水产养殖鲇鱼杂种的CH₄分子标记DGGE鉴定方法

专利名称：水产养殖鲇鱼杂种的CH₄分子标记DGGE鉴定方法
技术领域：
本发明涉及鱼类杂种的分子标记鉴定方法，具体涉及水产养殖鲇鱼杂种的CH4分子标记DGGE鉴定方法。
背景技术：
鲇形目鱼类属肉食性底层鱼类，是鱼类进化中最发达的真骨鱼类之一。南方鲇(又叫大口鲇)iSilurus meridionalis Chen)和鲇asotus Linnaeus)均属于鲇形目、鲇科、鲇属，两者味道鲜美、营养价值高，是我国各地主要养殖的高附加值经济鱼类。南方鲇分布于我国珠江、闽江、湘江、长江等水系，是一种大型凶猛的肉食性鱼类，具有生长快、个体大、抗病力强等特点，喜栖息于开敞水体，以及湾花、河底砾石河段，怀卵量大，产卵期长。鲇分布于除青藏高原及新疆外的全国各水系，体色随栖息环境不同而有所变化，主要 栖息于江河干流或较大的支流、大型湖泊和水库等水体的中下层，其适应性强，栖息于静水或缓流水域，个体较小，生长快。南方鲇和鲇形体轮廓相似，小个体的南方鲇与鲇成体混同杂居，大个体与鲇隔离生活。据报道，人工繁殖的南方鲇群体中雄性比例非常低。调查显示，当雄性南方鲇缺乏时，可能进行了雌性南方鲇与其他雄性鲇属种类的杂交，从而在鲇鱼生产中出现了物种间的杂交育种。为了满足社会生产的需要，获得兼有以上2种鱼优良性状的苗种，王朝明等(大口鲇与鲇鱼的杂交试验，淡水渔业，2004，34 (6): 4广43 ;三种鲇遗传多样性的RAPD分析，淡水渔业，2005，35 (4) : 14 17)开展了南方鲇与鲇的杂交育种试验，并做了一定的杂种鉴定工作，筛选出22个随机引物用于南方鲇、鲇及其杂交F1代三个群体多样性分析，结果发现杂交F1代继承了大口鲇的52条特征带和鲇的32条特征带。然而，其鉴定工作所采用的RAH)标记，受方法本身的限制，检测效率低且重复性不高，严重影响了这一方法的推广使用。此外，仅有龙华等(鲇、大口鲇及其杂交鲇血液生理生化指标比较及转铁蛋白等位基因分析，长江大学学报(自科版)，2006，3 (2): 161^164 ；鲇、大口鲇及其杂交鲇的血型分析，水利渔业，2007，27 (3) : 19 20)对南方鲇、鲇及其杂交鲇的血液生理、血型分析及同工酶等方面的研究。可见，有必要开展南方鲇、鲇及其杂交子代的分子标记及鉴定技术研究，为南方鲇养殖和育种实践中的杂种鉴定提供可靠方法。目前，RAPD, AFLP和微卫星都适合种群层次的种质鉴定，但是，RAPD检测效率低，通常尝试数十对随机引物才有十对左右可以使用，而且重复性不佳；AFLP重现性较高，能产生大量(通常100以上)的多态性条带，但不易操作，在放大种间差异的同时更加剧了种内差异，存在大量假阳性结果，限制了杂种鉴定准确性；微卫星虽然具有种属特异性、共显性及高度的多态性和灵敏性，在杂种鉴定及遗传渐渗等分析中得到了广泛的应用，但是用于鉴别杂种的位点需要具种属特异性，在分析过程中要判断扩增产物的真实性，尤其是在鉴别近缘种杂交时，正确判断近缘种中等位基因的大小和数目显得特别重要，这在很大程度上增加了微卫星的使用难度。变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术广泛应用于微生物宏基因组种属的鉴定，还从未被引入杂种鉴定领域。变性梯度凝胶电泳是一种在核苷酸序列中发现点突变或SNP位点的方法，这种电泳技术直接依据DNA序列差异产生的变性条件的不同而进行，即依据片段长度相同但碱基组成不同的DNA分子在含有线性变性剂梯度的构象胶中迁移率不同而可以相互分离。通过DGGE可以分离长度在500 bp以内的具有50 %序列差异的DNA片段，而在给DNA片段的一端加上高GC含量的夹板后，甚至可以分离序列差异仅有I bp的DNA片段。在杂种鉴定领域，使用这种方法能在找到存在差异位点核基因的同时将其等位基因进行分离，进而在胶图上直观地判定物种是否存在杂交，从而提高了杂种鉴定的快捷性，并在一定程度上克服了琼脂糖凝胶或普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳中不能进行等位基因分离鉴别的缺陷。

