专利名称：禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性基因型的分型检测方法
技术领域：
本发明属于一种禾谷镰孢菌多菌灵抗性菌株基因型的分子检测和SNP分型方法， 可用于苯并咪唑类杀菌剂(多菌灵)抗性禾谷镰孢菌的诊断和抗药性病原群体发展动态监 测，进行不同抗药性水平的小麦赤霉病流行预测；并且能够进行SNP分型，为抗药性治理提 供分子水平的理论依据。
背景技术：
小麦赤霉病是由禾谷镰孢菌Fusarium graminearum Schwabe引起的一种世界性 病害，严重影响小麦的产量和品质。长期以来采用苯并咪唑类杀菌剂或以这类药剂为主的 复配剂进行化学防治。苯并咪唑类杀菌剂作为一类高效、广谱内吸性杀菌剂在生产上应用， 解决了保护性杀菌剂的环境毒性问题，提高了人类控制该病害的能力。苯并咪唑类杀菌剂 包括多菌灵、苯菌灵、噻菌灵、硫菌灵等。这些杀菌剂具有相同的抗菌谱和抗菌机制，他们 也具有相同的抗药性机制，相互之间存在正交互抗药性。由于这类药剂的高度专化性，作 用位点单一，加上施用频率高，使用多年后许多植物病原真菌群体中就会出现抗药性优势 生理小种，使药剂防治完全失去效果。经过近几年的努力，南京农业大学杀菌剂实验室研 究发现小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性菌株主要是由于禾谷镰孢菌β 2-微管蛋白基因 (FGSG_06611. 3)突变造成，该基因编码第167位、198位、200位氨基酸密码子的突变均可引 起该菌对多菌灵抗性的产生。已知编码167位氨基酸密码子突变是病原菌产生田间抗药性 的主要原因，占所有突变类型总量的97%以上，表现中等水平抗药性；编码198位氨基酸密 码子突变约占抗药性基因型的0. 5%左右，变现高水平抗药性；编码200位氨基酸密码子突 变的抗药性水平与167位突变类似。发明人已经研究证明因病原菌在自然界的数量巨大，在禾谷镰孢菌群体中抗药性 个体的比例达到3% 5%和适宜发病的环境条件下，即可发生抗药性小麦赤霉病流行，使 药剂防治失败。传统的抗性检测方法是根据药剂不同剂量对菌丝生长的抑制效应来鉴别 的，耗时长，测定抗药性水平的工作量更大，无法早期预测抗药性病害流行。本发明在抗 药性机制研究的基础上，根据β 2-微管蛋白基因点突变类型与抗药性水平的相关性，应 用Tetra-primer ARMSPCR技术检测禾谷镰孢菌对多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的抗药性。 Tetra-primer ARMSPCR技术较等位基因特异性PCR更为准确，外引物作为阳性对照，内引 物能特异地扩增不同基因型产物。因此，本发明具有的突出优点是(1)准确性高。通过内 外两对引物扩增DNA特异性片段，可以防止可能的假阳性。⑵能够诊断抗药性菌株的基因 突变类型，判断抗药性水平，为抗性治理提供依据；(3)抗性检测耗时短，仅需6小时。
发明内容
技术问题本发明的目的在于提供一种禾谷镰孢菌多菌灵抗性菌株基因型的快速 诊断和分子检测方法。本发明是在研究禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性机制并已知存在三种基 因点突变类型的基础上，首次研发的Tetra-primer ARMS PCR技术。根据抗药性菌株可能的基因突变机制，使用三组引物快速、准确地检测小麦赤霉病菌多菌灵抗性亚群体，检测准确率达到95％0以上，对及时采取科学有效的措施控制当季抗药性病害流行，具有实用价值。[o005] 技术方案13 2一微管蛋白基因(FGSG一06611．3)作为禾谷镰孢菌抗多菌灵的检测基因，其编码第167位、第198位、第200位氨基酸的密码子发生点突变作为分子检测的依据(表1)。
禾谷镰孢菌多菌灵抗性基因型的分型检测方法共分三步
第二步运用三组引物对，进行PCR反应，获得三组PCR产物。
]于Teera-prim(c ARMS P(R技术检测的引物具有特异性，该引物对能对p，一微管蛋盾t 167位、。[98位、200位点突变进行特异性识别(表1)。
(二1)扩增禾谷镰孢菌p，一微管蛋白基因片断包含167位密码子的特异性引物对
