氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料-杯4芳烃复合物作为探针在细胞pH检测中的应用的制作方法

专利名称：氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料-杯4芳烃复合物作为探针在细胞pH检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料-杯4芳烃复合物在细胞pH检测中的应用。
背景技术：
正常细胞内pH的稳定与否对于细胞活性有着重要的作用，比如细胞的生长，凋亡，离子交换以及细胞内吞作用卜5。细胞内PH的 准确测量是研究细胞内pH与细胞活性之间关系的前提。细胞内PH的监测有很多方法，包括电化学6，NMR7,吸收光谱8和荧光探针分析法9。在所有这些方法中，荧光探针分析法在细胞监测方面有很好的时空分辨率。同时荧光技术对细胞活性的干扰很小，这将有利于细胞内信息的搜集。为了达到细胞监测的要求，荧光探针要有高选择性，亮度，水溶性，细胞渗透性，细胞存留性以及低毒性。目前为止，还没有哪个荧光探针可以同时满足这些标准。目前最有效的荧光探针是2' ,1' -二-(2-羧乙基)-5-(6)羧基荧光素(BCECF)1'已经被广泛用于细胞生物学。市场上可以购买到的乙酰甲酯化的BCECF可以分散到细胞中，并且会被内生的细胞酯酶水解成带4-5个负电荷的荧光染料，可以稳定存在于细胞中。BCECF的pKa值为7. 0，使得该探针可以检测细胞中近中性的PH值(6. 8-7. 4)11。尽管探针从细胞中的泄漏率已经可以得到控制，探针的泄漏仍然存在 ' 并且BCECF不适合用于响应pH为4. 5-5. 5酸性条件。为了克服这些问题，含有三个磺酸基团的8-羟基芘-1，3，6-三磺酸(HPTS)被合成出来12’13。含有三个或者四个阴离子的染料在生理条件下显示有好的细胞存留性。这种染料可以运用到很多细胞类型中去检测细胞质的PH与酸性细胞器的pH1415。HPTS58主要缺点是细胞渗透性比较差。一般情况下会借助显微注射、电穿孔和划痕荷载将HPTS探针染色到细胞中,但这些操作会影响到细胞内的正常活动16。氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料(Bodipy)类染料自1990年开始引起广泛关注17’18。Bodipy探针拥有很多独特的性质，包括对光稳定、荧光量子产率高以及光谱性质可调等。一些含胺基的Bodipy衍生物已经被用于监测细胞内的pH，这些化合物在细胞中一般以非质子化形式存在时，荧光较弱。当其官能团在酸性条件下质子化后荧光大大增强19。荧光强度对于PH的依赖性由多种机理产生，比如光诱导电子转移(PET)2°，光诱导分子内电荷转移(ICT)21和共振能量转移(RET)22。尽管关于Bodipy衍生物的文章有很多并且近年来增长速度很快，就我们所知，目前还没有介绍将Bodipy类荧光探针用于监测细胞内近中性pH的文章，这对于细胞内pH检测起着至关重要的作用。为了将Bodipy衍生物染料用作细胞内pH探针，我们事先研究了很多其他的染料。当PH传感器按照化学计量法I :1结合时，有效pH响应范围大约从pKa-Ι到pKa+1，所以染料的PKa值应该要接近718。氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料-杯4芳烃(Bodipy-Calix[4]arene)复合物是2001年文献报道的含有四个苯酹结构的pKa为6. 5的荧光染料，它的PH响应范围在11. 53-2. 53之间23。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料-杯4芳烃复合物在细胞PH检测中的应用，以填补细胞pH检测领域的空白。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下通过对氟化硼络合二卩比咯甲川突光染料-杯4芳烃(Bodipy-Calix[4]arene)复合物在细胞中的存留性以及对细胞的毒性进行了完整的实验和研究，发现Bodipy-Calix [4] arene复合物可作为探针应 用于细胞pH检测。具体的应用为先将细胞在IOmmX35mm的有盖培养皿中贴壁生长；再将培养皿中的培养基移除，加入I. 0mL,pH=7. 4的灭菌PBS缓冲溶液洗一次；然后加入I.
氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料-杯4芳烃复合物溶液，分别在4°C和20°C的条件下培养15min ;染色后，将氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料-杯4芳烃复合物溶液从培养皿中抽出，用PBS缓冲溶液小心清洗三次，通过检测荧光强度确定pH值。其中，所述的氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料-杯4芳烃复合物溶液按如下方法配制氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料-杯4芳烃复合物首先溶解在DMSO溶液中使浓度为I. OmM，之后加入pH7. 4的磷酸盐缓冲溶液(2mM NaH2PO4-IOmM Na2HPO4)稀释至终浓度为 10. O μ Mo有益效果I)由荧光照片中荧光强度大小的差异，可以观察出在细胞中pH较小时，荧光照片中荧光强度较强，随着细胞内pH的升高，荧光照片中荧光强度逐渐减弱。这种变化趋势与在均相溶液中测得的结果一致。这种由PH引起的细胞内荧光强度的变化反映了细胞中的PH的变化，从而可以监测细胞的早期凋亡。2)复合物探针对细胞的毒性较小，染色细胞培养24小时后并未出现大面积的凋亡现象，因此该探针可以应用在生物学实验当中。3)且该探针在细胞中的保留时间长，24小时后几乎没有染料外泄的情况，这利于对细胞进行长期的检测。4)细胞实验中的pH检测与溶液实验结果相符，细胞内pH值越低则荧光照片的亮度越大，这与预期现象是相同的。因而该探针可进一步探索应用在生物化学中，检测细胞内的pH,为研究细胞生命活动提供必要的信息。

4芳烃复合物作为探针在细胞pH检测中的应用的制作方法附图"/>
图I. (A)Bodipy-CalixMarene复合物在PBS溶液中的激发和荧光光谱(ρΗ7· 4)；(B)不同pH值条件下Bodipy-Calix [4] arene复合物的荧光光谱，pH分别为7. 86，7. 12，6.76，6. 32，5. 83，5. 42，4. 76，4. 13，3. 76，3. 38，3. 03。激发波长为 480nm。图2.在室温下用Bodipy-Calix[4]arene复合物(I μ M)染色IOmin后,细胞典型的(A)明场和(B)荧光成像图片，滤波片为475/515。图3.细胞在不同pH条件下典型的荧光成像(滤波片为475/515) :(Α)6. 76 ;(B) 7. 12 ； (C) 6. 76 ； (D)五个细胞平均荧光强度的统计条形图。
图4.用(A)Bodipy-Calix[4]arene (滤波片 475/515) (B)溶酶体红色荧光探针lyso-track red DN-99 (滤波片540/575)染色后细胞中酸性细胞器的典型的荧光成像图。图5.细胞用CFDA、BCECF和Bodipy-Calix [4] arene复合物染色后O小时和24小时后的荧光强度的比值，滤波片为475/515。图6.细胞的突光照片用 Bodipy-Calix [4] arene 复合物 and Hochest33342 双染后培养，(A) O小时和(B) 24小时，仅用Hochest33342染色；(C) O小时和(D) 24小时，滤波片为 355/420。图7.用 Bodipy-Calix[4]arene 复合 物 and Hochest33342 染色的细胞，凋亡前的荧光照片，滤波片355/420 (A)，475/515 (B)和明场照片(C);细胞凋亡后的荧光照片，355/420 (D)，475/515 (E)和明场照片(F)。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例I :Bodipy_Calix[4]arene 复合物的合成。(I)对叔丁基杯[4]芳烃脱叔丁基得到杯[4]芳烃将13. 