专利名称：一种真菌发酵生产恩镰孢菌素类化合物的方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体公开了一种固体发酵生产恩镰孢菌素类化合物(Enniatins)的工艺。
背景技术：
恩镰孢菌素类化合物(Enniatins)是一类非典型的环肽化合物，结构颇为奇特，分子有3个D-2-羟基异戊酸(HylV)和3个N-甲基氨基酸交替地连接构成十八元环肽骨架，已报道的这类化合物大都是在Fasarium属真菌中找到，迄今为止人们发现了约10个这类化合物(其中EnniatinA，Al，Bl，B比较常见，其它还有Enniatin B2、B3、B4、E、F、G等)。[参见Tetrahedron 59(2003) :1015-1020]·
恩镰孢菌素类化合物(Enniatins)具有以下通式EnniatinA, Al, BI, B四种化合物中Rl、R2、R3的取代基分别为
ElR2RB
EnniatinA= -CH(CH3)CH2CH3 -CH(CH3)CH2CH3 -CH(CH3)CH2CH3
EnnIatinAi= -CH(CH3)CH2CH3 -CH(CH3)CH2CH3 -CH(CH3)2 EnniatinBl= -CH(CH3)2-CH(CH3)2-CH(CH3)CH2CH3
EnniatinB = ~CH(CH3)2柳 CH(CH3)2響 CH(CH3)2Enniatins类化合物有很好的抗菌、杀虫、植物毒素活性和胆固醇酰基转移酶(ACAT)抑制作用，近几年这一类化合物的抗HIV和选择性抗肿瘤活性都得到了很多的关注。[参见Toxicon 56(2010) :418-424]关于enniatins类抗生素的作用机制，目前认为enniatins是一类离子传导剂,能形成一价离子的“Sandiwich”络合物，穿过细胞膜，尤其是线粒体膜，阻断呼吸链上的氧化磷酸化反应。P. Zavge等认为十八元环状的骨架与一价离子的络合物的亲和カ是其支链骨架的100倍。它们的抗菌活性则是来源于这类物质对ー价钾离子或钠离子的高度选择性络
ム
ロ o1992年Tomoda等发现enniains有抑制脂酰辅酶A :胆固醇脂酰转移酶(Acyl-CoA cho lestero lacy I transferase ACAT)的活性，IC5tl = 22 110 U M。ACAT 在生物体内催化胆固醇3位羟基，由长链脂酰CoA将酰基导入生成胆固醇酷，在胆固醇代谢过程中起着重要作用；因此ACAT被认为是降低胆固醇和防治动脉硬化药物的靶酶。1997年，MaKee等发现enniatins有抗HIV病毒的作用，体外试验显示enniains B,B1和Al混合物的 anti_HIVEC50 = 0. 01 u g -mじ1, IC50 = I. 9 u g -mじ1,其中 enniain B 的 anti-HIV EC50 =·0.16 u M, IC50 = 0. 78 u M0Enniain G是林永成等从海洋真菌Halosarpheia sp.培养液中分离到的ー个新化合物，据初步的药理实验表明，新化合物enniain G具有抗肝癌Heps7402活性，ED5tl = 12 ii g mじ1。Dometshuber R.等报道了 enniains发挥p53依赖性抑制细胞生长，对人体的癌细胞和P53依赖的细胞毒活性[參见Toxicon 56(2010) :418-424]。目前国内外极少有关于enniatins生产的报道，仅有少量产品在实验室条件下获得，且主要是通过微生物菌种发酵产生，但是发酵水平普遍不高(0. lg/kg培养基)，而且没有提取纯化工艺方面的报道[參见J Agric Food Chem 40(1992) : 1976-1982]。因此提供ー种新的制备enniatins的方法是非常必要的。
发明内容
本发明提供了ー种利用铼孢菌属(Fusarium)真菌固体发酵生产恩铼孢菌素类化合物(Enniatins)的生产エ艺。本发明共涉及三方面的内容，即固体发酵培养、提取エ艺和纯化工艺。(I)固体发酵培养菌种铼孢菌属产恩铼孢菌素类化合物的任何真菌；培养基组成0 5重量份的氨基酸或蛋白胨、100 2000重量份的水、1000重量份的豆类，PH值为4 8。接种量按质量百分比，将生长好的菌种按1% 20%的比例接种；发酵培养条件于16 32°C,光照培养或暗培养或明暗交替培养,培养周期为4 24天。(2)提取エ艺采用I 30倍体积的有机溶剂提取，收集溶剂部分；回收溶剂后的干膏备用；将上述干膏溶散到体积比为20% 80%醇/水中，以0. 5 20倍体积的正已烷萃取，收集正已烷部位，回收溶剂，干燥备用；(3)纯化工艺以适当的溶剂溶解上述提取物后，采用无机基质为填料的色谱柱，以合适的流动相冲柱，收集高纯度的恩铼孢菌素洗脱部分，干燥后即可得到高纯度的恩铼孢菌素类化合物干粉。本发明的优点只需豆类、氨基酸或蛋白胨等简单培养基，繁殖周期4 24天，最終恩铼孢菌素类化合物的浓度可达2. Og/kg培养基，比当前文献报道的产率提高了近20倍，因此，具有成本低，繁埴周期短，提纯エ艺简单等优点[參见JAgric Food Chem40(1992) :1976-1982]。