F-(’ut 1675’ GACCAC(．FTCAGGGTTTCCAG(．FGACG(3’[OOl 2] R-c’ut 1675’ GATCGGCGTACGAAGGATCGGCGAT(．FT 3’
F-inl671’5’ GTTCCCCGATCGCATGATGGCCA(．TTT 3’[oo 1 4] R-i n 1 6 7A5’ GAAAC(‘FTGGGCGAGGGCATAACGGGAT 3’
F-c’ut 1985’ AG(．FCGTTGAGGAAGCCATTGATGTT 3’
R-(’ut 1985’ CATGTTAACAGCGAG(．TTTCGCAGAT 3’
F-inl98A5’ GAACCAG(‘FCGTCGAGAACTC‘FGCCA 3’
R-inl98G5’ GAGC(．FCGTTATCGATACAGAAGGTAT(3’
⑧扩增禾谷镰孢菌p，一微管蛋白基因片断包含200位密码子的特异性引物对
F-c’ut2005’ ACAAC．FGGGCCAAGGGTCATTACAC(3’
R-(’ut2005’ AAGTCGGGGGAACGGAATCATGTTAAC3’
F-in2001’5’ CCAG(．FCGTCGAGAA(TC．FGACGAGA(．FTT 3’
R-in200A5’ ‘FCGTACAGAGCC．FCGTTATCGATACGGT 3’
P(R反应体系及扩增程序
(1)包含167位密码子的基因片段扩增
P(R bui’fer(10X)2．5>I+
cINTP(2．5mMaCh)2>I+
Mg(l，(25mM)1．5>I+
F-c’utl67．／’R-(’utl67(10 u M)各o．2 u l
]了一inl67I’(10 u M)o．5>I+
R—inl67A(10 u M)o．8 u l
cIHo．O(灭菌蒸馏水)15．1>I+
Tac3(5U／’ L)o．2>I+
DNA模板2．O>I+
总体积25 1a i+
扩增条件
预变性94℃5min
J
变性94℃15s
退火66℃30s
延伸72℃30s
35个循环
J
延伸72℃5min
(2)包含198位密码子的基因片段扩增
反应体系
PCR buffer(10×)2．5 13 L
dN／P(2．5mM each)2 13 L
MgCl，(25mM)1．5 u L
F—outl98／R—outl98(10 13 M)各0．4 13 l
F—inl98A(10 13 M)0．15 u L
R—inl98G(10 13 M)0．4 13 l
dH，0(灭菌蒸馏水)15．45 u L
／aq(5u／13 L)0．2 13 L
DNA模板2．0 u L[0059]一一
总体积25 u L
扩增条件
预变性94℃5min
J
变性94℃15s
退火65℃30s
延伸72℃30s
35个循环
J
延伸72℃5min
(3)包含200位密码子的基因片段扩增
反应体系
PCR buffer(10×)2．5 13 L
dN／P(2．5mM each)2 13 L
MgCl，(25mM)1．5 u L
F—out200／R—out200(10 13 M)各0．8 13 l
F—in200T(10 13 M)0．5 13 L
R—in200A(10 13 M)0．5 13 l
dH20(灭菌蒸馏水)Taq (5U/ μ L)DNA 模坂_
14. 2μ L 0. 2μ L 2. 0μ L总体积扩增条件预变性94°C5minI变性94°C15s退火55°C30s延伸72°C30s35个循环I延伸72°C5min第三步将获得的PCR产物电泳，根据电泳图谱可以准确鉴定菌株基因型，并以此 判断菌株抗药性水平。有益效果本发明禾谷镰孢菌多菌灵抗性菌株基因型的分子检测和SNP分型方法， 与现有技术相比1.目前国内外研究单位均采用菌丝生长法检测禾谷镰孢菌抗药性，但该方法涉及 采样、分离培养需要3 5天和室内大量的药剂敏感性测定实验至少要6天，周期较长。同 时每个菌株需要在包括对照在内的6个系列药剂浓度处理下进行测定和统计分析，才能判 断其抗药性水平。此外，还会因工作量过大或药剂配置误差等原因造成准确性下降。目前 尚未有成熟的抗多菌灵小麦赤霉病菌分子检测技术应用。因此，Tetra-primer ARMS PCR技 术的研究应用填补了这一空白，能够在发病前期进行检测，为及时采取合理的防治策略赢 得时间。2.由于测定菌株抗药性水平的工作量过大，传统的抗药性检测方法常用鉴别剂量 进行检测。这种方法只能区分抗药性菌株和敏感菌株，不能确定抗药性水平，更无法知道其 抗药性突变的基因型。本发明对位于β2-微管蛋白基因第167位、第198位、第200位密 码子进行SNP分型，能够准确诊断抗药性突变的类型和判断抗药性水平，为科学采用抗药 性治理技术提供理论依据。
