专利名称：一种纤维素戊糖中温降解产氢菌的分离方法
技术领域：
本发明涉及一种产氢菌的分离方法。
背景技术：
作物秸杆是世界上农业生产的主要副产品之一，也是草食动物最丰富的饲料来源之一，同时也是一种潜在的非竞争性资源，具有数量大、分布广、种类多的特点。全世界每年秸杆的总产量为29亿多吨，仅有10°/Γ20%作为草食家畜的饲料或其他用途，剩余的80°/Γ90%直接还田、腐烂或被焚烧掉，这样不仅造成了巨大的资源浪费，还造成了严重的环境污染。通过瘤胃微生物的发酵，反刍动物能消化植物细细菌产生的纤维素酶大多结合在细胞膜上，所以细菌细胞需要吸附在纤维素材料上才能起作用，生产上使用很不方便，而且 酶的分离提取也较困难，经济效益不高。近二、三十年来，在纤维素酶的组成及作用机制、降解纤维素菌株的选育、纤维素酶合成的控制和调节以及纤维素酶的应用等诸多方面都取得了很大的发展。但是，由于目前已有的纤维素酶的酶解效率普遍较低，远不及淀粉酶和蛋白酶，从而很大程度上影响了纤维素酶的大量生产和广泛应用。因此，进一步寻找和开发高效纤维素降解菌，并不断改善和优化其培养条件，是纤维素资源能否高效利用的关键。目前大多数产氢菌都是在高温下分离，且分离出来的产氢菌不能直接利用纤维素进行产氢的问题。分离出的菌种不仅可以进行戊糖发酵且可在中温情况下直接利用纤维素产氢节省能耗。
发明内容
本发明的目的是解决目前大多数产氢菌都是在高温下分离，且分离出来的产氢菌不能直接利用纤维素进行产氢的问题。而提供一种纤维素戊糖中温降解产氢菌的分离方法。本发明的一种纤维素戊糖中温降解产氢菌的分离方法，是通过以下步骤实现一、取菌源进行培养，得悬浊液；二、取步骤一得到的悬浊液以体积百分比为1%的接种量接种于以葡萄糖为碳源的液体培养基中，在37°c培养箱中培养4飞d,得菌悬液A ;三、以结晶纤维素为底物，在以纤维素为碳源的液体培养基初始PH为5. 5^7. 5，温度为37°C的条件下对菌悬液A进行厌氧富集培养7d ;四、然后取富集培养后的菌悬液B按体积百分比为10%的接种量接种于以纤维素为碳源的液体培养基中继续在PH为5. 5^7. 5，温度为37°C的条件下富集培养2 3d ;五、重复步骤四3飞次，得菌悬液B ;六、取步骤五得到的菌悬液B用无菌水按10' 10_2、10' IO-4和10_5的倍数进行稀释，将10_5倍数稀释后的菌悬液B按10%的接种量接种于PH为5. 5^7. 5的微晶纤维素固体培养基中，在37°C培养箱中培养至出现透明圈；七、在无菌环境下，用氮气针挑取一个的步骤六中透明圈直径为6 10mm的菌落至以戊糖为碳源的液体培养基中，在37°C培养箱中培养f 3d ;八、重复步骤六至步骤七5次，即完成纤维素戊糖中温降解产氢菌的分离；其中，步骤一中所述的菌源为牛瘤胃内含物。本发明的有益效果
本发明分离纤维素戊糖中温产氢菌的方法能在中温下分离，且分离出的产氢菌不仅能利用纤维素发酵产氢还可用于戊糖发酵产氢。目前已知的纤维素降解菌多为高温菌，耗能较高，不利于产业化，而中温菌的成功分离为纤维素类废弃物降解利用的产业化实现奠定了基础。木糖作为木质纤维素原料水解产物中含量很丰富的一种单糖，主要是由半纤维素水解生成，含量可达植物纤维素水解糖类的35%以上，在有些原料中甚至超过了葡萄糖的含量。因此是否能够利用木糖是利用木质纤维素的关键。