图I本发明所获得的恩铼孢菌素化合物的ESI-MS图谱(示EnniainA，Al，Bl，B)；图2本发明所获得Enniain B的1H-NMR谱；图3本发明所获得的Enniain B的13C-NMR谱；图4本发明所获得的Enniain B的1H-1HCOSY谱；图5本发明所获得的Enniain BI的1H-NMR谱；图6本发明所获得的Enniain BI的13C-NMR谱；图7本发明所获得的Enniain BI的1H-1HCOSY谱；图8本发明所获得的Enniatin Al的1H-NMR谱；图9本发明所获得的Enniatin Al的13C-NMR谱；图10本发明所获得的Enniatin Al的1H-1HC0SY谱；图11本发明所获得的Enniatin A的1H-NMR谱；图12本发明所获得的Enniatin A的13C-NMR谱；图13本发明所获得的Enniatin A的1H-1HC0SY谱。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进ー步的说明，但本发明的技术方案并不限于如下实施例。实施例I铼孢菌属真菌三线铼刀菌(Fusarfumtricinctum)的纯化三线铼刀菌(Fusarfumtricinctum)购自中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号:CCTCC AF 93240菌种的纯化采用划线平板法，将保藏的原始菌种斜面用接种针接种到新鮮PDA平板上，在28°C下培养5-7d，挑出与记载中菌株表观特征描述相符的单菌落，传入两支PDA斜面，一支用于发酵培养和样品初筛，另ー支用于菌种的冷冻保藏。菌株特征在PDA培养基上，菌落乳白色，边缘整齐，两周后直径达到9cm，气生菌丝不发达，短绒状，菌丝浅色，分枝，偶有隔，光滑。分生孢子梗浅色，直立，无隔，偶瓶梗状，顶端鋭，简单，侧生，少有分枝，分生孢子顶生。分生孢子大小两型，大分生孢子浅色，光滑，弯曲，3-4隔有时分隔不清，有足细胞，24-35. 5 X 3. 5-4. 5 u m,小分生孢子浅色，不成链，光滑，0-1隔，梨形或棍棒形，4.5-13.5X1.5-3i!m。厚垣孢子浅色，球形，单生或成串，直径11. 5-13. 5 u nio符合三线铼刀菌(Fusarfumtricinctum)的菌株特征与特性。实施例2 250mL三角瓶的固体发酵三线铼刀菌(Fusarfumtricinctum)接种于斜面培养基上,25°C下培养5天。接着，斜面菌种接种于含IOOg大豆培养基的250mL三角瓶中，静止避光，25°C下培养10天。各种培养基配方如下斜面培养基(g/L):葡萄糖10，蛋白胨5，牛肉膏3，酵母膏l，pH7.0。大豆培养基大豆(soybean) 100g，加水lOOmL，静置4小时后，115°C灭菌30min。实施例330L固态发酵
生产
以三线铼刀菌(Fusarfumtricinctum)为出发菌株,菌种来源及斜面培养方式同实施例I。发酵參数发酵培养基装量为白豆(white bean) 10kg、水10L，发酵罐内直接通入蒸汽，辅助以特殊搅拌系统，达到在位高温灭菌的目的。接种量10%，搅拌均匀后，25°C发酵培养，罐压0. 05MPa,通气量0. 6 I. 2vvm,发酵时间8天。实施例4恩铼孢菌素类化合物的固态发酵生产以三线铼刀菌(Fusarfumtricinctum)为出发菌株,菌种来源及斜面培养方式同实施例I。发酵參数发酵培养基装量为白豆(white bean) 10kg、水8L，发酵罐内直接通入蒸汽，辅助以特殊搅拌系统，达到在位高温灭菌的目的；待温度达25°C吋，加入氨基酸适
量，搅拌均匀后，按10%接入菌株，搅拌均匀，25°C发酵培养，罐压0. 05MPa，通气量0. 6