四
图ITetra-primerARMS-PCR检测β 2_微管蛋白基因第167位密码子点突变基因 型的电泳2Tetra-primerARMS-PCR检测β 2_微管蛋白基因第198位密码子点突变基因 型的电泳3Tetra-primerARMS-PCR检测β 2_微管蛋白基因第200位密码子点突变基因 型的电泳图五、具体实施案例
实施例1、检测第167位密码子发生点突变的基因型菌株(167位)提取菌株ZF-43，ZF-21，ZF-52，R9基因组DNA，用扩增禾谷镰孢菌β 2-微管蛋白 基因包含167位密码子DNA片段的特异性引物扩增对F-outl67 5' GACCACCTTCAGGGTTTCCAGCTGACGC 3'R-out167 5' GATCGGCGTACGAAGGATCGGCGATCTT 3'F-inl67T 5' GTTCCCCGATCGCATGATGGCCACTTT 3'R-inl67A 5' GAAACCTTGGGCGAGGGCATAACGGGAT 3'25 μ 1 PCR 体系中含 DNA 模板2μ 1，2· 5μ 1 10 X buffer, 2 μ 1 dNTP (2. 5mM each), 1. 5μ 1 MgC12 (25mM), F-outl67/R-outl67 (10 μ Μ)各 0. 2 μ 1，F_inl67T (10 μ Μ) 0. 5 μ 1， R-inl67A(10yM)0. 8μ 1, TaqDNA 聚合酶 1U(大连宝生物，Takara)。反应在 PTC-200(Bio-rad,Inc.)上进行，反应条件-MV 5min ；94°C 15s，66°C 30s, 72°C 30s，35 个 循环；72°C5min;4°C保存。取8μ1 PCR产物于2%琼脂糖TBE胶上电泳，紫外观察拍照得 到电泳图谱(图1)。检测结果与预期一致，所有菌株都得到一条292bp的参照片段，敏感菌株(ZF-43， ZF-21)扩增得到一条201bp特异性片段，中抗菌株(ZF-52，R9)扩增得到一条146bp的特 异性片段。实施例2、检测第198位密码子发生点突变的基因型菌株(198位)提取菌株ZF43，ZF-21，J2，ZF43-6基因组DNA，用扩增禾谷镰孢菌β 2-微管蛋白 基因包含198位密码子DNA片段的特异性引物扩增对F-OUt198 5' AGCTCGTTGAGGAAGCCATTGATGTT 3'R-out198 5' CATGTTAACAGCGAGCTTTCGCAGAT 3'F-inl98A 5' GAACCAGCTCGTCGAGAACTCTGCCA 3'R-inl98G 5' GAGCCTCGTTATCGATACAGAAGGTATC 3'25 μ 1 PCR 体系中含 DNA 模板2μ 1，2· 5μ 1 10 X buffer, 2 μ 1 dNTP (2. 5mM each), 1. 5μ 1 MgC12(25mM), F_outl98/R-outl98 (10 μ Μ)各 0.4 μ 1，F_inl98A (10 μ Μ) 0· 15 μ 1， R-inl98G0. 4 μ 1，TaqDNA 聚合酶 IU (大连宝生物，Takara)。反应在 PTC-200 (Bio-rad，Inc.) 上进行，反应条件94°C 5min ；94°C 15s，65°C 30s, 72°C 30s，35 个循环；72°C 5min ;4°C保 存。取8μ1 PCR产物于2%琼脂糖TBE胶上电泳，紫外观察拍照得到电泳图谱(图2)。检测结果与预期一致，所有菌株都得到一条440bp的参照片段，敏感菌株(ZF-43， ZF-21)扩增得到一条288bp特异性片段，高抗菌株(J2，ZF43-6)扩增得到一条206bp的特 异性片段。