图I为筛选所得降解木质纤维素戊糖中温产氢菌的透射电镜具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式降解木质纤维素戍糖中温产氢菌的筛选方法按以下步骤实现一、取菌源进行培养，得悬浊液；二、取步骤一得到的悬浊液以体积百分比为1% 的接种量接种于以葡萄糖为碳源的液体培养基中，在37°c培养箱中培养4飞山得菌悬液A ;三、以结晶纤维素为底物，在以纤维素为碳源的液体培养基初始pH为5. 5^7. 5，温度为37°C的条件下对菌悬液A进行厌氧富集培养7d;四、然后取富集培养后的菌悬液B按体积百分比为10%的接种量接种于以纤维素为碳源的液体培养基中继续在pH为5. 5^7. 5，温度为37°C的条件下富集培养2 3d ;五、重复步骤四3飞次，得菌悬液B ;六、取步骤五得到的菌悬液B用无菌水按10'10_2、10_3、10_4和10_5的倍数进行稀释，将10_5倍数稀释后的菌悬液B按10%的接种量接种于pH为5. 5^7. 5的微晶纤维素固体培养基中，在37°C培养箱中培养至出现透明圈；七、在无菌环境下，用氮气针挑取一个的步骤六中透明圈直径为6 10_的菌落至以戊糖为碳源的液体培养基中，在37°C培养箱中培养f 3d;八、重复步骤六至步骤七5次，即完成纤维素戊糖中温降解产氢菌的分离；其中，步骤一中所述的菌源为牛瘤胃内含物。本实施方式分离纤维素戊糖中温产氢菌的方法能在中温下分离，且分离出的产氢菌不仅能利用纤维素发酵产氢还可用于戊糖发酵产氢。目前已知的纤维素降解菌多为高温菌，耗能较高，不利于产业化，而中温菌的成功分离为纤维素类废弃物降解利用的产业化实现奠定了基础。木糖作为木质纤维素原料水解产物中含量很丰富的一种单糖，主要是由半纤维素水解生成，含量可达植物纤维素水解糖类的35%以上，在有些原料中甚至超过了葡萄糖的含量。因此是否能够利用木糖是利用木质纤维素的关键。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中所述的取菌源进行培养是指将菌源放入装有玻璃珠的灭菌血清瓶内，在无菌状态下加入厌氧无菌水，再向灭菌血清瓶中通氮气5min后，将灭菌血清瓶进行密封，并放入恒温摇床中，在温度为37°C，转速为140r/min的条件下培养6 8h ;其中菌源与厌氧无菌水的体积比为I :5。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤一和步骤三中所述的以葡萄糖为碳源的液体培养基按重量份数是由I份氯化铵、I份氯化钠、3份磷酸氢二钾、I. 5份磷酸二氢钾、O. 7份半胱氨酸、O. 2份硫酸镁、O. 2份氯化钾、2份酵母提取物、O. 5份维生素，O. 5份微量元素，O. 05份质量百分含量为O. 01%的刃天青和10份的葡萄糖组成的。其它与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤五中所述的微晶纤维素培养基是由微晶纤维素和琼脂粉组成；其中，微晶纤维素浓度为5g/L，琼脂粉浓度为20g/L。其它与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至四之一不同的是步骤五中所述的微晶纤维素液体培养基按重量份数是由I份氯化铵、I份氯化钠、3份磷酸氢二钾、I. 5份磷酸二氢钾、O. 7份半胱氨酸、O. 2份硫酸镁、O. 2份氯化钾、2份酵母提取物、O. 5份维生素，O. 5份微量元素，O. 05份质量百分含量为O. 01%的刃天青和5份的微晶纤维素组成的。其它与具体实施方式
一至四之一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤一和步 骤六中所述的以戊糖为碳源的液体培养基按重量份数是由I份氯化铵、I份氯化钠、3份磷酸氢二钾、I. 5份磷酸二氢钾、O. 7份半胱氨酸、O. 2份硫酸镁、O. 2份氯化钾、2份酵母提取物、O. 5份维生素，O. 5份微量元素，O. 05份质量百分含量为O. 01%的刃天青和5份的戊糖组成的。其它与具体实施方式
