降低含人工合成抗菌药水体中生物毒性的方法与流程

本发明属于环境污染治理领域，涉及一种降低含人工合成抗菌药水体中生物毒性的方法。

背景技术：

以磺胺甲恶唑(smx)、诺氟沙星(nor)为代表的磺胺类和氟喹诺酮类药物近年来被广泛使用，它们不仅用于治疗人类和兽类疾病，还作为饲料添加剂用于畜牧业以及水产养殖业。磺胺甲恶唑(smx)和诺氟沙星(nor)不能被人类和兽类完全代谢，因此大部分以母体或代谢物的形式通过尿液或者粪便排出体外，继而重新进入水体环境中。水体环境中的磺胺甲恶唑(smx)和诺氟沙星(nor)会导致抗性基因的形成与传播，从而威胁公众健康，因此亟待寻求有效的方法从水体环境中去除这些药物。物理方法例如光解、光催化虽能移除磺胺甲恶唑(smx)和诺氟沙星(nor)但会造成二次污染，同时物理方法费用也较高。

近年来，白腐真菌在生物修复异生物质污染方面引起了广泛的关注。单一白腐真菌虽能达到移除异生物质的能力，但自然环境中混菌体系普遍存在。污染物的移除可能不是一种微生物而是两种乃至三种以上微生物共同作用的结果。水体环境中的磺胺甲恶唑(smx)和诺氟沙星(nor)会抑制水体中正常存在的微生物的生长，即对微生物具有生物毒性。磺胺甲恶唑(smx)和诺氟沙星(nor)在去除过程中会产生一些毒性更大的转化产物，对水体中正常存在的微生物可能毒性更大，即使去除了水体中这些污染物但对环境造成了更大的污染，因此以水体中正常存在的微生物为指示菌来评估磺胺甲恶唑(smx)和诺氟沙星(nor)去除后水体中的生物毒性是必要的。既能有效的去除污染物又能更好的减少污染物的生物毒性才能实现环境污染治理领域的双赢。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术可能会形成二次污染以及较大生物毒性的不足，提供一种降低含人工合成抗菌药水体中生物毒性的方法。

本发明的技术方案概述如下：

降低含人工合成抗菌药水体中生物毒性的方法，包括如下步骤：

(1)种子培养：将保藏编号为cgmcc5.776的黄孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中，在28-35℃培养4-6天；再转入马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基中在28-35℃，在搅拌下，培养45-50小时，得到黄孢原毛平革菌一级种子；

将保藏编号为cgmcc5.815的血红密孔菌(pycnoporussanguineus)在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中，在28-35℃培养5-7天；再转入马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基中在28-35℃，在搅拌下，培养45-50小时，得到血红密孔菌一级种子；

(2)降解液配制：将含人工合成抗菌药的水体与发酵培养基混合配成降解液，使降解液中人工合成抗菌药的浓度在2-10mg/l；

(3)按比例，取步骤(1)获得的黄孢原毛平革菌的一级种子15-25ml干重条件下的浓度为0.09-0.15g/l和血红密孔菌的一级种子15-25ml干重条件下的浓度为0.09-0.15g/l，在6000-8000rpm离心10-15min，弃上清，放入降解液中，使总体积为500ml，在28-35℃，150-200rpm，混合发酵180-200h，6000-8000rpm离心，收集上清；

(4)将步骤(3)获得的上清与luria-bertani培养基按4:1比例混合，接入大肠杆菌(e.colidh5α)和枯草芽孢杆菌(b.subtilisrh33)，使所述大肠杆菌的初始光密度od600＝0.2，使所述枯草芽孢杆菌初始光密度od600＝0.2，监测所述大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在24h内od600变化，od600与含人工合成抗菌药水体中生物毒性成反比。

优选地，人工合成抗菌药为磺胺类药或氟喹诺酮类药。

磺胺类药物优选磺胺甲恶唑或磺胺异恶唑，也可以是其它的磺胺类药物。

氟喹诺酮类药优选诺氟沙星或环丙沙星，也可以是其它的氟喹诺酮类药物。

发酵培养基优选：葡萄糖,10g/l；酒石酸铵,0.2g/l；醋酸钠缓冲液(ph4.5),20mm/l；kh2po4,2.0g/l；mgso4·7h2o,0.71g/l；维生素b1,1mg/l；cacl2·2h2o,0.1g/l；氨三乙酸,1.5g/l；cuso4,0.1g/l；znso4·7h2o,0.1g/l；mnso4,0.5g/l；nacl,1g/l；cocl2,0.1g/l；feso4·7h2o,0.1g/l；na2moo4·2h2o,0.01g/l；kal(so4)2·12h2o,0.01g/l；h3bo3,0.01g/l；其余为水。