实施例3、检测第200位密码子发生点突变的基因型菌株(200位)提取菌株ZF43，ZF-21，NT_7，tl基因组DNA，用扩增禾谷镰孢菌β 2-微管蛋白基 因包含200位密码子的DNA片段特异性引物扩增对F-out200 5' ACAACTGGGCCAAGGGTCATTACACC 3'R-out200 5' AAGTCGGGGGAACGGAATCATGTTAAC 3'F-in200T 5' CCAGCTCGTCGAGAACTCTGACGAGACTTT 3'R-in200A 5' TCGTACAGAGCCTCGTTATCGATACGGT 3'25 μ 1 PCR 体系中含 DNA 模板2μ 1，2· 5μ 1 10 X buffer, 2 μ 1 dNTP (2. 5mM each),1. 5 μ 1 MgCl2 (25mM)，F-out200/R-out200 (10 μ Μ)各 0· 8 μ 1，F_in200T/R-in200A (10 μ Μ) 各 0.5μ1，TaqDNA 聚合酶 IU (大连宝生物，Takara)。反应在 PTC-200 (Bio_rad，Inc.)上 进行，反应条件94°C 5min ；94°C 15s，55°C 30s, 72°C 30s, 35 个循环；72°C 5min ；4°C保存。 取8μ1 PCR产物于2%琼脂糖TBE胶上电泳，紫外观察拍照得到电泳图谱(图3)。检测结果与预期一致，所有菌株都得到一条494bp的参照片段，敏感菌株(ZF-43， ZF-21)扩增得到一条221bp特异性片段，中抗菌株(NT-7，tl)扩增得到一条331bp的特异 性片段。表1禾谷镰孢菌来源、对多菌灵抗性表型及抗药性表型与基因型的关系
对多菌灵的敏感性菌株名称菌株来源165166密码子位点 167 198199200敏感(mbcs)zf-43,zf-21浙江省gccacctttgagaccttc中抗(mbcmr)zf-52,r9浙江省gccacc10tgagaccttc中抗(mbcmr)nt-7,tl江苏省GCCACCTTTGAGACC调C26]高抗(MBChr)J2, zf-43-6* 江苏省GCCACCTTT|a|agACCTTC *ZF-43_6为诱导抗性菌株。
权利要求
禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)多菌灵抗性菌株基因型的分子检测和分型方法，其特征在于采用Tetra primer ARMS PCR(Tetra primer Amplification Refractory Mutation System PCR)技术快速、准确地检测出田间具有多菌灵抗性基因的抗药性禾谷镰孢菌菌株，并对抗药性基因进行SNP分型。禾谷镰孢菌具有抗多菌灵基因的菌株检测方法，共分三步第一步采用常规的苯酚·氯仿·异戊醇法，分别提取待测样品的核基因组DNA。第二步运用三组引物对，进行PCR反应，获得三组PCR产物。PCR反应体系及扩增程序(1)氨基酸167位扩增反应体系PCR buffer(10×)2.5μLdNTP(2.5mM each)2μLMgCl2(25mM) 1.5μLF out167/R out167(10μM)各0.2μlF in167T(10μM) 0.5μLR in167A(10μM) 0.8μldH2O(灭菌蒸馏水)15.1μLTaq(5U/μL) 0.2μLDNA模板 2.0μL 总体积 25μL扩增条件预变性94℃5min ↓变性94℃ 15s退火66℃ 30s延伸72℃ 30s35个循环 ↓延伸72℃ 5min(2)氨基酸198位扩增反应体系PCR buffer(10×)2.5μLdNTP(2.5mM each)2μLMgCl2(25mM) 1.5μLF out198/R out198(10μM)各0.4μlF in198A(10μM) 0.15μLR in198G(10μM) 0.4μldH2O(灭菌蒸馏水)15.45μLTaq(5U/μL) 0.2μLDNA模板 2.0μL 总体积 25μL扩增条件预变性94℃5min ↓变性94℃ 15s退火65℃ 30s延伸72℃ 30s35个循环 ↓延伸72℃ 5min(3)氨基酸200位扩增反应体系PCR buffer(10×) 2.5μLdNTP(2.5mM each) 2μLMgCl2(25mM)1.5μLF out200/R out200(10μM) 各0.8μlF in200T(10μM)0.5μLR in200A(10μM)0.5μldH2O(灭菌蒸馏水) 14.2μLTaq(5U/μL)0.2μLDNA模板2.0μL 总体积 25μL扩增条件预变性94℃5min ↓变性94℃ 15s退火55℃30s延伸72℃30s35个循环↓延伸72℃5min第三步将获得的PCR产物电泳，根据电泳图谱可以准确鉴定菌株基因型，并以此判断菌株抗药性水平。
