收产物与连接载体PMD19-T连接，并转化JM109感受态细胞和过夜培养，之后挑选单克隆菌落进行扩大培养，对其进行菌落PCR后，选取有最佳阳性克隆菌落的菌液送生物公司进行测序分析。测序验证其序列信息，发现RAG2基因片段存在种间序列差异，用于进行后期的RFLP法杂种鉴定。第三步，特异酶切片段标记的产生。( I)数据分析及限制性酶切设计
采用DNAMAN Version 6对南方鲇与鲇的RAG2的测序结果分别进行比对，应用引物设 计软件Primer 5. 0查找序列中的可用酶切位点并筛选其中高度稳定的位点。RAG2基因片段选取限制性核酸内切酶通o I (Fermentas公司)，酶切位点为C丨TCGAG，限制性酶切南方鲇RAG2，以及限制性核酸内切酶I (Fermentas公司)，酶切位点为AGG I CCT，限制性酶切鲇RAG2。(2) PCR制备酶切底物
在南方鲇、鲇及其杂交子代中PCR扩增RAG2基因片段，PCR体系和参数同上。经I %琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将检测良好的产物用于后续酶切操作，检测不佳的优化PCR扩增条件后重新制备。在冰上配制酶切反应体系，2种限制性内切酶的酶切体系相似，只需要把限制性内切酶更换，按以下顺序依次添加
超纯水8. 5 ii L
PCR 产物5 ii L
限制性核酸内切酶(Fermentas公司) 0.5 u L 酶切反应缓冲液(Fermentas公司)I y L
Total15 u L
使用PCR仪进行酶切，反应参数分别为
Xho I 酶切 RAG2 基因片段参数为37°C 5 min 10 s，80°C 5 min 10 S。Stu I 酶切 RAG2 基因片段参数为37°C 5 min 10 s，80°C 10 min 10 S。第四步，琼脂糖凝胶电泳检测PCR-RFLP产物。制备约2 %的琼脂糖凝胶，将10 ML酶切产物加入点样缓冲液并混匀，上样电泳，恒压90 V电泳30 min。电泳后用凝胶成像系统显现目的条带，对南方鲇、鲇及其杂交F1代进行PCR-RFLP分析。实施例2
水产养殖鲇鱼杂种的RAG2分子标记RFLP鉴定方法，以南方鲇、鲇及其杂交F1代作为研究对象，技术方案与实施例I相同。在实施例I的基础上，在第三步中，使用PCR仪进行酶切，反应参数分别为
Xho I酶切RAG2基因片段参数为37°C 5 min, 80°C 5 min。Stu I 酶切 RAG2 基因片段参数为37°C 5 min,80°C 10 min。
实施例3
水产养殖鲇鱼杂种的RAG2分子标记RFLP鉴定方法，以南方鲇、鲇及其杂交F1代作为研究对象，技术方案与实施例I相同。在实施例I的基础上，使用PCR仪进行酶切，反应参数分别为
Xho I 酶切 RAG2 基因片段参数为37°C 5 min 30 s，80°C 5 min 30 S。Stu I 酶切 RAG2 基因片段参数为37°C 5 min 30s, 80°C 10 min 30s。实施例4
水产养殖鲇鱼杂种的RAG2分子标记RFLP鉴定方法，以南方鲇、鲇及其杂交F1代作为研究对象，技术方案与实施例I相同。 在实施例I的基础上，使用PCR仪进行酶切，反应参数分别为
Xho I酶切RAG2基因片段参数为37°C 6 min, 80°C 6 min。Stu I 酶切 RAG2 基因片段参数为37°C 6 min，80°C 11 min。实施例5
水产养殖鲇鱼杂种的RAG2分子标记RFLP鉴定方法，以南方鲇、鲇及其杂交F1代作为研究对象，技术方案与实施例I相同。在实施例I的基础上，使用PCR仪进行酶切，反应参数分别为
Xho I 酶切 RAG2 基因片段参数为37°C 5 min 30s, 80°C 6 min。Stu I 酶切 RAG2 基因片段参数为37°C 5 min，80°C 10 min 10s。
本发明的琼脂凝胶制备方法如下
I %的琼脂糖凝胶的制备方法
用天平称取0.3 g琼脂糖，倒入30 ml的I XTAE缓冲液中，摇匀后置于微波炉中加热至完全溶解，取出待稍凉后(防止高温使EB挥发)JPAEB 2 ML。将制胶板(Bio-Rad公司)放置于水平位置，然后插入样品梳子。将之前配制的琼脂糖凝胶倒入制胶板内槽。冷却半小时待凝胶凝固后取出梳子，将凝胶放入电泳槽(Bio-Rad公司)内并加入IXTAE电泳缓冲液使其浸没凝胶。在点样板上点上1/6体积的点样缓冲液(溴酚蓝)。2 %的琼脂糖凝胶的制备方法
