利用大肠杆菌表达系统制备重组人神经生长因子的方法

专利名称：利用大肠杆菌表达系统制备重组人神经生长因子的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用大肠杆菌表达系统制备重组人神经生长因子的方法，属于生物医药技术领域。
背景技术：
神经生长因子(Nerve Growth Factor, NGF)是最早发现和最典型的神经营养因子，同时也是神经系统中最重要的生物活性分子之一。它由α、β、Y三个亚基组成,其中β亚基(β-NGF)是唯一具有生物学活性的亚基，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。目前β-NGF已被开发成治疗外周神经损伤的药物应用于临床，广泛应用于神经损伤、偏瘫、卒中、颅脑损伤、小儿脑瘫等神经性疾病领域。但商品化的NGF为鼠源性的神经生长因子(mNGF)。这类动物源性的蛋白制品常常具有较高的免疫原性，容易引起人体内的抗原反应，严重者甚至会危及生命。而天然的人神经生长因子(hNGF)分布于人体的脑、神经节、虹膜、心脏、脾、胎盘等组织，原料有限，且其中hNGF含量低，分离纯化极其困难，无法直接提取获得。利用基因工程技术制备重组人神经生长因子是解决上述问题的一个主要途径。在各大表达系统中，大肠杆菌表达系统因其表达水平高、生产成本低、便于工业化生产等优势成为制备重组人神经生长因子的首选。可是，部分真核基因在大肠杆菌表达系统中表达量极低，甚至不表达，原因在于真核生物和原核生物所偏好的密码子不一样。此夕卜，大肠杆菌缺少真核生物蛋白质合成后的加工修饰系统，因此，表达的蛋白常常无生物学活性。研究者们发现，人β-NGF在大肠杆菌中的表达量不高，而且生物活性极低，经分析主要是由于β -NGF基因及其蛋白特殊的结构导致其难于在大肠杆菌系统中有效表达。一方面β-NGF基因中使用了较多的大肠杆菌稀有密码子，导致β-NGF基因在大肠杆菌中表达量不高。另一方面β-NGF蛋白结构特殊，难于在缺乏翻译后加工修饰系统的大肠杆菌中形成正确的结构，致使表达出的β -NGF蛋白生物活性极低，甚至没有活性。天然的β -NGF是由两条118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体，其中每条单链内含有由6个半胱氨酸相互配对形成的3对二硫键，这3对二硫键构成神经营养因子家族典型的
结构模式-“胱氨酸结”模式(the cystine knot),即两个二硫键桥(Cys58_Cysl08和
Cys68-Cysll0)形成一个含有14个残基的环(loop), Cysl5和Cys80穿过这个环形成第三个二硫键桥。这种特殊结构模式在神经营养因子家族中高度保守，对维持β-NGF的正常生物学功能至关重要。大肠杆菌表达系统表达的β-NGF往往由于上述6个半胱氨酸不能正确配对，形成上述“胱氨酸结”结构，即不能形成正确的蛋白结构导致其生物活性极低。针对上述问题，通用的做法是对需表达的基因进行密码子优化，同时构建分子伴侣与目标蛋白的融合蛋白，通过分子伴侣帮助目标蛋白体外折叠成为正确的结构。针对基因进行密码子优化，需考虑大肠杆菌密码子偏好性，还应考虑基因序列及其转录的mRNA序列结构、稳定性以及核糖体结合序列的结合效率等因素，是一项复杂、技术难度较高的工作。融合蛋白的构建，分子伴侣的选择是关键。为了改善β-NGF的折叠及复性效率，部分研究者构建了硫氧还蛋白及二硫键形成蛋白与β-NGF的融合蛋白。