一至五之一相同。通过以下试验验证本发明的效果本试验的一种纤维素戊糖中温降解产氢菌的分离方法按以下步骤实现一、将10. Og新鲜牛瘤胃内含物放入装有细小玻璃珠的250mL灭菌血清瓶中，在无菌状态下，加入50mL厌氧无菌水，通纯度为99. 99%的氮气5min后密封灭菌血清瓶，并放入恒温摇床中，在温度为37°C，转速为140r/min的条件下培养8h ;得悬浊液A ;二、取IOmL步骤一得到的得悬浊液A放入以葡萄糖为碳源的液体培养基中，在37°C培养箱中培养6d，得菌悬液B ;三、以结晶纤维素为底物，在培养基初始pH为5. 5、6、6. 5、7和7. 5的条件下对菌悬液B进行厌氧富集培养7d ;四、然后取5mL富集培养后的菌悬液B放入50mL以纤维素为碳源的液体培养基继续富集培养疒3d ;五、重复步骤四4次，得菌悬液；六、取步骤五得到的菌悬液用无菌水按10'10_2、10_3、10_4和10_5倍数依次进行稀释，取10_5倍数稀释后的菌悬液ImL分别放入为pH为5. 5、6、6. 5、7和7. 5的5mL的微晶纤维素固体培养基中，在37°C培养箱中培养至出现透明圈；七、在无菌环境下，用氮气针挑取一个的步骤六中直径为IOmm的透明圈至戊糖液体培养基中，在70°C下水浴处理5min，然后将固体尽量碾碎后在37°C培养箱中培养3d，检测液体培养基中的气相，有氢气产生的即为目的细菌；八、重复步骤六至步骤七5次，即完成纤维素戊糖中温降解产氢菌的分离。本试验的牛瘤胃内含物取自哈尔滨畜牧厂。本试验的微晶纤维素固体培养基是由浓度为5g/L的微晶纤维素浓度和浓度为20g/L的琼脂粉组成。本试验的以葡萄糖为碳源的液体培养是由IOg的葡萄糖、I. Og的氯化铵、I. Og的氯化钠、3g的磷酸氢二钾、3g的磷酸二氢钾、O. 7g的半胱氨酸、O. 2g的氯化镁、O. 2g的氯化钾、2g的酵母提取物、ImL的维生素、ImL的微量元素、3 4滴浓度为O. 01% (w/v)的刃天青组成的。本试验的以戊糖为碳源的液体培养是由5g的戊糖、I. Og的氯化铵、I. Og的氯化钠、3g的磷酸氢二钾、3g的磷酸二氢钾、O. 7g的半胱氨酸、O. 2g的氯化镁、O. 2g的氯化钾、2g的酵母提取物、ImL的维生素、ImL的微量元素、3 4滴浓度为O. 01% (w/v)的刃天青组成的。本试验分离的纤维素戊糖中温降解菌通过原子力显微镜照片和透射电镜照片表述菌体形态。如图I所示，纤维素戊糖中温降解菌为革兰氏阳性菌，细菌呈球星或卵圆形，在液体培养基中成短链，有时以鞭毛运动，无明显荚膜。本试验中筛选所得的纤维素戊糖中温降解菌在厌氧条件下取2. 5mL至50mL微晶纤维素液体培养基中，在37°C，140r/min条件 下培养一周，发酵2(T30h，累积产气量即达到最大值为130mL/L，且除该细菌除产生氢气与二氧化碳外无任何杂质气体，减免杂质气体去除步骤，且发酵温度为37°C减少工业能耗，进而为生物质制氢工业化奠定基础。
权利要求
