专利名称：水产养殖鲇鱼杂种的its2分子标记鉴定方法
技术领域：
本发明涉及鱼类杂种的分子标记鉴定方法，具体涉及水产养殖鲇鱼杂种的ITS2分子标记鉴定方法。
背景技术：
鲇形目鱼类属肉食性底层鱼类，是鱼类进化中最发达的真骨鱼类之一。南方鲇(又叫大口鲇)iSilurus meridionalis Chen)和鲇asotus Linnaeus)均属于鲇形目、鲇科、鲇属，两者味道鲜美、营养价值高，是我国各地主要养殖的高附加值经济鱼类。南方鲇分布于我国珠江、闽江、湘江、长江等水系，是一种大型凶猛的肉食性鱼类，具有生长快、个体大、抗病力强等特点，喜栖息于开敞水体，以及湾花、河底砾石河段，怀卵量大，产卵期长。鲇分布于除青藏高原及新疆外的全国各水系，体色随栖息环境不同而有所变化，主要栖息于江河干流或较大的支流、大型湖泊和水库等水体的中下层，其适应性强，栖息于静水或缓流水域，个体较小，生长快。南方鲇和鲇形体轮廓相似，小个体的南方鲇与鲇成体混同杂居，大个体与鲇隔离生活。据报道，人工繁殖的南方鲇群体中雄性比例非常低。调查显示，当雄性南方鲇缺乏时，可能进行了雌性南方鲇与其他雄性鲇属种类的杂交，从而在鲇鱼生产中出现了物种间的杂交育种。为了满足社会生产的需要，获得兼有以上2种鱼优良性状的苗种，王朝明等(大口鲇与鲇鱼的杂交试验，淡水渔业，2004，34 (6): 4广43 ;三种鲇遗传多样性的RAPD分析，淡水渔业，2005，35 (4) : 14 17)开展了南方鲇与鲇的杂交育种试验，并做了一定的杂种鉴定工作，筛选出22个随机引物用于南方鲇、鲇及其杂交F1代三个群体多样性分析，结果发现杂交F1代继承了大口鲇的52条特征带和鲇的32条特征带。然而，其鉴定工作所采用的RAH)标记，受方法本身的限制，检测效率低且重复性不高，严重影响了这一方法的推广使用。此外，仅有龙华等(鲇、大口鲇及其杂交鲇血液生理生化指标比较及转铁蛋白等位基因分析，长江大学学报(自科版)，2006，3 (2): 161^164 ；鲇、大口鲇及其杂交鲇的血型分析，水利渔业，2007，27 (3) : 19 20)对南方鲇、鲇及其杂交鲇的血液生理、血型分析及同工酶等方面的研究。可见，有必要开展南方鲇、鲇及其杂交子代的分子标记及鉴定技术研究，为南方鲇养殖和育种实践中的杂种鉴定提供可靠方法。
发明内容
本发明的目的为鉴定南方鲇与鲇的杂种，从分子生物学层面上将形态上不易区分的杂种和纯种进行分辨。本发明以南方鲇、鲇及其杂交子代作为研究对象，在鲇属鱼类中筛选设计了 ITS2基因片段作为分子标记，应用所扩ITS2基因片段在南方鲇和鲇中的长度差异，成功鉴定了南方鲇、鲇及其杂交子代。ITS基因片段是核糖体RNA转录间隔区的一部分，具有物种内保守，物种间变异大的特点。采用该方法用于南方鲇、鲇及其杂交子代的鉴定，具有实验快捷，操作简便，鉴定直观，无需测序的优点。、
为实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案
水产养殖鲇鱼杂种的ITS2分子标记鉴定方法，其特征在于应用PCR扩增后的南方鲇的ITS2基因片段和鲇的ITS2基因片段存在长度差异，采用琼脂糖凝胶电泳鉴定南方鲇、鲇及其杂交子代。所述的南方鲇的ITS2基因片段的核苷酸序列(SEQID NO: I)为
CTCGTGCGTC GATGAAGAAC GCAGCCAGCT GCGAGAACTA ATGTGAATTG CAGGACACAT
TGATCATCGA CACTTCGAAC GCACATTGCG GCCCCGGGTC CCTCCCGGGG CTACGCCTGT CTGAGGGTCGCTATTTCCAT CGATCGGGAA AAAAACGAAC CATACGCACG CGACTGGAAG CTCGCAGGCC GTCATCGGCCTTCGTCCTCC TAAAAGCAGA CGCTCTCTTT TTTCGTGTCG ；
所述的鲇的ITS2基因片段的核苷酸序列(SEQID N0:2)为