例如HE Ling-bing 等(HE Ling-bing, WANG Yanz, WANG Ge, CHEN Chao, and CAO Shu-gui,Expression and Purification of Active Recombinant Human Nerve Growth Factorfrom Escherichiu coli. CHEM. RES. CHINESEU，2007 年，Vol. 23，No. 2)将硫氧还蛋白及组氨酸标签蛋白与hNGF β亚基融合，利用对标签蛋白特异吸附的亲和层析来分离纯化β -NGF,同时利用硫氧还蛋白来帮助β -NGF以可溶性表达的方式进行表达，但原核细胞较小，只有当表达量较小时，蛋白才能以可溶性方式存在，当外源蛋白大量表达时，绝大多数的蛋白仍然会聚集变性；孙卫国等(孙卫国，刘农乐，丁红梅，陈留存，赵强，徐华，沈倍奋，邵宁生，重组人神经生长因子β亚基的原核融合表达及其活性研究.生物技术通讯，2009 年，Vol. 20, No. 4)将二硫键形成蛋白家族(Dsb)中的DsbA、DsbC蛋白及硫氧还蛋白(Trx)为融合分子，与hNGF β亚基在原核表达系统进打融合表达，虽然_■硫键形成蛋白能辅助β -NGF体外复性，但不能识别β -NGF的3对二硫键准确位置，因此也很难达到理想的复性效果，且该研究的终产物携带有标签蛋白，与天然β-NGF不一致，无法用于药物生产。因此，本领域中迫切需要开发以低成本、高产率及高活性为目的制备重组人神经生长因子的方法。所述的制备包括对人神经生长因子进行的基因修饰、分子伴侣的融合表达以及重组蛋白的分离、纯化。

发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供了一种重组人神经生长因子β亚基基因，其含有6组氨酸纯化位点、肠激酶切割位点以及经过修饰的人神经生长因子β亚基成熟肽段基因和分子伴侣基因，其中所述人神经生长因子β亚基成熟肽段基因为经过原核生物高频密码子改造后的基因，其碱基序列如SEQ ID NO :1所示；所述分子伴侣基因为经过修饰的人神经生长因子β亚基前导肽基因，其碱基序列如SEQ ID Ν0:2所示。本发明的目的之二在于提供了利用大肠杆菌表达系统制备重组人神经生长因子的方法。根据本发明的一方面，经修饰的人神经生长因子β亚基成熟肽基因的碱基序列如 SEQ ID NO 1 所示(共 357bp)。该序列中的碱基序列是进行了密码子改造的序列，其密码子是大肠杆菌表达系统的高频密码子，能在不改变氨基酸序列的前提下，最大限度的提高目的基因的表达量。根据本发明的另一方面，经修饰的作为分子伴侣的前导肽基因的碱基序列如SEQID NO 2 所示(共 309bp)。该序列位于本发明的人神经生长因子β亚基成熟肽基因序列上游，两序列由肠激酶切割位点(GATGATGATGATAAA)连接。该分子伴侣可帮助以包涵体形式表达的人神经生长因子β亚基在体外形成正确的构象，并且能在复性后通过肠激酶的切割去除，从而释放出与天然β -NGF氨基酸序列完全一致的，且具有较高生物学活性的成熟肽。本发明所述的利用大肠杆菌表达系统制备重组人神经生长因子(rhi3NGF)的方法包括下述步骤(I)利用化学合成法合成经原核生物高频密码子改造后的人神经生长因子β亚基成熟肽段基因及分子伴侣基因，并将其克隆入pET28a(+)表达载体，得到重组表达载体；
(I. D将上述基因片段用BamHI和XhoI限制性内切酶双酶切后插入原核表达质粒pET28a(+)的 BamHI (846)和 XhoI (159)位点(参见 Novagen 公司质粒图谱)；
(I. 2)获得重组表达载体pET28a(+) + [rhi3 NGF]，经PCR与酶切鉴定插入正确后，测序验证其序列正确性；
(2)将步骤(I)所得重组表达载体导入大肠杆菌株BL21UDE3)中，构建含有重组表达载体的基因工程菌；
(3)培养步骤(2)所得基因工程菌至A550=0.6时，加入诱导剂IPTG，诱导重组人神经生长因子rh β NGF在该基因工程菌中表达；
(4)离心收集菌体，重悬菌体，_80°C冻存；
(5)解冻菌体重悬液，破碎菌体，分离纯化包涵体蛋白(洗涤分离包涵体，8M尿素溶解包涵体蛋白)；
(6)体外复性包涵体蛋白，透析后超滤浓缩；
(7)经肠激酶切割去除分子伴侣；