本发明的优点：本发明的方法用黄孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)和血红密孔菌(pycnoporussanguineus)混合培养降解含人工合成抗菌药水体，降低该水体生物毒性的效果较单一的黄孢原毛平革菌或血红密孔菌要好。环保。

附图说明

图1为在发酵培养基条件下p.chrysosporium和p.sanguineus单菌和混菌系统中移除磺胺甲恶唑和诺氟沙星的情况。图中，smx：磺胺甲恶唑；nor：诺氟沙星

图2为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在p.sanguineus单菌以及p.chrysosporium和p.sanguineus混菌体系处理后的磺胺甲恶唑和诺氟沙星废水中生长曲线。

ps+nor：单独培养p.sanguineus去除诺氟沙星192h后的上清2

ps+smx：单独培养p.sanguineus去除磺胺甲恶唑192h后的上清1

cs+nor：混菌培养去除诺氟沙星192h后的上清2

cs+smx：混菌培养去除磺胺甲恶唑192h后的上清1

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

各实施例中：

马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基为：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂18g/l，自然ph，余量是水。

马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基为：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，自然ph，余量是水。

发酵培养基为：葡萄糖，10g/l；酒石酸铵，0.2g/l；ph＝4.5醋酸钠缓冲液，20mm/l；kh2po4，2.0g/l；mgso4·7h2o，0.71g/l；维生素b1，1mg/l；cacl2·2h2o，0.1g/l；氨三乙酸，1.5g/l；cuso4，0.1g/l；znso4·7h2o，0.1g/l；mnso4，0.5g/l；nacl，1g/l；cocl2，0.1g/l；feso4·7h2o，0.1g/l；na2moo4·2h2o，0.01g/l；kal(so4)2·12h2o，0.01g/l；h3bo3，0.01g/l；其余为水。

luria-bertani培养基为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，余量是水。

含磺胺类药物的水和含氟喹诺酮药物的水为在纯净的蒸馏水中添加磺胺类药物或氟喹诺酮药物。

实施例1

降低含人工合成抗菌药水体中生物毒性的方法，包括如下步骤：

(1)种子培养：将保藏编号为cgmcc5.776的黄孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中，在30℃培养5天；取150cm²面积的菌丝转入100ml马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基中在30℃，在160rpm搅拌下，培养48小时，得到黄孢原毛平革菌一级种子；

将保藏编号为cgmcc5.815的血红密孔菌(pycnoporussanguineus)在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中，在30℃培养6天；取150cm²面积的菌丝转入100ml马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基中在30℃，在160rpm搅拌下，培养48小时，得到血红密孔菌一级种子；

(2)降解液配制：将含磺胺甲恶唑的水和含诺氟沙星的水分别与发酵培养基混合配成降解液1和降解液2，使降解液1中磺胺甲恶唑的浓度为10mg/l，使降解液2中诺氟沙星的浓度为10mg/l；

(3)按比例，取步骤(1)获得的黄孢原毛平革菌的一级种子25ml干重条件下的浓度为0.15g/l和血红密孔菌的一级种子25ml干重条件下的浓度为0.15g/l，在8000rpm离心10min，弃上清，用部分降解液1将菌体重悬后，放入降解液1中，使总体积为500ml，在30℃，160rpm，混合发酵192h，8000rpm离心，收集上清，得上清1；

按比例，取步骤(1)获得的黄孢原毛平革菌的一级种子25ml干重条件下的浓度为0.15g/l和血红密孔菌的一级种子25ml干重条件下的浓度为0.15g/l，在8000rpm离心10min，弃上清，用部分降解液2将菌体重悬后，放入降解液2中，使总体积为500ml，在30℃，160rpm，混合发酵192h，8000rpm离心，收集上清，得上清2；

(4)将步骤(3)获得的上清1和上清2，分别与luria-bertani培养基按4:1比例混合，接入大肠杆菌(e.colidh5α)和枯草芽孢杆菌(b.subtilisrh33)，使大肠杆菌的初始光密度od600＝0.2，使枯草芽孢杆菌初始光密度od600＝0.2，监测大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在24h内od600变化。

本实施例的混菌在192h内完全去除水体中的人工合成抗菌药磺胺甲恶唑和诺氟沙星。

在含诺氟沙星转化产物的水体中大肠杆菌的od600随时间的增加而增加，15h达到最大od600为2.5，15h以后随时间增加而下降，24h时为2.3(图2a)。

在含磺胺甲恶唑转化产物的水体中大肠杆菌的od600随时间的增加而增加，15h达到最大od600为3.0，15h以后随时间增加而保持不变，24h时依然是3.0(图2b)。

在含诺氟沙星转化产物的水体中枯草芽孢杆菌的od600随时间的增加而增加，12h达到最大od600为2.2，15h以后随时间增加而下降，24h时为1.5(图2c)。