CTCGTGCGTC GATGAAGAAC GCAGCCAGCT GCGAGAACTA ATGTGAATTG CAGGACACATTGATCATCGA CACTTCGAAC GCACATTGCG GCCCCGGGTC CCTCCCGGGG CTACGCCTGT CTGAGGGTCGCTATTTCCAT CGATCGGGAA AAAAACGAAC GCGACTGGAA GCTCGCAGGC CGTCATCGGC CTTCGTCCTCCTAAAAGCAG ACGCTCTCTT TTTTCGTGTC G。所述的水产养殖鲇鱼杂种的ITS2分子标记鉴定方法，包括以下步骤
A分别取南方鲇、鲇及其杂交样本，提取基因组DNA;
B分别以南方鲇、鲇及其杂交样本的总DNA为模板，在ITS2基因片段特定引物的引导下进行PCR扩增；
C琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，经电泳检测，在一个泳道上同时出现南方鲇和鲇的两条基因条带，则是南方鲇和鲇的杂交种。所述的ITS2基因片段特定引物的碱基序列为
正向引物(SEQID NO:3) 5’ 一AACTCTTAGCGGTGGATCACTCGG—3’ ；
反向引物(SEQID NO:4) 5’ 一CGTGGAAAGGCGGCGGAGAT—3’。本发明的有益效果为本发明由于采用DNA序列作为分子标记，因此可以准确快速地将形态上不易区分的鲇鱼杂种和鲇鱼纯种进行分辨，并鉴定出南方鲇和鲇的杂交种。采用ITS2基因片段在南方鲇和鲇中的长度差异来鉴定鲇鱼杂种，具有实验快捷，操作简便，鉴定直观，无需测序的优点。
图I为ITS2基因的长度差异性检测电泳图。图中标记为右侧数字表不DNA片段的分子量，Dl D4为南方鲇样本，Al A4为鲇样本；Z1 TA为正交子代，Fl F4为反交子代，M为Marker，本发明所用为DL2000DNA Marker (Tiangen 公司)。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。水产养殖鲇鱼杂种的ITS2分子标记鉴定方法，以南方鲇、鲇及其杂交F1代作为研究对象，包括以下步骤
第一步，分别取南方鲇、鲇及其杂交样本，提取基因组DNA。
因为杂交鱼苗个体很小，所以用海洋组织DNA提取试剂盒(Tiangen公司)提取鱼苗样本基因组DNA。用传统的酚-氯仿抽提法提取亲本南方鲇和鲇鳍条样本的基因组DNA
a取材取无水乙醇浸泡的鳍条样本少许，用酒精消毒的剪刀剪碎，放入I. 5 ml EP管中。b 消化加入 500 UL 裂解缓冲液(10 mmol/L Tris-Cl ；0. I mol/L EDTA ；0. 5 %SDS ；pH 8.0),5 ML蛋白酶K (20 mg/ml )，混合均匀，放入55 °C的摇床内，60-70 rpm消化过
夜。·c抽提I :取出EP管，待溶液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚(约500 ML)，缓慢混匀10 min，12000 rpm离心10 min，用I ml枪头缓慢将上清液移至另一 EP管中。d抽提2 :重复抽提I的步骤，用饱和酚再抽提一次，将上清液转入另一 EP管中。e抽提3 :加入400 ML的酹-氯仿(I :1),缓慢混勻5 min, 12000 rpm离心10 min,
轻轻将上清液转入另一 EP管中。f抽提4 :加入300 ML的氯仿，缓慢混匀5 min, 12000 rpm离心10 min,上清液转
移至另一 EP管中。g沉淀加入管内体积两倍体积的冰冻无水乙醇,于_20°C沉淀20 min。8000 rpm离心I min。h漂洗I :加入150 ML 75 %的冰冻酒精，漂洗后，8000 rpm离心I min。i漂洗2 同漂洗I步骤。j漂洗3:用150 ML冰冻无水乙醇再漂洗一次,8000 rpm离心I min后,弃掉上清，
自然风干。k溶解加入50 ML MilliQ超纯水，溶解沉淀的DNA。第二步，筛选出具有长度差异的ITS2基因片断。(I)参考GenBank中鲇18S核糖体RNA基因序列GQ465245，应用引物设计软件Primer5. 0 设计引物 ITS2_F(SEQID NO: 3): 5’-AACTCTTAGCGGTGGATCACTCGG-3’和 TR(SEQIDN0:5) :5’ -TAAAITCAGCGGGTCGTCTCGTC-3’，并由 Invitrogen 公司合成。ITS2-F和TR为扩增ITS2目的片段的引物对，其中的F代表正向引物(或上游引物)，TR在筛选种间序列长度差异时，代表反向引物(或下游引物)。(2) PCR 扩增