(8)纯化获得所述重组人神经生长因子。优选地，其中所述步骤(3)中诱导的时间为3-4小时。优选地，其中所述步骤(3)中诱导剂IPTG的浓度为lmmol/L。优选地，其中所述步骤(4)中的重悬液为20mM Tris-HCl (ρΗ8· O)，使用量为菌体湿重的20倍体积。优选地，其中所述步骤(5)中破碎菌体的方法为超声破碎法，其中超声破碎菌体所用功率为400W，超声15秒，间隔15秒，作用30分钟。优选地，其中所述步骤出)中复性包涵体蛋白的方法为体外稀释复性法，其中体外稀释复性液中，精氨酸的浓度范围是O. 75-1. Ommol/L, pH值是8. 0-9. 5。优选地，其中所述步骤(6)使用的体外稀释复性液中精氨酸的浓度为O. 75mM, pH值为9. 5 ;氧化还原体系-还原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽(GSH-GSSG)浓度为O. 5mMGSSG-5mM GSH，复性时间为3小时；透析液为50 mM Tris-HCl缓冲液。优选地，其中所述步骤(7)中的肠激酶为带6组氨酸纯化位点的重组牛肠激酶。优选地，其中所述步骤(7)中的肠激酶作用温度为21°C，作用时间为16h ；
优选地，其中所述步骤(8)中纯化的方法为镍柱亲和层析法。优选地，其中所述步骤(8)中镍柱亲和层析的填料为Ni Sepharose Fast Flow,层析过程中使用含50 mM咪唑-O. 5 M NaCl-20mMTris-HCl (pH8. O)的缓冲液平衡层析柱，上样过程中收集的流穿峰为含rh β NGF的组分，经透析和超滤浓缩得到纯度大于99%，生物比活性高于500000AU/mg的重组人神经生长因子。本发明对β-NGF基因进行了分析，根据大肠杆菌对同义密码选择的偏好性，在消除了稀有密码子、不稳定序列，优选了最佳密码子的基础上，对β-NGF基因进行了重新设 计，从而最大限度提高了 β-NGF在大肠杆菌中的表达量。本发明根据天然β-NGF的结构特点，选择了 β-NGF的前导肽作为其分子伴侣，此肽段能有效识别天然β-NGF中的二硫键形成位点，并能使其在正确位置形成二硫键，从而保证β -NGF的正确折叠和复性。此外，为方便目的蛋白的分离纯化及保证终产物的单一性，本发明在前导肽上游引入了 6组氨酸纯化位点，在前导肽与成熟肽之间设计了肠激酶切割位点。该设计方案使表达产物可通过亲和层析分离纯化，操作便捷，且纯化效率高，同时通过肠激酶切割可释放出与天然β-NGF氨基酸序列完全一致的，且具有较高生物学活性的目的蛋白。本发明通过对人神经生长因子β亚基前导肽及成熟肽段基因进行原核生物高频密码子改造后，在大肠杆菌表达菌株BL21UDE3)中获得了 rhi3 NGF的高效表达。借助前导肽的分子伴侣功能，以包涵体形式表达的rh β NGF可在体外高效复性，复性后的rh β NGF经肠激酶切割可释放出rh β NGF成熟肽，经镍柱亲和层析可获得纯度大于99%，生物比活性高于500000AU/mg的重组人神经生长因子，该制备方法简便易行，便于实施。


图I为IPTG诱导浓度对蛋白表达影响的SDS-PAGE图，其中I为标准分子量蛋白； 2为BL21空菌；3为未加IPTG的工程菌；4为IPTG浓度O. I mmol/L ；5为IPTG浓度O. 5mmol/L ；6 为 IPTG 浓度 I. O mol/L ；7 为 IPTG 浓度 I. 5 mmol/L ；8 为 IPTG 浓度 2. O mmol/L ;9 为 IPTG 浓度 3. O mmol/L ；10 为 IPTG 浓度 4. O mmol/L ;11 为 IPTG 浓度 5. O mmol/L ；
图2为诱导时间对蛋白表达影响的SDS-PAGE图，其中I为标准分子量蛋白；2为BL21空菌；3为未加IPTG的工程菌；4为诱导O小时；5为诱导2小时；6为诱导4小时；7为诱导6小时；8为诱导8小时；9为诱导12小时；