发明内容
本发明的目的为鉴定南方鲇与鲇的杂种，从分子生物学层面上将形态上不易区分的杂种和纯种进行分辨。本发明以南方鲇、鲇及其杂交子代为研究对象，在鲇属鱼类中筛选 设计了 CH4基因片段作为分子标记，应用CH4基因片段的变性梯度凝胶电泳(DGGE)检测，成功鉴定了南方鲇、鲇及其杂交子代。CH4基因片段是免疫球蛋白重链编码基因外显子的一部分，在近缘种间高度保守。本发明发现CH4基因片段在南方鲇与鲇之间存在种间序列差异，将CH4基因片段的变性梯度凝胶电泳(DGGE)检测用于南方鲇、鲇及其杂交子代的鉴定，具有实验快捷，鉴定直观，无需测序的优点。为实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案
水产养殖鲇鱼杂种的CH4分子标记DGGE鉴定方法，其特征在于应用PCR扩增后的南方鲇的CH4基因片段与鲇的CH4基因片段之间存在的种间序列差异，鉴定南方鲇、鲇及其杂交子代。所述的水产养殖鲇鱼杂种的CH4分子标记DGGE鉴定方法，包括以下步骤
A分别取南方鲇、鲇及其杂交样本，提取DNA ；
B分别以南方鲇、鲇及其杂交样本的总DNA为模板，使用特定引物进行PCR扩增；
C DGGE分析检测种间差异，经DGGE检测，在一个泳道上同时出现南方鲇和鲇的两条基因条带，则是南方鲇和鲇的杂交种。所述的步骤B中的特定引物为扩增CH4基因片段的特定引物，其碱基序列为
正向引物(SEQID NO: 3) 5’ -TCCCCAAGGTTTACTTGCTCGCTCC-3’ ；
反向引物(SEQID NO:4) 5’ -CGATGGATCTGGATATGTGGCGCAC-3’ ；
且在正向引物的 5’ 末端添加了 GC 夹板(SEQID NO: 5) 5’ - CGGGGGCCGGGCCGGGCGGGCGTGGCGGGCGCTGCGGGCG-3，。所述的CH4基因片段的特定引物，所扩增出的南方鲇的基因片段的核苷酸序列(SEQID NO:I)为
CCAGAGACTT CAGAATCAGT GACCCTGACT TGCTATGTAA AAGACTTCTA CCCTAAGGAGGTGTATGTGT CTTGGCTTGC TGATGATAAA CCAGTGGAGG GTCTGAGCTA CTATAAGGAG AACACCACCGTTCCCCAGAA TGACAAACAA TTTTCAATGT ATAGTCAGC TGATTGTTGA TTCCCAATCT TGGAAGAAAGGCGTTGTGT ACACCTGCAG GGTTTATCAC GAGTCCATCG AGGACCCA ；所述的CH4基因片段的特定引物，所扩增出的鲇的基因片段的核苷酸序列为CCAGAGACTT CAGAATCAGT GACCCTGACT TGCTATGTAA AAGACTTCTA CCCTAAGGAGGTGTATGTGT CTTGGCTTGC TGATGATAAA CCAGTGGAGG GTCTGAGCTA CTATAAGGAG AACACCACCATTCCCCAGAA TGAGAAACAA TTTTCAATGT ATAGTCAGCT GATTGTTGAT TCCCAATCTT GGAAGAAAGGCGTTGTGTAC ACCTGCAGGG TTTATCACGA GTCCATCGAG GACCCA。所述的步骤C中的DGGE，所使用的变性梯度凝胶组分是指变性剂浓度为30%与60%的凝胶液的混合液。