在含磺胺甲恶唑转化产物的水体中枯草芽孢杆菌的od600随时间的增加而增加，9h达到最大od600为2.0，9h以后随时间增加而逐渐减小，24h时为1.65(图2d)。

实施例2

降低含人工合成抗菌药水体中生物毒性的方法，包括如下步骤：

(1)种子培养：将保藏编号为cgmcc5.776的黄孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中，在28℃培养6天；取150cm²面积的菌丝转入100ml马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基中在28℃，在160rpm搅拌下，培养50小时，得到黄孢原毛平革菌一级种子；

将保藏编号为cgmcc5.815的血红密孔菌(pycnoporussanguineus)在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中，在28℃培养7天；取150cm²面积的菌丝转入100ml马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基中在28℃，在160rpm搅拌下，培养50小时，得到血红密孔菌一级种子；

(2)降解液配制：将含磺胺异恶唑的水和含诺氟沙星的水分别与发酵培养基混合配成降解液1和降解液2，使降解液1中磺胺异恶唑的浓度为5mg/l，使降解液2中诺氟沙星的浓度为5mg/l；

(3)按比例，取步骤(1)获得的黄孢原毛平革菌的一级种子15ml干重条件下的浓度为0.1g/l和血红密孔菌的一级种子15ml干重条件下的浓度为0.1g/l，在6000rpm离心13min，弃上清，用部分降解液1将菌体重悬后，放入降解液1中，使总体积为500ml，在28℃，150rpm，混合发酵180h，6000rpm离心，收集上清，得上清1；

按比例，取步骤(1)获得的黄孢原毛平革菌的一级种子15ml干重条件下的浓度为0.1g/l和血红密孔菌的一级种子15ml干重条件下的浓度为0.1g/l，在6000rpm离心13min，弃上清，用部分降解液2将菌体重悬后，放入降解液2中，使总体积为500ml，在28℃，150rpm，混合发酵180h，6000rpm离心，收集上清，得上清2；

(4)将步骤(3)获得的上清1和上清2，分别与luria-bertani培养基按4:1比例混合，接入大肠杆菌(e.colidh5α)和枯草芽孢杆菌(b.subtilisrh33)，使大肠杆菌的初始光密度od600＝0.2，使枯草芽孢杆菌初始光密度od600＝0.2，监测大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在24h内od600变化，od600与含人工合成抗菌药水体中生物毒性成反比。

实验证明，本实施例的效果与实施例1相似。

实施例3

降低含人工合成抗菌药水体中生物毒性的方法，包括如下步骤：

(1)种子培养：将保藏编号为cgmcc5.776的黄孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中，在35℃培养4天；取150cm²面积的菌丝转入100ml马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基中在35℃，在160rpm搅拌下，培养45小时，得到黄孢原毛平革菌一级种子；

将保藏编号为cgmcc5.815的血红密孔菌(pycnoporussanguineus)在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中，在35℃培养5天；取150cm²面积的菌丝转入100ml马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基中在35℃，在160rpm搅拌下，培养45小时，得到血红密孔菌一级种子；

(2)降解液配制：将含磺胺甲恶唑的水和含环丙沙星的水分别与发酵培养基混合配成降解液1和降解液2，使降解液1中磺胺甲恶唑的浓度为2mg/l，使降解液2中环丙沙星的浓度为2mg/l；

(3)按比例，取步骤(1)获得的黄孢原毛平革菌的一级种子20ml干重条件下的浓度为0.09g/l和血红密孔菌的一级种子20ml干重条件下的浓度为0.09g/l，在7000rpm离心15min，弃上清，用部分降解液1将菌体重悬后，放入降解液1中，使总体积为500ml，在35℃，200rpm，混合发酵200h，7000rpm离心，收集上清，得上清1；

按比例，取步骤(1)获得的黄孢原毛平革菌的一级种子20ml干重条件下的浓度为0.09g/l和血红密孔菌的一级种子20ml干重条件下的浓度为0.09g/l，在7000rpm离心15min，弃上清，用部分降解液2将菌体重悬后，放入降解液2中，使总体积为500ml，在35℃，200rpm，混合发酵200h，7000rpm离心，收集上清，得上清2；

(4)将步骤(3)获得的上清1和上清2，分别与luria-bertani培养基按4:1比例混合，接入大肠杆菌(e.colidh5α)和枯草芽孢杆菌(b.subtilisrh33)，使大肠杆菌的初始光密度od600＝0.2，使枯草芽孢杆菌初始光密度od600＝0.2，监测大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在24h内od600变化，od600与含人工合成抗菌药水体中生物毒性成反比。