图3为培养液pH值对蛋白表达影响的SDS-PAGE图，其中I为标准分子量蛋白；2为BL21 空菌；3 为未加 IPTG 的工程菌；4 为 pH=5. O ;5 为 pH=5. 5 ;6 为 pH=6. O ;7 为 pH=6. 5 ；8为 ρΗ=7· O ;9 为 ρΗ=7· 5 ;10 为 ρΗ=8· O ；
图4为本发明获得的包涵体蛋白SDS-PAGE图，其中M为标准分子量蛋白，包涵体蛋白分子量大小为32kDa ；
图5为本发明获得的包涵体蛋白Western blot图,其中M为标准分子量蛋白，包涵体蛋白分子量大小为32kDa ；
图6为本发明获得的复性后的融合蛋白及经肠激酶切割后的目的蛋白SDS-PAGE图，其中M为标准分子量蛋白，I泳道为复性后的融合蛋白，分子量大小为32kDa ；2泳道为经肠激酶切割后的目的蛋白，分子量大小为13. 2kDa；
图7为本发明获得纯化的目的蛋白SDS-PAGE图，其中M为标准分子量蛋白，纯化的目的蛋白分子量大小为13. 2kDa ；
图8为本发明获得纯化的目的蛋白Western blot图，其中M为标准分子量蛋白，纯化的目的蛋白分子量大小为13. 2kDa。
具体实施例方式应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。在本说明书中，除非特别指明，否则所用技术术语为本领域中的普通技术人员常用术语；本说明书中未注明具体条件的实验方法是按常规实验方法；本说明书中所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品，各种试剂和培养基的成分和配制方法可参见常规实验手册中的操作。实施例I :获得表达经修饰的人神经生长因子β亚基的基因工程菌
I.参照原核生物偏爱密码子表，在不改变氨基酸序列的前提下，对天然人神经生长因子β亚基前导肽和成熟肽的碱基序列进行了修饰，并在两序列间设计了肠激酶切割位点，通过化学合成的方式合成了该序列(碱基序列如SEQ ID NO :3所示，其表达的氨基酸序列如 SEQ ID NO 4 所示)
该序列中的碱基形成的密码子全部为大肠杆菌表达系统的高频密码子，能在不改变氨基酸序列的前提下，最大限度地提高目的基因的表达量。序列中5 ’端GGATCC和3 ’端CTCGAG分别为BamHI和XhoI限制性内切酶位点，可方便目的基因插入pET28a(+)原核表达载体。 其中GATGATGATGATAAA为肠激酶切割位点。肠激酶是一种丝氨酸蛋白酶，它能特异性地识别肽链中N-Asp- Asp- Asp- Asp-Lys-C五个氨基酸残基,切割点在Lys的羧基端，因此切割下来的目的蛋白在氨基端无额外氨基酸，从而使目的蛋白的氨基酸序列与天然蛋白完全一致。肠激酶还具有识别特异性强，切割效率高，反应条件温和等优点。本发明中，肠激酶切割位点上游为人神经生长因子β亚基前导肽基因序列，该序列在天然β-NGF表达过程中充当了分子伴侣的角色，在β-NGF的翻译后修饰过程中能帮助成熟肽折叠形成具有生物学活性的空间构象，并能在成熟肽转运至胞外前被切割去除。本发明在设计原核表达的rhi3 NGF基因序列时保留了其前导肽序列，有利于以包涵体形式表达的融合蛋白在体外形成具有生物学活性的正确构象。同时通过肠激酶的切割可将复性后的rh β NGF与前导肽准确分离，从而释放具有高生物学活性的rh β NGF。该序列被克隆到pET28a(+)表达载体多克隆位点区的BamHI (846)和XhoI (159)位点，利用载体的T7启动子启动基因的表达，起始密码子ATG位于载体294位，其下游有一载体自带的6组氨酸纯化位点(具体可参见Novagen公司的质粒图谱)。组氨酸能提供配位电子和一些金属离子如Ni2+螯合，6个组氨酸能使蛋白吸附于含金属如Ni2+的层析填料上，因此可以利用金属螯合层析来纯化目的蛋白。2. rh PNGF基因工程菌的构建