采用这种组合的变性梯度凝胶组分，DGGE结果理想，表现为条带在凝胶中电泳充分，电泳结束时条带位置接近中间，条带的分离度好等。所述的步骤C中的DGGE，在恒温60° C的IX TAE电泳缓冲液中进行，首先在80V电压下运行20min，然后在150V电压下运行2. 5h。其优点在于，在不影响结果的前提下尽量缩短电泳时间，提高效率，由于本方法是分离等位基因且不需要低电压长时间电泳，故较传统的DGGE电泳时长(20— 40h)缩短了很多。本发明的有益效果表现在· (I)本发明首次将PCR-DGGE用于杂种鉴定领域，具有快速直观的优点，而且尤其适用于那些缺乏相关序列信息的物种。这一方法在一定程度上不依赖于测序结果，只要选择了合适的分子标记，DGGE电泳图就可以直观展示鉴定结果，不需要对PCR产物进行等位基因测序以建树分析，或者依据近缘种间的序列差异寻找合适的限制性酶切位点进行PCR-RFLP分析。(2)本发明提供的DGGE方法所使用的变性梯度凝胶组分为30%与60%的凝胶液的混合液。采用这种组合的变性梯度凝胶组分，DGGE的条带在凝胶中电泳充分，电泳结束时条带位置接近中间，条带的分离度好。(3)本发明提供的DGGE方法在恒温60° C的I X TAE电泳缓冲液中进行，首先在80V电压下运行20min，然后在150V电压下运行2. 5h。其优点在于，在不影响实验结果的前提下尽量缩短电泳时间，提高效率，由于本方法是分离等位基因且不需要低电压长时间电泳，故较传统的DGGE电泳时长(20— 40h)缩短了很多。


图I为DGGE检测亲本南方鲇和鲇的CH4基因条带图。图2为检测南方鲇、鲇及其杂交子代的CH4基因条带图。图中标记为D1 D3为南方鲇样本，Al A3为鲇样本；Z1 Z3为正交子代，Fl F3为反交子代。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。水产养殖鲇鱼杂种的CH4分子标记DGGE鉴定方法，以南方鲇、鲇及其杂交F1代作为研究对象，包括以下步骤
第一步，分别取南方鲇、鲇及其杂交样本，提取基因组DNA。因为杂交鱼苗个体很小，所以用海洋组织DNA提取试剂盒(Tiangen公司)提取鱼苗样本基因组DNA。
用传统的酹-氯仿抽提法(Sambrook & Russell, 2001)提取亲本南方鲇和鲇鳍条样本的基因组DNA
a取材取无水乙醇浸泡的鳍条样本少许，用酒精消毒的剪刀剪碎，放入I. 5 ml EP管中。b 消化加入 500 u L 裂解缓冲液(10 mmol/L Tris-Cl ；0. I mol/L EDTA ；0. 5 %SDS ；pH 8.0),5 ML蛋白酶K (20 mg/ml )，混合均匀，放入55 °C的摇床内，60-70 rpm消化过夜。c抽提I :取出EP管，待溶液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚(约500 ML)，缓慢混匀10 min, 12000 rpm离心10 min，用I ml枪头缓慢将上清液移至另一 EP管中。
d抽提2 :重复抽提I的步骤，用饱和酚再抽提一次，将上清液转入另一 EP管中。e抽提3 :加入400 ML的酹-氯仿(I :1),缓慢混勻5 min, 12000 rpm离心10 min,
轻轻将上清液转入另一 EP管中。f抽提4 :加入300 ML的氯仿，缓慢混匀5 min, 12000 rpm离心10 min,上清液转
移至另一 EP管中。g沉淀加入管内体积两倍体积的冰冻无水乙醇,于_20°C沉淀20 min。8000 rpm离心I min。h漂洗I :加入150 ML 75 %的冰冻酒精，漂洗后，8000 rpm离心I min。i漂洗2:同漂洗I步骤。j漂洗3:用150 ML冰冻无水乙醇再漂洗一次，8000 rpm离心I min后，弃掉上清，