用天平称取0.6 g琼脂糖，倒入30 ml的I XTAE缓冲液中，摇匀后置于微波炉中加热至完全溶解，取出待稍凉后(防止高温使EB挥发)JPAEB 2 ML。将制胶板(Bio-Rad公司)放置于水平位置，然后插入样品梳子。将之前配制的琼脂糖凝胶倒入制胶板内槽。冷却半小时待凝胶凝固后取出梳子，将凝胶放入电泳槽(Bio-Rad公司)内并加入IXTAE电泳缓冲液使其浸没凝胶。在点样板上点上1/6体积的点样缓冲液(溴酚蓝)。本发明使用的主要仪器如下
PCR 仪Bio-Rad iCycIer 和 MJ100 离心机Eppendorf Centrifuge 5415D
稳压稳流电泳仪BI0-RAD power PAC 300
凝胶成像系统Alphalmage Multimage Light Cabinet
电子天平、培养箱、蒸汽灭菌器、摇床以及一些常用的实验设备。上述实施例结果显示本发明的南方鲇和鲇的RAG2基因片段在GenBank中都未见报道，如图I和图2的基因条带图所示，杂交子代鲇同时出现南方鲇和鲇的两条基因条带，经测序验证分别与2种亲本序列一致。 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
权利要求
1.水产养殖鲇鱼杂种的RAG2分子标记RFLP鉴定方法，其特征在于应用PCR扩增后的RAG2基因片段在南方鲇与鲇之间存在的种间序列差异，采用合适的限制性内切酶，分析鉴定南方鲇、鲇及其杂交子代。
2.根据权利要求I所述的水产养殖鲇鱼杂种的RAG2分子标记RFLP鉴定方法，其特征在于包括以下步骤 A分别取南方鲇、鲇及其杂交子代样本，提取基因组DNA ； B分别以南方鲇、鲇及其杂交子代样本的基因组DNA为模板，在RAG2基因片段特定引物的引导下进行PCR扩增； C分别对南方鲇、鲇及其杂交子代样本的RAG2基因片段进行限制性内切酶Stu I和Xho I的酶切反应； D利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR-RFLP产物，在一个泳道上同时出现南方鲇和鲇的两条基因条带，即为南方鲇和鲇的杂交种。
3.根据权利要求2所述的水产养殖鲇鱼杂种的RAG2分子标记RFLP鉴定方法，其特征在于所述的步骤B中的RAG2基因片段特定引物，其碱基序列为 正向引物(SEQID NO:3) 5，-TTAGTGTTGACAATCGTGG-3，； 反向引物(SEQID NO:4) 5’-TCTTCTAGAGGTGCAGAATC-3’。
4.根据权利要求3所述的水产养殖鲇鱼杂种的RAG2分子标记RFLP鉴定方法，其特征在于所述的RAG2基因片段特定引物，所扩增出的南方鲇的基因片段的核苷酸序列为SEQID NO:I。
5.根据权利要求3所述的水产养殖鲇鱼杂种的RAG2分子标记RFLP鉴定方法，其特征在于所述的RAG2基因片段特定引物，所扩增出的鲇的基因片段的核苷酸序列为SEQIDN0:2。
6.根据权利要求2所述的水产养殖鲇鱼杂种的RAG2分子标记RFLP鉴定方法，其特征在于所述的步骤C中，限制性内切酶Stu I的酶切步骤为使用PCR仪进行酶切，反应体系为15 uL, 5 uL RAG2-PCR扩增产物，加入I U L酶切反应缓冲液，0. 5 u L限制性核酸内切酶Stu I，酶切位点为AGG丨CCT，酶切反应参数为37°C、5飞min，酶的失活参数为80。。、10 11 min。
7.根据权利要求2所述的水产养殖鲇鱼杂种的RAG2分子标记RFLP鉴定方法，其特征在于所述的步骤C中，限制性内切酶ZAo I的酶切步骤为使用PCR仪进行酶切，反应体系为15 uL, 5 uL RAG2-PCR扩增产物，加入I U L酶切反应缓冲液，0. 5 u L限制性核酸内切酶Xho I，酶切位点为C丨TCGAG，酶切反应参数为37°C、5飞min，酶的失活参数为80°C、5 6 min。
全文摘要
本发明涉及鱼类杂种的鉴定方法，具体涉及水产养殖鲇鱼杂种的RAG2分子标记RFLP鉴定方法。本发明以南方鲇、鲇及其杂交子代为研究对象，在鲇属鱼类中筛选设计了RAG2基因片段作为分子标记，应用RAG2基因片段的RFLP分析，成功鉴定了南方鲇、鲇及其杂交子代。具有实验快捷，操作简便，鉴定直观，无需测序的优点。
文档编号C12Q1/68GK102758021SQ20121027824
公开日2012年10月31日 申请日期2012年8月7日 优先权日2012年8月7日
发明者宋昭彬, 张修月, 杨世勇, 郭睿 申请人:四川大学