用于构建的载体pET28a(+)，宿主菌DH5a和BL21UDE3)均购于Novagen公司，BamHI和XhoI酶购于宝生物工程(大连)有限公司。2. I rh β NGF基因插入pET28a(+)质粒将化学合成的人神经生长因子β亚基基因片段用BamHI、XhoI双酶切后通过Τ4 DNA连接酶连接到同样经酶切的pET28a(+)表达载体上，构建pET28a(+) + [rhβNGF]重组表达载体，转化大肠杆菌克隆菌株DH5 α，在含有50μδ/πι1卡那霉素(Kana)的LB培养基上37°C培养筛选重组子，经PCR与酶切鉴定正确后，测序验证其序列正确性。2.2将上述鉴定正确的pET28a(+) + [rhβNGF]重组表达载体从克隆菌DH5α中提取出来，转化大肠杆菌表达菌株BL21 ( λ DE3)感受态，在含有5(^g/ml卡那霉素的LB培养基上37°C培养筛选重组子，此时获得重组子为rhi3NGF基因工程菌。实施例2 rh β NGF基因工程菌的诱导条件的筛选
将甘油管冻存的重组工程菌按O. 2%接种于新鲜LB抗性培养基(含Kana 5(^g/ml)，37°C，220rpm振荡培养过夜，活化工程菌。I、IPTG浓度对蛋白表达的影响将活化的工程菌分别接种于2ml LB抗性培养基(含Kana 5(^g/ml)中，37°C，220rpm振荡培养至A550=0. 6时加入IPTG，使其终浓度分别为O. I mmol/L、0. 5 mmol/LU. O mmol/L、1.5 mmol/L、2. O mmol/L、3. 0 mmol /1,.4. 0 mmol/L、5. 0 mmol/L,诱导培养 3 小时后离心取沉淀，用O. 5ml,20mmol/L Tris-HCl (pH8. O)重悬菌体，_80°C反复冻融三次，离心取沉淀用O. Iml蛋白电泳上样缓冲液重悬后进行SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE电泳扫描后，经凝胶成像系统分析，确定目的蛋白占总蛋白的比例。实验结果表明(图1)，IPTG 浓度在 O. I mM、0.5 mMU. O mM、1.5 mM、2. O mM、3. OmM、4. 0 mM、5. 0 mM的条件下， 目的蛋白占总蛋白的比例分别为31. 46%、35. 23%、40. 78%、40. 82%%,41. 33%,40. 95%,41. 25%,40. 66%。说明在 IPTG 浓度小于 I. O mM 时，目的蛋白占总蛋白比例随IPTG浓度的升高而上升，当IPTG浓度大于1.0 mM时，目的蛋白占总蛋白比例不再随IPTG浓度升高而显著上升，因此确立I. O mM为诱导的最佳IPTG浓度。2、诱导时间对蛋白表达的影响
将活化的工程菌接种于IOml LB抗性培养基(含Kana 5(^g/ml)，37°C，220rpm振荡培养至A550=0. 6时加入I. O mM IPTG，分别于诱导培养的O小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时取Iml菌液,离心取沉淀,用O. 5ml, 20mmoI /L Tris-HCl (pH8. O)重悬菌体，_80°C反复冻融三次，离心取沉淀用O. Iml蛋白电泳上样缓冲液重悬后进行SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE电泳扫描后，经凝胶成像系统分析，确定目的蛋白占总蛋白的比例。实验结果表明(图2)，诱导时间O小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时的条件下，目的蛋白占总蛋白的比例分别为I. 25%,36. 74%,39. 87%,38. 62%,37. 55%,33. 33%。说明诱导时间为4小时左右，目的蛋白占总蛋白比例最高，因此确立3. 5小时为最佳诱导时间。3、培养液pH值对蛋白表达的影响