自然风干。k溶解加入50 ML MilliQ超纯水，溶解沉淀的DNA。第二步，分别以南方鲇、鲇及其杂交样本的总DNA为模板，在CH4基因片段特定引物的引导下进行PCR扩增；
(I)PCR扩增南方鲇、鲇及其杂交F1代的免疫球蛋白M的重链保守区DNA外显子序列CH4 基因片段。CH4 引物采用 CH4-F (5，-TCCCCAAGGITTACTTGCTCGCTCC-3’ )和 CH4-R (5，-CGATGGATCTGGATATGTGGCGCAC-3 ’)。为获得较好的DGGE分离效果,在引物CH4-F的5，末端添加了 GC 夹板(5’ - CGGGGGCCGGGCCGGGCGGGCGTGGCGGGCGCTGCGGGCG-3’)，以上引物均由Invitrogen公司合成。CH4-F和CH4-R为扩增CH4目的片段的引物对，其中的F代表正向引物(或上游引物)，R代表反向引物(或下游引物)。(2) PCR 扩增
将各组分按以下顺序在0. 2 ml的PCR管中混合(反应体系为50 ML)
①超纯水36 ML
②Taq 酶 IOX buffer5 ML
③MgCl2 (I. 5 mM)4 ML
④dNTPs (2. 5 mM)I. 5 ML
⑤引物GC-CH4-F (25 pM)I ML
⑥引物CH4-R (25 pM)I ML
⑦模板DNA (约 100 ng)I ML⑧Taq DNA 聚合酶(2. 5 U U L-1) 0. 5 ML 经过优化的PCR反应扩增步骤为
①94° C预变性4 min
②94。C变性40 s
③60° C退火30 s
④72° C延伸30 s
⑤重复步骤②-④32次
⑥72。C充分延伸10 min
(3)PCR产物纯化与测序
用I %的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物片段，并在紫外灯下切割目的条带后放入1.5mL的EP管中，回收采用DNA Agarose Extraction kit (Omega公司)回收试剂盒。回收产物经电泳检测后，送生物公司测序。测序验证其序列信息，发现CH4基因片段存在种间序列差异，用于进行后期的DGGE法杂种鉴定。第二步，DGGE分析检测种间差异。DGGE在Bio-Rad公司的Dcode 通用突变检测系统中进行，选用的聚丙烯酰胺凝胶浓度为8 %，其中变性剂(尿素和去离子甲酰胺)梯度经过优化为30% 60%。配制方法为首先按照表I分别配制低变性剂浓度(30%)凝胶液15mL和高变性剂浓度(60%)凝胶液15mL，并于灌胶前各加入150 ML APS和8 ML TEMED ;然后使用梯度生成器将2种凝胶液同时向竖直放置于水平桌面凝胶槽中的三明治玻璃夹板中注入，其中高变性剂浓度凝胶液注入速度较快，灌胶结束后插上点样梳；最后由于重力作用，形成自上而下变性剂梯度为30% 60%的聚丙烯酰胺凝胶。在凝胶的同时，将DGGE仪器中的IX TAE电泳缓冲液预热，当温度接近60° C时，将夹有凝固凝胶的三明治夹板放入电泳槽中，上样时每个泳道加PCR产物约25ML。DGGE在恒温60° C的IX TAE电泳缓冲液中进行，首先在80V电压下运行20min，然后在150V电压下运行2. 5h。DGGE结束后，将聚丙烯酰胺凝胶在加入25 Gold View的IX TAE电泳缓冲液中避光染色40min，然后在UV凝胶成像系统中检测并对电泳结果进行分析。DGGE变性梯度凝胶组分为变性梯度为30%与60%的变性剂的混合液，各组分见下表
表I DGGE变性梯度凝胶组分
权利要求
1.水产养殖鲇鱼杂种的CH4分子标记DGGE鉴定方法，其特征在于应用PCR扩增后的南方鲇的014基因片段与鲇的CH4基因片段之间存在的种间序列差异鉴定南方鲇、鲇及其杂交子代。