将各组分按以下顺序在0. 2 mL的PCR管中混合(反应体系为50 ML)
①超纯水36.6 ML
②Taq 酶 IOX buffer5 ML
③MgCl2 (I. 5 mM)4 ML
④dNTPs (2. 5 mM)I ML
⑤引物ITS2-F (25 pM)I ML
⑥引物TR (25 pM)IML
⑦模板DNA (约 100 ng)I ML
⑧Taq DNA 聚合酶(2. 5 U U L-1) 0. 4 ML 扩增步骤为①94° C预变性4 min
②94。C变性30 s
③59° C退火35 s
④72° C延伸40 s
⑤重复步骤②-④31次
⑥72° C充分延伸7 min
(3)PCR产物回收
用I %的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物片段，并在紫外灯下切割目的条带后放入1.5mL的EP管中，回收采用DNA Agarose Extraction kit (Omega公司)回收试剂盒。将电泳检测合格的回收产物送生物公司测序。(4)数据分析与优化扩增片段
将测序公司返回的序列信息，人工校对后进行在线BLAST (http://www. ncbi. nlm.nih. gov/BLAST)验证,验证无误后使用DNAMAN Version 6.0对南方鲇与鲇的ITS2序列信息进行比对并辅以人工调整，选取具有稳定长度差异的保守序列SEQID N0:1和SEQID NO :2，应用引物设计软件Primer 5. 0设计中间反向引物ITS2-R (SEQID N0:4)(5’ -CGTGGAAAGGCGGCGGAGAT-3’)以凸显长度差异的片断，并在亲本与杂交子代群体中扩+
>曰oITS2-F和ITS2-R为扩增ITS2目的片段的引物对，其中的F代表正向引物(或上游引物)，R代表反向引物(或下游引物)。第三步，分别以南方鲇、鲇及其杂交样本的总DNA为模板，在ITS2分子标记专用引物的引导下进行PCR扩增。使用弓丨物对ITS2-F( SEQID NO: 3)(5’ -AACTCTTAGCGGTGGATCACTCGG-3’)和 ITS2-R(SEQID N0:4)(5’- CGTGGAAAGGCGGCGGAGAT -3’)，在亲本与杂交子代群体中 PCR 扩增 ITS2基因稳定片段。将各组分按以下顺序在0.2 ml的PCR管中混合(反应体系为50 ML):
①超纯水35.6 ML
②Taq 酶 IOX buffer5 ML
③MgCl2 (I. 5 mM)5 ML
④dNTPs (2. 5 mM)I ML
⑤引物ITS2-F (25 pM)I ML
⑥引物ITS2-R (25 pM)I ML
⑦模板DNA (约 100 ng)I ML
⑧Taq DNA 聚合酶(2. 5 U U L-1) 0. 4 ML 扩增步骤为
①94。C预变性5 min
②94。C变性30 s
③59° C退火35 s
④72° C延伸30 s
⑤重复步骤②-④34次
⑥72° C充分延伸7 min第四步，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。制备2 %的琼脂糖凝胶，并将5 ML PCR产物加入点样缓冲液并混匀后上样电泳。恒压100 V电泳40 min，电泳后使用UV凝胶成像系统显现目的条带，依据电泳胶图进行种间长度差异分析和杂种鉴定。本发明的琼脂凝胶制备方法如下
I %的琼脂糖凝胶的制备方法
用天平称取0.3 g琼脂糖，倒入30 ml的I XTAE缓冲液中，摇匀后置于微波炉中加热至完全溶解，取出待稍凉后(防止高温使EB挥发)JPAEB 2 ML。将制胶板(Bio-Rad公司)放置于水平位置，然后插入样品梳子。将之前配制的琼脂糖凝胶倒入制胶板内槽。冷却半 小时待凝胶凝固后取出梳子，将凝胶放入电泳槽(Bio-Rad公司)内并加入IXTAE电泳缓冲液使其浸没凝胶。在点样板上点上1/6体积的点样缓冲液(溴酚蓝)。2 %的琼脂糖凝胶的制备方法