3g (20mmol)对叔丁基杯[4]芳烃,9. 02g的苯酌·(96mmol)和14g的无水三氯化铝(105mmol)加入到125mL的甲苯溶剂中，氮气保护，室温下反应Ih后，将得到的反应液加入到250mL的O. 2M的盐酸溶液中，将有机相分离出来后，用旋转蒸发仪蒸掉甲苯。然后用甲醇氯仿重结晶，烘干得到无色晶体杯[4]芳烃4.5g (51%)。1HnmrgoomHz,⑶CI3)δ 10. 21 (S，4H, 0H)，7. 06 (d, 8H, J = 7. 5Hz, HAr)，6. 73 (t, 4H, J = 7. 5Hz, HAr)，4. 25 (br, 4H，ArCH2Ar)，3. 55 (br, 4H, ArCH2Ar)。(2)杯[4]芳烃的单甲酰化反应将杯[4]芳烃1.2g (2.8mmol)溶于30mL氯仿中，将溶液降温到零下15°C，然后很快地加入I, I- 二氯甲醚(O. 42g, 3. 4mmol)和四氯化锡。在室温下搅拌40min后，用水淬灭。将有机层分出来后用水洗3-4次，然后用无水硫酸钠干燥，最后将溶剂旋蒸出去。得到的油状混合物用石油醚氯仿=4:3过柱子。得到5-醛基杯[4]芳烃120mg，产率 9%O 1Hnmr(SoomHz1CDCI3) δ ο. 23 (b r, 3H, 0H), 7. 61 (s, 2H, ArH), 7. 10 (td, 4H, J =7. 1Hz, I. 6Hz, ArH)，7. 06 (d, 2H, J = 7. 8Hz, ArH)，6. 77 (t, 2H, J = 7. 5Hz, ArH)，6. 73 (t, H, J=7. 5Hz, ArH)，4. 29 (br, 4H, ArCH2Ar)，3. 60 (br, 4H, ArCH2Ar)。EI-MS 电子轰击质谱显示有452. 3的分子离子峰，与其分子质量452. 5基本一致，即得到目标产物5-醛基杯芳烃。(3) Bodipy-Calix [4] arene 复合物的合成将2，4- 二甲基批咯(O. 102g，0.69mmol) 和5_醛基杯[4]芳烃(O. 150g,0. 335mmol)加入到氮气保护的无水处理过的二氯甲烷(IOOmL)中，然后加入1_2滴的三氟乙酸，溶液由无色瞬间变为透明的淡黄色，在氮气氛围中室温搅拌3hs后，溶液变为透明的深黄色。然后加入四氯苯醌(O. 170g，0.69mmol)的二氯甲烷(44mL)溶液。溶液由深黄色立即变成不透明的深红色，继续搅拌30min。然后分别加入IOmL的三乙胺和三氟化硼乙醚，可以看到黑色溶液中的亮绿色荧光。反应IOhs后停止反应，用水洗4次(IOOmL),有机相用无水硫酸钠干燥，旋蒸后得到的混合产物用乙酸乙酯石油醚=5:1过柱子。得到Bodipy-Calix [4] arene 复合物 30mg，产率 20%。1H NMR (300MHz, CDCl3) δ :9. 74 (s, 4H, OH), 708-7. 04 (m, 4H, ArH)，6. 97 (dd, 2H, J = 4. 5Hz, I. 5Hz, ArH)，6. 92 (s, 2H, ArH)，6. 79-6. 68 (m，3H, ArH)，5. 85 (br, 2H, H, BODIPY)，3. 95 (br, 6H, ArCH2Ar)，2. 5 (s, 6H, CH3, BODIPY)，I. 31-1.25 (m, 3H, CH3, BODIPY), 0. 92-0. 81 (m, 3H, CH3, BODIPY)。核磁分析与文献报道23 相符。δ 3. 95是杯[4]芳烃上6个亚甲基上的氢，还有2个氢在核磁图谱上观察不出来。电喷雾电离质谱(Μ_)有669. 5的分子离子峰。电子轰击质谱有m/e670 (M+)的分子离子峰。实施例2 实验I.实验材料Bodipy-Calix[4]arene复合物在 本组实验室中合成23。2’，7’- 二 -(2_羧基乙基)-5(6)-羧基荧光素乙酸甲酯(BCECF AM)荧光探针，Lyso-Tracker Red DN-99溶酶体探针，羧基荧光素二醋酸酯琥珀酰亚胺酯(CFDA SE细胞增殖探针)和H0echst33342购于碧云天生物技术研究所(中国南通)。