2.根据权利要求I所述的水产养殖鲇鱼杂种的CH4分子标记DGGE鉴定方法，其特征在于包括以下步骤 A分别取南方鲇、鲇及其杂交样本，提取基因组DNA; B分别以南方鲇、鲇及其杂交样本的总DNA为模板，使用特定引物进行PCR扩增； C DGGE分析检测种间差异，经DGGE检测，在一个泳道上同时出现南方鲇和鲇的两条基因条带，则为南方鲇和鲇的杂交种。
3.根据权利要求2所述的水产养殖鲇鱼杂种的CH4分子标记DGGE鉴定方法，其特征在于所述的步骤B中的特定引物为CH4基因片段的特定引物，碱基序列为正向引物(SEQID NO: 3) 5’ -TCCCCAAGGTTTACTTGCTCGCTCC-3’ ； 反向引物(SEQID NO:4) 5’-CGATGGATCTGGATATGTGGCGCAC-3’ ； 且在正向引物的 5’ 末端添加了 GC 夹板(SEQID NO: 5) 5’ - CGGGGGCCGGGCCGGGCGGGCGTGGCGGGCGCTGCGGGCG-3，。
4.根据权利要求3所述的水产养殖鲇鱼杂种的CH4分子标记DGGE鉴定方法，其特征在于所述的CH4基因片段的特定引物，所扩增出的南方鲇的基因片段的核苷酸序列(SEQIDNO:I)为 CCAGAGACTT CAGAATCAGT GACCCTGACT TGCTATGTAA AAGACTTCTA CCCTAAGGAGGTGTATGTGT CTTGGCTTGC TGATGATAAA CCAGTGGAGG GTCTGAGCTA CTATAAGGAG AACACCACCGTTCCCCAGAA TGACAAACAA TTTTCAATGT ATAGTCAGC TGATTGTTGA TTCCCAATCT TGGAAGAAAGGCGTTGTGT ACACCTGCAG GGTTTATCAC GAGTCCATCG AGGACCCA。
5.根据权利要求3所述的水产养殖鲇鱼杂种的CH4分子标记DGGE鉴定方法，其特征在于所述的CH4基因片段的特定引物，所扩增出的鲇的基因片段的核苷酸序列(SEQID N0:2)为 CCAGAGACTT CAGAATCAGT GACCCTGACT TGCTATGTAA AAGACTTCTA CCCTAAGGAGGTGTATGTGT CTTGGCTTGC TGATGATAAA CCAGTGGAGG GTCTGAGCTA CTATAAGGAG AACACCACCATTCCCCAGAA TGAGAAACAA TTTTCAATGT ATAGTCAGCT GATTGTTGAT TCCCAATCTT GGAAGAAAGGCGTTGTGTAC ACCTGCAGGG TTTATCACGA GTCCATCGAG GACCCA。
6.根据权利要求2中任意一项所述的水产养殖鲇鱼杂种的CH4分子标记DGGE鉴定方法，其特征在于所述的步骤C中的DGGE，所使用的变性梯度凝胶组分是指变性梯度为30%与60%的变性剂的混合液。
7.根据权利要求2所述的水产养殖鲇鱼杂种的CH4分子标记DGGE鉴定方法，其特征在于所述的步骤C中的DGGE，在恒温60° C的I X TAE电泳缓冲液中进行，首先在80V电压下运行20min，然后在150V电压下运行2. 5h。
全文摘要
本发明涉及水产养殖鲇鱼杂种的CH4分子标记DGGE鉴定方法。本发明以南方鲇、鲇及其杂交子代为研究对象，在鲇属鱼类中筛选设计了CH4基因片段作为分子标记，应用CH4基因片段在南方鲇与鲇之间存在种间序列差异，应用变性梯度凝胶电泳检测，成功鉴定了南方鲇、鲇及其杂交子代。具有实验快捷，鉴定直观，无需测序的优点。
文档编号C12Q1/68GK102758023SQ201210278429
公开日2012年10月31日 申请日期2012年8月7日 优先权日2012年8月7日
发明者刘匆, 孙家贤, 宋昭彬, 应汝华, 盛晓洒, 郭睿, 陈齐勇, 龚丽 申请人:通威股份有限公司