在 pH 分别为 5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. O 的 2ml LB 抗性培养基(含 Kana 50μδ/ml)中接种活化的工程菌，37°C，220rpm振荡培养至A550=0. 6时加入1.0 mM IPTG，诱导培养3. 5小时后离心取沉淀，用O. 5ml,20mmol/L Tris-HCl (pH8. O)重悬菌体，_80°C反复冻融三次，离心取沉淀用O. Iml蛋白电泳上样缓冲液重悬后进行SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE电泳扫描后，经凝胶成像系统分析，确定目的蛋白占总蛋白的比例。实验结果表明(图3)，pH值分别为5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. O的条件下，目的蛋白占总蛋白的比例分别为 12. 5%,20. 36%,25. 78%,34. 33%,39. 49%,32. 61%,31. 55%。在pH值小于7. O时，目的蛋白占总蛋白比例随pH升高而上升，当pH值大于7. O时，目的蛋白占总蛋白比例随PH值升高而降低，因此确立pH 7. O为诱导的最佳pH值。实施例3 rh β NGF基因工程菌的诱导表达及包涵体的分离纯化
1.挑取单克隆基因工程菌落接种于50mLLB液体培养基，37°C，220rpm振荡培养14h ;
2.将上述菌液种于3L液体LB培养基中，37°C，220rpm振荡培养至A550=0.6时(约3h)，根据对诱导条件的摸索结果(如图I、图2、图3)，加入终浓度为ImM的IPTG，维持培养基pH值7. 0，37 °C诱导3. 5小时；
3.离心(4°C,8000rpm,IOmin),收集菌体，按每克菌体湿重20ml的比例加入20mMTris-HCl (pH=8. O)裂解缓冲液重悬，于-20° C冻存；
4.37°C溶解菌体悬液，进行超声裂菌，功率400W，超声15秒，间隔15秒，作用30分钟。
5.离心(4°C，12000rpm, IOmin)，收集沉淀，用含有 1% TritonX-IOO 的 Tris-HCl洗漆液洗漆二次；
6.用含有2M尿素的Tris-HCl洗涤液洗涤一次；
7.离心(4°C，12000rpm，IOmin)，收集沉淀(为包涵体蛋白)，用含有8M尿素的溶解液溶解，于_80°C保存，并取样进行S·DS-PAGE电泳纯度分析和免疫印迹鉴定(Western Blot)。实验结果表明，包涵体蛋白纯度大于95%(图4);经Western blot鉴定为人神经生长因子(图5)。实施例4 :h β NGF融合蛋白的复性条件的摸索
rh β NGF融合蛋白的复性采用体外稀释复性法。在rh β NGF包涵体蛋白溶液中缓慢滴加复性缓冲液(流速I. 66ml/min)，复性温度为10°C，复性缓冲液的精氨酸浓度和pH以及复性时间对复性效率有一定影响。I、精氨酸浓度对复性效率的影响
配制精氨酸浓度分别为O. 65mM、0. 75 mM、0. 85 mM、0. 95 mMU. 05 mM的复性缓冲液，pH值为9. 5 ;氧化还原体系为还原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽(GSH-GSSG)系统，GSSG浓度为O. 5mM, GSH浓度为5mM，10°C，复性3小时，离心取上清液，用Lowry法测定蛋白浓度，计算蛋白总量，用该蛋白总量与加入复性体系的包涵体蛋白总量的比值表示复性率。实验结果显示，精氨酸浓度为O. 65mM、0. 75 mM、0. 85 mM、0. 95 mMU. 05 mM时蛋白复性率分别为31. 36%,40. 58%,35. 12%,34. 98%,33. 71%。说明在精氨酸浓度为O. 75 mM时，复性率最高，因此确立复性缓冲液中精氨酸浓度O. 75mM为最佳浓度。 2、复性缓冲体系pH值对复性效率的影响