2. 5μ L 2μ L 1. 5μ L 各 0· 4μ 1 0. 15 μ L 0. 4μ 1 15. 45 μ LTaq (5U/ μ L)0. 2 μ LDNA 模板2. 0 μ L总体积25 μ L扩增条件预变性94°C 5min变性94°C15s退火65°C30s延伸72°C30s 35个循环延伸72°C 5min (3)氨基酸200位扩增 反应体系PCR buffer (IOX)2. 5 μ LdNTP(2. 5mM each)2 μ LMgCl2 (25mM)1. 5μ LF-out200/R-out200(10μ Μ) 各 0. 8 μ 1F-in200T(10yM)0. 5 μ LR-in200A(10yM)0. 5 μ 1dH20(灭菌蒸馏水)14. 2yLTaq (5U/ μ L)0. 2 μ LDNA 模板2. 0 μ L总体积25 μ L扩增条件预变性94°C 5min变性94°C 退火55°C 延伸72°C 35个循环I延伸72°C 5min第三步将获得的PCR产物电泳，根据电泳图谱可以准确鉴定菌株基因型，并以此判断 菌株抗药性水平。2.根据权利要求1，禾谷镰孢菌群体中多菌灵抗性菌株基因型的分子检测和SNP分型 方法其特征在于用于Tetra-primer ARMS PCR技术检测的引物具有特异性，该引物特异性识别β 2-微管蛋白第167位、第198位、第200位密码子发生的点突变①扩增禾谷镰孢菌β2-微管蛋白基因片断167位特异性引物对 F-out167 5' GACCACCTTCAGGGTTTCCAGCTGACGC 3'R-out167 5' GATCGGCGTACGAAGGATCGGCGATCTT 3' F-inl67T 5' GTTCCCCGATCGCATGATGGCCACTTT 3' R-inl67A 5' GAAACCTTGGGCGAGGGCATAACGGGAT 3'②扩增禾谷镰孢菌β2-微管蛋白基因片断198位特异性引物对 F-out198 5' AGCTCGTTGAGGAAGCCATTGATGTT 3'R-out198 5' CATGTTAACAGCGAGCTTTCGCAGAT 3' F-inl98A 5' GAACCAGCTCGTCGAGAACTCTGCCA 3' R-inl98G 5' GAGCCTCGTTATCGATACAGAAGGTATC 3'③扩增禾谷镰孢菌β2-微管蛋白基因片断200位特异性引物对 F-out200 5' ACAACTGGGCCAAGGGTCATTACACC 3' R-out200 5' AAGTCGGGGGAACGGAATCATGTTAAC 3' F-in200T 5' CCAGCTCGTCGAGAACTCTGACGAGACTTT 3' R-in200A 5' TCGTACAGAGCCTCGTTATCGATACGGT 3'
全文摘要
本发明属于禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)多菌灵抗性基因型的分子检测和SNP分型方法，可用于引起小麦赤霉病的禾谷镰孢菌对多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂抗药性监测及抗药性基因型诊断。该检测方法共分3个主要步骤，(1)提取待测菌株的核基因组DNA；(2)运用三组引物对，进行PCR反应；(3)根据PCR产物电泳图谱鉴定菌株对多菌灵抗性的基因型。采用Tetra-primer ARMS PCR(Tetra-primer amplification refractory mutation system-PCR)技术可以快速、准确地检测出禾谷镰孢菌抗药性菌株及其基因型，并以此判断抗药性水平。检测准确率达95％以上。
文档编号C12Q1/04GK101988122SQ20101024707
公开日2011年3月23日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者周明国, 王建新, 罗卿权, 陈长军 申请人:南京农业大学