1.一种纤维素戊糖中温降解产氢菌的分离方法，其特征在于纤维素戊糖中温降解产氢菌的分离方法是通过以下步骤实现一、取菌源进行培养，得悬浊液；二、取步骤一得到的悬浊液以体积百分比为1%的接种量接种于以葡萄糖为碳源的液体培养基中，在37°c培养箱中培养4飞d，得菌悬液A ;三、以结晶纤维素为底物，在以纤维素为碳源的液体培养基初始pH为5. 5^7. 5，温度为37°C的条件下对菌悬液A进行厌氧富集培养7d ;四、然后取富集培养后的菌悬液B按体积百分比为10%的接种量接种于以纤维素为碳源的液体培养基中继续在PH为5. 5^7. 5，温度为37°C的条件下富集培养2 3d ;五、重复步骤四3飞次，得菌悬液B ;六、取步骤五得到的菌悬液B用无菌水按10'10_2、10_3、10_4和10_5的倍数进行稀释，将.10_5倍数稀释后的菌悬液B按10%的接种量接种于pH为5. 5^7. 5的微晶纤维素固体培养基中，在37°C培养箱中培养至出现透明圈；七、在无菌环境下，用氮气针挑取一个的步骤六中透明圈直径为6 10mm的菌落至以戊糖为碳源的液体培养基中，在37°C培养箱中培养f3d ；八、重复步骤六至步骤七5次，即完成纤维素戊糖中温降解产氢菌的分离；其中，步骤一中所述的菌源为牛瘤胃内含物。
2.根据权利要求I所述的一种纤维素戊糖中温降解产氢菌的分离方法，其特征在于步骤一中所述的取菌源进行培养是指将菌源放入装有玻璃珠的灭菌血清瓶内，在无菌状态下加入厌氧无菌水，再向灭菌血清瓶中通氮气5min后，将灭菌血清瓶进行密封，并放入恒温摇床中，在温度为37°C,转速为140r/min的条件下培养6 8h ;其中菌源与厌氧无菌水的体积比为I :5。
3.根据权利要求I所述的一种纤维素戊糖中温降解产氢菌的分离方法，其特征在于步骤一和步骤三中所述的以葡萄糖为碳源的液体培养基按重量份数是由I份氯化铵、I份氯化钠、3份磷酸氢二钾、I. 5份磷酸二氢钾、O. 7份半胱氨酸、O. 2份硫酸镁、O. 2份氯化钾、2份酵母提取物、O. 5份维生素，O. 5份微量元素，O. 05份质量百分含量为O. 01%的刃天青和.10份的葡萄糖组成的。
4.根据权利要求I所述的一种纤维素戊糖中温降解产氢菌的分离方法，其特征在于步骤五中所述的微晶纤维素固体培养基是由微晶纤维素和琼脂粉组成；其中，微晶纤维素浓度为5g/L，琼脂粉浓度为20g/L。
5.根据权利要求I所述的一种纤维素戊糖中温降解产氢菌的分离方法，其特征在于步骤五中所述的微晶纤维素液体培养基按重量份数是由I份氯化铵、I份氯化钠、3份磷酸氢二钾、I. 5份磷酸二氢钾、O. 7份半胱氨酸、O. 2份硫酸镁、O. 2份氯化钾、2份酵母提取物、O. 5份维生素，O. 5份微量元素，O. 05份质量百分含量为O. 01%的刃天青和5份的微晶纤维素组成的。
6.根据权利要求I所述的一种纤维素戊糖中温降解产氢菌的分离方法，其特征在于步骤一和步骤六中所述的以戊糖为碳源的液体培养基按重量份数是由I份氯化铵、I份氯化钠、3份磷酸氢二钾、I. 5份磷酸二氢钾、O. 7份半胱氨酸、O. 2份硫酸镁、O. 2份氯化钾、2份酵母提取物、O. 5份维生素，O. 5份微量元素，O. 05份质量百分含量为O. 01%的刃天青和5份的戊糖组成的。
全文摘要
一种纤维素戊糖中温降解产氢菌的分离方法，它涉及一种中温产氢菌的分离方法。它解决了目前大多数产氢菌都是在高温下分离，且分离出来的产氢菌不能直接利用纤维素进行产氢的问题。其特征在于它是通过以下步骤实现1.菌悬液的制备；2菌悬液A的富集；3按不同pH值对菌悬液A进行选择性富集；4对不用pH下的富集液倍比稀释以微晶纤维素为底物进行滚管5挑取滚管中的透明圈至戊糖液体培养基培养6检测液体培养基中的气相，有氢气产生的即为目的细菌7重复步骤4到步骤6五次，即可分离。本发明分离纤维素戊糖中温产氢菌的方法能在中温下分离，且分离出的产氢菌不仅能利用纤维素发酵产氢还可用于戊糖发酵产氢。
文档编号C12N1/20GK102757927SQ20121027910
公开日2012年10月31日 申请日期2012年8月7日 优先权日2012年8月7日
发明者任南琪, 张璐, 邢德峰 申请人:哈尔滨工业大学