I.2vvm,发酵时间8天。所说的氨基酸是L_缬氨酸(L-valine)、L-亮氨酸(L-leucine)或/和L-异亮氨酸(L-isoleucine),加入前以水溶解,并经0. 2 y m孔径的滤膜过滤。实施例5恩铼孢菌素类化合物的提取纯化以10倍体积的こ酸こ酯分2次振荡提取实施例I或实施例2的发酵物，减压回收后，将干膏以10倍体积的こ醇水=I I溶解分散后，以20倍体积的正已烷分2次液-液萃取，合并正已烷萃取液，回收溶剤，即得灰白色粉末状粗提物(恩铼孢菌素类化合物粗品)。将上述粗品，以甲醇按体积比I : I溶解，过RP-18反相色谱柱，以甲醇/水冲柱洗脱，分段收集，真空干燥或冷冻干燥，获得类白色粉末(恩铼孢菌素类化合物干粉)。实施例6恩铼孢菌素类化合物的纯化取实施4之恩铼孢菌素类化合物粗品，以甲醇按体积比I : I溶解，过半制备高效液相色谱柱，以70-80%甲醇/水冲柱洗脱，分段收集，真空干燥或冷冻干燥，获得类白色粉末(恩铼孢菌素类化合物干粉)。所获得的恩铼孢菌素类化合物中，EnniatinB约占43%, EnniatinBl约为37%,EnniatinAl 约占 12% , EnniatinA 约占 7% (W/W)。实施例7恩铼孢菌素类化合物(EnniatinA, Al, BI, B)的结构表征应用质谱、一維和ニ维核磁谱等对本发明所获得的恩铼孢菌素类化合物的结构进行表征，并与文献报道的数据进行比对[參见J Agric Food Chem 40(1992) =1976-1982],确证本发明所获得的4个主要恩铼孢菌素类化合物为EnniatinA，Al，BI, B，本发明所获得的恩铼孢菌素化合物(EnniatinA, Al, BI, B)的质谱图见图I ;本发明所获得的Enniatin B的 1H-NMR, 13C-NMR, il^HCOSY 谱见图 2-4 ;本发明所获得的 Enniatin BI 的 1H-NMR, 13C-NMR,1H-1HCOSY 谱见图 5-7 ;本发明所获得的 EnniatinAl 的 1H-NMR, 13C-NMR, 1H-1HCOSY 谱见图8-10 ;本发明所获得的 EnniatinA 的 1H-NMR, 13C-NMR, 1H-1HCOSY 谱见图 11-13。
权利要求
1.一种利用镰孢菌属(Fusarium)真菌固体发酵生产恩镰孢菌素类化合物(Enniatins)的方法,包括以下步骤 步骤一固体发酵培养 菌种镰孢菌属产恩镰孢菌素类化合物的真菌(可以是从其寄主中分离纯化得到，也可以从菌种保藏中心等机构获得)； 培养基组成0 5重量份的蛋白胨、500 1500重量份的水、1000重量份的大豆，PH值为5 8 ; 接种量将生长好的菌种按质量百分比1% 20%的比例接种； 普通发酵培养条件于16 32°C，光照培养或暗培养或明暗交替培养，培养周期为4 24天； 发酵罐中的条件罐压O. 05MPa，通气量O. 6 I. 2vvm，发酵时间5_10天； 步骤二 目标产物的分离纯化 发酵物的预处理采用I 30倍体积的乙酸乙酯提取，收集溶剂部分；回收溶剂后得干膏； 分离工艺将所得干膏溶散到体积比为20% 80%醇/水中，以O. 5 20倍体积的正已烷萃取，收集正已烷部位，回收溶剂，经干燥得灰白色粉末状粗提物； 纯化工艺以适当的溶剂溶解上述粗提物，采用无机基质为填料的色谱柱，以反相流动相冲柱，收集恩镰孢菌素洗脱部分，干燥后即得到恩镰孢菌素类化合物干粉。
2.根据权利要求I所述的利用镰孢菌属(Fusarium)真菌固体发酵生产恩镰孢菌素类化合物(Enniatins)的方法，其特征在于，培养基组成中的大豆可以是其它豆类或豆类的加工品，蛋白胨也可以替换为氨基酸。
3.如权利要求I所述的利用镰孢菌属(Fusarium)真菌固体发酵生产恩镰孢菌素类化合物(Enniatins)的方法，其特征在于，在分离工艺中，是将所得干膏溶散到醇/水(体积比I 1)中。
4.如权利要求I所述的利用镰孢菌属(Fusarium)真菌固体发酵生产恩镰孢菌素类化合物(Enniatins)的方法,其特征在于,所述的无机基质为填料的色谱柱是反相色谱柱。
5.根据权利要求I所述的利用镰孢菌属(Fusarium)真菌固体发酵生产恩镰孢菌素类化合物(Enn i at ins )的方法,其特征在于,所述的镰孢菌属产恩镰孢菌素类化合物的真菌是镰孢菌属真菌三线镰刀菌(Fusarfumtricinctum)。
6.根据权利要求5所述的利用镰孢菌属(Fusarium)真菌固体发酵生产恩镰孢菌素类化合物(Enniatins)的方法,其特征在于,所述的三线镰刀菌(Fusarfumtricinctum)购自中国典型培养物保藏中心，其菌株保藏编号为CCTCCAF 93240。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，具体公开了一种固体发酵生产恩镰孢菌素类化合物(Enniatins)的工艺。该方法以镰孢菌属(Fusarium)真菌为出发菌株，主要涉及发酵培养基的新配方、发酵条件控制及分离纯化工艺等步骤。通过本发明所述的方法，恩镰孢菌素类化合物在前期对数生长期内(10天)能迅速地获得目的产物，最终恩镰孢菌素类化合物的浓度可达2.0g／lkg培养基，具有极高的发酵效价；提取纯化工艺简单，质量可控，样品稳定好，通用性强，适合工业化生产。
文档编号C12P17/14GK102787148SQ20121027794
公开日2012年11月21日 申请日期2012年8月7日 优先权日2012年8月7日
发明者张勇慧, 汪建平 申请人:华中科技大学