除非另外说明，其他的化学试剂均于Sigma-Aldrich试剂公司购买。HeLa细胞由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所提供。实验用水均为超纯水，所有缓冲溶液均进行过灭菌处理。2.细胞培养HeLa细胞在加入了 10%胎牛血清和1%的抗生素(青霉素/链霉素)的DMEM/高糖培养基中培养。所有细胞在含有5%C02且湿度适中，温度为37°C的培养箱中培养。3.荧光光谱突光发射以及激发光谱由含有96孔板的EnSpire酶标仪测得(Perkinelmer,美国)，Bodipy-Calix[4]arene复合物的工作液按照如下步骤配置Bodipy_Calix[4]arene复合物首先溶解在DMSO溶液中使浓度为l.OmM，之后加入不同pH值的磷酸盐缓冲溶液(PBS) (2mM NaH2PO4-IOmM Na2HPO4)稀释，最终溶液浓度为10. O μ M。光谱测量前混合溶液平衡反应5min。Bodipy-Calix [4] arene的激发和发射光谱在PBS缓冲溶液pH为7. 4的混合溶液中测得。4.用探针对细胞进行染色进行细胞染色实验之前，细胞在10mmX35mm的有盖培养皿中贴壁生长。先将培养皿中的培养基移除，加入I. OmL, pH=7. 4的灭菌PBS缓冲溶液洗一次。然后加入Bodipy-Calix [4] arene复合物染色液(I. OmL, I. O μ M),分别在4°C和20 °C的条件下培养15min。染色后，将Bodipy-Calix[4]arene溶液从培养皿中抽出，用PBS缓冲溶液小心清洗三次。而后拍摄荧光照片。5.荧光光谱和成像分析荧光成像使用倒置荧光显微镜(尼康，日本)和标准荧光滤光片组(ex/em355/420, 475/515, 540/575)获得。透射光和荧光成像通过冷却的使用NIS-Elements图像采集软件(尼康，日本)的C⑶显微镜用相机收集(尼康，Digital Sight DS-Qi 1MC,日本)。细胞的突光强度使用Image J software分析。6.活体pH调节和测量细胞中的pH值按照文献24，25报道的方法调节。在不含有氯离子的溶液中，细胞与O.IOmM的乌本苷共同培养30min，使得细胞基质中的钠离子浓度升至较高的水平。接着在不含有钠离子的林格氏溶液中培养，使得细胞内的钠离子浓度大于细胞外，从而使细胞内的氢尚子浓度升闻，pH值从大约7. 15下降至6. 55左右。而后加入含有IOOmM钠尚子而非钾离子的缓冲溶液，使得细胞内的PH值达到所需值。7.探针在细胞中存留将CFDASE溶在DMSO中配成浓度为I. OmM的溶液，用pH为7. 4的PBS缓冲溶液稀释到ΙΟμΜ。细胞在室温下用Bodipy-Calix[4]arene复合物和CFDA SE染色lOmin。染色结束后用PBS缓冲液(pH=7. 40)小心清洗三次，马上拍摄荧光照片。在培养皿中加入灭菌培养基I. OmL，在条件适宜培养箱中 培养24小时，拍摄另一组荧光照片。8.酸性溶酶体的追踪为了确定探针可以追踪细胞中的酸性溶酶体，细胞于37 °C下在含有50nMLyso-tracker Red的溶酶体的PBS缓冲溶液中培养60min。细胞用PBS缓冲溶液洗后再立即用Bodipy-Calix[4]arene复合物染色。9.细胞凋亡实验培养皿中密度合适的细胞首先在37°C含I μ g/ml Hoechst33342的PBS缓冲溶液中培养30min。随后用PBS缓冲溶液(pH=7. 40)小心清洗再用Bodipy-Calix [4] arene复合物对细胞进行染色。结果与讨论I.溶液中探针对pH的荧光响应和细胞染色文献报道在乙醇水(V: V=I: I)溶液中对该Bodipy-Cal ix [4] arene复合物的荧光光谱进行研究。最大激发和发射波长在490和509nm。