配制PH值分别为8. 0,8. 5,9. 0,9. 5、10. O的复性缓冲液，精氨酸浓度为O. 75 mM ;氧化还原体系为还原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽(GSH-GSSG)系统，GSSG浓度为O. 5mM, GSH浓度为5mM，10°C，复性3小时，离心取上清液，用Lowry法测定蛋白浓度，计算蛋白总量，用该蛋白总量与加入复性体系的包涵体蛋白总量的比值表示复性率。实验结果显示，pH值分别为8. O、8. 5、9. O、9. 5、10. O时蛋白复性率分别为33. 67%、36. 88%,38. 32%,40. 53%,31. 64%。在pH值为9. 5时，复性率最高，因此确立pH 9. 5为最佳复性缓冲液PH值。3、复性时间对复性效率的影响
在精氨酸浓度为O. 75 mM，pH值为9. 5，氧化还原体系为还原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽(GSH-GSSG)系统，GSSG浓度为O. 5mM，GSH浓度为5mM，10°C条件下进行复性，分别于复性I小时、3小时、5小时、7小时、9小时取样离心收集上清，用Lowry法测定蛋白浓度，计算蛋白总量，用该蛋白总量与加入复性体系的包涵体蛋白总量的比值表示复性率。实验结果显示，复性时间分别为I小时、3小时、5小时、7小时、9小时时蛋白复性率分别为12. 67%,40. 74%,39. 32%,40. 21%,38. 25%。在复性时间大于3小时后，随复性时间的延长，复性率没有明显提高，因此确立3小时为最佳复性时间。实施例5 h β NGF融合蛋白的复性与肠激酶切割
rh^NGF融合蛋白的复性采用体外稀释复性法，使用的复性缓冲液中精氨酸浓度为
O.75mM, pH值为9. 5 ;氧化还原体系为还原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽(GSH-GSSG)系统，GSSG浓度为O. 5mM, GSH浓度为5mM ;复性时将复性缓冲液缓慢滴加入包涵体溶液中(I. 66ml/min)，复性温度为10°C，复性时间为3小时；
2.收集复性蛋白溶液，于4°C用50mM Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液透析24小时，每8小时更换一次透析液；
3.收集透析后蛋白溶液，用截留分子量为5kDa的超滤膜进行超滤浓缩；
4.按lU/5(^g的比例用肠激酶切割上述复性的融合蛋白，酶切温度21°C，酶切时间16小时。同时取酶切前后的样品，采用SDS-PAGE电泳检测。检测结果表明(图6)，按上述条件复性的蛋白经肠激酶切割后可释放出分子量大小为13. 2kDa的目的蛋白。
实施例6 rh β NGF的亲和层析分离纯化及生物学活性检测
以 50 mM 咪唑-0.5MNaCl-20mMTris-HCl(pH8.0)的缓冲液平衡 Ni Sepharose FastFlow层析柱，上样过程中收集流穿峰，其为含rh β NGF的组分，经透析和超滤浓缩得到纯化的rh^NGF。取样，采用还原性SDS-PAGE电泳检测纯度，并进行免疫印迹(Western blot)鉴定；同时采用鸡胚背根神经节培养法检测生物活性。实验结果表明，制备的rh β NGF经还原性SDS-PAGE电泳检测为单一条带，其纯度达99%以上(图7);经抗人神经生长因子单克隆抗体Western blot鉴定其为人神经生长因子(图8);以中国药品生物制品检定所分发的鼠颌下腺神经生长因子参考品为参照，采用鸡胚背根神经节培养法检测该样品生物活性，结果显示比活性高于500000AU/mg。以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术中的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些润饰和改进也应属于本发明的专利保护范围。