用天平称取0.6 g琼脂糖，倒入30 ml的I XTAE缓冲液中，摇匀后置于微波炉中加热至完全溶解，取出待稍凉后(防止高温使EB挥发)JPAEB 2 ML。将制胶板(Bio-Rad公司)放置于水平位置，然后插入样品梳子。将之前配制的琼脂糖凝胶倒入制胶板内槽。冷却半小时待凝胶凝固后取出梳子，将凝胶放入电泳槽(Bio-Rad公司)内并加入IXTAE电泳缓冲液使其浸没凝胶。在点样板上点上1/6体积的点样缓冲液(溴酚蓝)。本发明使用的主要仪器如下
PCR 仪Bio-Rad iCycIer 和 MJ100离心机Eppendorf Centrifuge 5415D
稳压稳流电泳仪BI0-RAD power PAC 300
凝胶成像系统Alphalmage Multimage Light Cabinet
电子天平、培养箱、蒸汽灭菌器、摇床以及一些常用的实验设备。上述实施例结果显示南方鲇的ITS2基因片段在GenBank中未见报道，如图I的基因条带图所示，杂交子代鲇同时出现南方鲇和鲇的两条基因条带，经测序验证分别与2种亲本序列一致。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
权利要求
1.水产养殖鲇鱼杂种的ITS2分子标记鉴定方法，其特征在于应用PCR扩增后的南方鲇的ITS2基因片段和鲇的ITS2基因片段的长度差异，鉴定南方鲇、鲇及其杂交子代。
2.根据权利要求I所述的水产养殖鲇鱼杂种的ITS2分子标记鉴定方法，其特征在于所述的南方鲇的ITS2基因片段的核苷酸序列(SEQID NO: I)为 CTCGTGCGTC GATGAAGAAC GCAGCCAGCT GCGAGAACTA ATGTGAATTG CAGGACACATTGATCATCGA CACTTCGAAC GCACATTGCG GCCCCGGGTC CCTCCCGGGG CTACGCCTGT CTGAGGGTCGCTATTTCCAT CGATCGGGAA AAAAACGAAC CATACGCACG CGACTGGAAG CTCGCAGGCC GTCATCGGCCTTCGTCCTCC TAAAAGCAGA CGCTCTCTTT TTTCGTGTCG。
3.根据权利要求I所述的水产养殖鲇鱼杂种的ITS2分子标记鉴定方法，其特征在于所述的鲇的ITS2基因片段的核苷酸序列(SEQID NO: 2)为 CTCGTGCGTC GATGAAGAAC GCAGCCAGCT GCGAGAACTA ATGTGAATTG CAGGACACATTGATCATCGA CACTTCGAAC GCACATTGCG GCCCCGGGTC CCTCCCGGGG CTACGCCTGT CTGAGGGTCGCTATTTCCAT CGATCGGGAA AAAAACGAAC GCGACTGGAA GCTCGCAGGC CGTCATCGGC CTTCGTCCTCCTAAAAGCAG ACGCTCTCTT TTTTCGTGTC G。
4.根据权利要求I所述的水产养殖鲇鱼杂种的ITS2分子标记鉴定方法，其特征在于包括以下步骤 A分别取南方鲇、鲇及其杂交样本，提取基因组DNA; B分别以南方鲇、鲇及其杂交样本的总DNA为模板，在ITS2基因片段特定引物的引导下进行PCR扩增； C电泳检测PCR扩增产物，经电泳检测，在一个泳道上同时出现南方鲇和鲇的两条基因条带，则是南方鲇和鲇的杂交种。
5.根据权利要求4所述的水产养殖鲇鱼杂种的ITS2分子标记鉴定方法，其特征在于所述的ITS2基因片段特定引物的碱基序列为 正向引物(SEQID NO:3) 5’ 一AACTCTTAGCGGTGGATCACTCGG—3’ ； 反向引物(SEQID NO:4) 5’ -CGTGGAAAGGCGGCGGAGAT-3’。
全文摘要
本发明涉及水产养殖鲇鱼杂种的ITS2分子标记鉴定方法。本发明以南方鲇、鲇及其杂交子代作为研究对象，在鲇属鱼类中筛选设计了ITS2基因片段作为分子标记，应用所扩ITS2基因片段在南方鲇和鲇中的长度差异，成功鉴定了南方鲇、鲇及其杂交子代。具有实验快捷，操作简便，鉴定直观，无需测序的优点。
文档编号C12Q1/68GK102758022SQ20121027837
公开日2012年10月31日 申请日期2012年8月7日 优先权日2012年8月7日
发明者刘匆, 孙家贤, 宋昭彬, 应汝华, 盛晓洒, 郭睿, 陈齐勇, 龚丽 申请人:通威股份有限公司