实验证明，本实施例的效果与实施例1相似。

对比例1

(1)将保藏编号为cgmcc5.776的黄孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中，在30℃培养5天；取150cm²面积的菌丝转入100ml马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基中在30℃，在160rpm搅拌下，培养48小时，得到黄孢原毛平革菌一级种子；

(2)降解液配制：将含磺胺甲恶唑的水和含诺氟沙星的水分别与发酵培养基混合配成降解液1和降解液2，使降解液1中磺胺甲恶唑的浓度为10mg/l，使降解液2中诺氟沙星的浓度为10mg/l；

(3)按比例，取步骤(1)获得的黄孢原毛平革菌的一级种子25ml干重条件下的浓度为0.15g/l，在8000rpm离心10min，弃上清，用部分降解液1将菌体重悬后，放入降解液1中，使总体积为500ml，在30℃，160rpm，混合发酵192h，8000rpm离心，收集上清，得上清1；

按比例，取步骤(1)获得的黄孢原毛平革菌的一级种子25ml干重条件下的浓度为0.15g/l，在8000rpm离心10min，弃上清，用部分降解液2将菌体重悬后，放入降解液2中，使总体积为500ml，在30℃，160rpm，混合发酵192h，8000rpm离心，收集上清，得上清2；

(4)将步骤(3)获得的上清1和上清2，分别与luria-bertani培养基按4:1比例混合，接入大肠杆菌(e.colidh5α)和枯草芽孢杆菌(b.subtilisrh33)，使大肠杆菌的初始光密度od600＝0.2，使枯草芽孢杆菌初始光密度od600＝0.2，监测大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在24h内od600变化。

黄孢原毛平革菌在192h内去除63.2％磺胺甲恶唑，73.1％的诺氟沙星。

对比例2：

(1)将保藏编号为cgmcc5.815的血红密孔菌(pycnoporussanguineus)在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中，在30℃培养6天；取150cm²面积的菌丝转入100ml马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基中在30℃，在160rpm搅拌下，培养48小时，得到血红密孔菌一级种子；

(2)降解液配制：将含磺胺甲恶唑的水和含诺氟沙星的水分别与发酵培养基混合配成降解液1和降解液2，使降解液1中磺胺甲恶唑的浓度为10mg/l，使降解液2中诺氟沙星的浓度为10mg/l；

(3)按比例，取步骤(1)获得的黄孢原毛平革菌的一级种子25ml干重条件下的浓度为0.15g/l和血红密孔菌的一级种子25ml干重条件下的浓度为0.15g/l，在8000rpm离心10min，弃上清，用部分降解液1将菌体重悬后，放入降解液1中，使总体积为500ml，在30℃，160rpm，混合发酵192h，8000rpm离心，收集上清，得上清1；

按比例，取步骤(1)获得的黄孢原毛平革菌的一级种子25ml干重条件下的浓度为0.15g/l和血红密孔菌的一级种子25ml干重条件下的浓度为0.15g/l，在8000rpm离心10min，弃上清，用部分降解液2将菌体重悬后，放入降解液2中，使总体积为500ml，在30℃，160rpm，混合发酵192h，8000rpm离心，收集上清，得上清1；

(4)将步骤(3)获得的上清1和上清2，分别与luria-bertani培养基按4:1比例混合，接入大肠杆菌(e.colidh5α)和枯草芽孢杆菌(b.subtilisrh33)，使大肠杆菌的初始光密度od600＝0.2，使枯草芽孢杆菌初始光密度od600＝0.2，监测大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在24h内od600变化。

血红密孔菌在192h内完全去除水体中的人工合成抗菌药磺胺甲恶唑和诺氟沙星。

在含诺氟沙星转化产物的水体中大肠杆菌的od600随时间的增加而增加，12h达到最大od600为2.0，12h以后随时间增加而下降，24h时为1.72。

在含磺胺甲恶唑转化产物的水体中大肠杆菌的od600随时间的增加而增加，9h达到最大od600为2.38，9h以后随时间增加od600逐渐减小，24h时依然是2.03。

在含诺氟沙星转化产物的水体中枯草芽孢杆菌的od600随时间的增加而增加，15h达到最大od600为1.86，15h以后随时间增加而下降，24h时为1.03。

在含磺胺甲恶唑转化产物的水体中枯草芽孢杆菌的od600随时间的增加而增加，9hod600为1.29，24h时为1.38。

高效液相色谱所用色谱柱为c18色谱柱(250×4.6mm,5μm)，所用仪器为waterse2695alliancehplc和2489uv/vis检测器，磺胺甲恶唑检测波长为265nm，诺氟沙星检测波长为278nm。检测条件为：色谱柱温度30℃，进样体积50μl，流速1ml·min^-1。流动相组成：40％乙腈和60％水(含0.1％甲酸)。