权利要求
1.一种重组人神经生长因子β亚基基因，其含有6组氨酸纯化位点、肠激酶切割位点以及经过修饰的人神经生长因子β亚基成熟肽段基因和分子伴侣基因，其中所述人神经生长因子β亚基成熟肽段基因为经过原核生物高频密码子改造后的基因，其碱基序列如SEQ ID NO :1所示；所述分子伴侣基因为经过修饰的人神经生长因子β亚基前导肽基因，其喊基序列如SEQ ID NO 2所不。
2.一种利用大肠杆菌表达系统制备重组人神经生长因子的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)利用化学合成法合成经点突变优化的权利要求I所述的人神经生长因子β亚基成熟肽段基因及分子伴侣基因，并将其克隆入ΡΕΤ28 a (+)表达载体，得到重组表达载体； (2)将步骤(I)所得重组表达载体导入大肠杆菌表达菌株BL21UDE3)中，构建含有重组表达载体的基因工程菌； (3)培养步骤(2)所得基因工程菌至A550=0.6时，加入诱导剂IPTG，诱导重组人神经生长因子rh β NGF在该基因工程菌中表达； (4)离心收集菌体，重悬菌体，_80°C冻存； (5)解冻菌体重悬液，破碎菌体，分离纯化包涵体蛋白； (6)体外复性包涵体蛋白，透析后超滤浓缩； (7)经肠激酶切割去除分子伴侣； (8)纯化获得所述重组人神经生长因子。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤(3)中诱导的时间为3-4小时。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤(3)中诱导剂IPTG的浓度为lmmol/L。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤(4)中所用的重悬液为20mMTris-HCl(pH8. O)，使用量为菌体湿重的20倍体积。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤(5)中破碎菌体的方法为超声破碎法，其中超声破碎菌体所用功率为400W，超声15秒，间隔15秒，作用30分钟。
7.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤￠)中复性包涵体蛋白的方法为体外稀释复性法，其中体外稀释复性液中，精氨酸的浓度范围是O. 75-1. OmmoI/L, pH值是8. O-9. 5 ο
8.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤(J)中的肠激酶为带6组氨酸纯化位点的重组牛肠激酶。
9.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤(8)中纯化的方法为镍柱亲和层析法。
全文摘要
本发明公开了一种利用大肠杆菌表达系统制备重组人神经生长因子的方法。该重组人神经生长因子β亚基基因含有6组氨酸纯化位点、肠激酶切割位点以及经过修饰的人神经生长因子β亚基成熟肽段基因及分子伴侣基因。该重组人神经生长因子β亚基基因在大肠杆菌中表达量高；所产生的包涵体蛋白在分子伴侣的辅助下高效复性；用肠激酶准确切割分子伴侣后，经镍柱亲和层析获得的重组人神经生长因子纯度大于99%，生物学活性大于500000AU/mg。
文档编号C12N15/70GK102839182SQ201210278039
公开日2012年12月26日 申请日期2012年8月7日 优先权日2012年8月7日
发明者李佳楠, 汤华东, 陈亚, 李汝霖, 陈煌 申请人:武汉海特生物制药股份有限公司