但是对于该荧光探针在细胞分析中的应用，乙醇需要从水溶液中去掉。因此我们重新研究该探针在没有乙醇的PBS缓冲溶液中的荧光性质。图IA显示在pH为7. 4的PBS缓冲溶液中该Bodipy-Calix[4]arene复合物的最大激发和发射波长都发生了红移，分别为503和518nm。这种波长的细微变化可能由不同的水溶液环境引起。重要的是，发射波长与缓冲溶液的PH无关，而发射强度在很大的pH范围内，从3. 03到7. 86，受pH影响很大，如图1B。这些荧光性质使得该荧光探针监测细胞内微酸性和近中性的PH值变为可能。向溶液中加入不同的一价或者二价金属离子不会影响该探针的荧光强度，这意味着该探针对氢离子的选择性远远高于金属离子。2.用探针对细胞进行染色。为了将Bodipy-Calix[4]arene复合物染色到细胞中，在室温下将细胞首先用含有I μ M探针的pH为7. 4的PBS缓冲溶液培养IOmin。典型的明场和荧光成像如图2所示。成像图片(细胞均呈现有绿色突光)显示Bodipy-Calix [4] arene复合物可以均勻地分散到细胞中。为了明确染色过程，染色时间和温度有所不同。在室温下染色IOmin后可以观察到稳态最大荧光强度，表明在细胞内外探针有个平衡存在。保持染色时间不变升高染色温度到37°C并没有很明显地增强荧光强度。因此我们再接下来的实验中，将染色定为室温下保持lOmin。当温度降到4°C的条件下细胞膜上的转运蛋白失活，但是在此情况下细胞仍然可以被染料染色，说明该染料进入细胞的过程不是通过膜蛋白的主动运输，而是通过内吞的作用。为了确认探针染色到细胞中，向培养皿中加入5. OmL, O. 25%的胰酶溶液，将细胞在培养箱中培养30min以消耗细胞膜上的蛋白。细胞仍然显示荧光表明探针不只是吸附在细胞膜上。3.细胞内pH响应。pKa值为6. 5的探针被认为可以对近中性细胞质的pH的微小波动产生响应。在细胞染色前细胞内的PH调节到7. 86到6. 32的范围。图3是典型的荧光成像和荧光强度的统计条状图。与预期的一致，我们观察到荧光强度逐渐增强(图3中细胞pH为6. 32时绿色荧光最强，PH为7. 86时细胞绿色荧光最弱)，证明探针可以监测细胞内近中性的pH。就我们所知，Bodipy-Calix[4]arene复合物是第一例可以监测细胞内近中性环境下pH变化的Bodipy类化合物。除了可以监测细胞质中的pH,含有 Bodipy结构的Bodipy-Calix[4]arene复合物还可以追踪细胞内酸性的细胞器。为了证明研究的准确性，我们用溶酶体(lysosome)红色荧光探针和Bodipy-Calix[4]arene复合物对细胞进行双染。只是将CXD的暴露时间缩短以便观察到酸性环境。如图4所示，细胞中溶酶体探针的红色荧光与复合物探针的绿色荧光较亮的位置相同(左侧红色荧光为溶酶体探针右侧绿色荧光为复合物探针)。这种一致性表明我们的Bodipy-Calix[4]arene复合物也可以追踪到细胞中酸性的溶酶体。使用一种探针同时监测细胞内酸性和近中性的pH，如溶酶体和细胞质内pH的变化，可以促进生物学研究的发展。4.探针在细胞内的存留细胞内pH探针的目标是为研究细胞凋亡提供细胞内的pH变化，细胞凋亡过程通常比较慢。因此，荧光探针需要一段时间内在细胞中保持荧光强度不变。然后，尽管在防止荧光PH探针的泄漏方面有很多进展，最常用的细胞内pH探针BCECF，当其进入细胞后，在室温下10-25min的时间内都会外泄10%左右，在37°C的条件下则会外泄更多10。本文研究了 24小时内Bodipy-Calix[4]arene复合物从细胞外泄的程度。在试验中，细胞被分成三组，分别用CFDA SE, Bodipy-Calix[4]arene复合物和BCECF染色。染色后记录细胞的荧光强度。然后在适宜的培养基中培养24小时，再拍摄荧光照片。计算出在培养基培养24小时前后荧光强度的比值，如图5所示。CFDASE探针染色的细胞荧光强度改变约为原始强度的46%，说明细胞进行了一次分裂。相较于CFDA SE探针染色的细胞，BCECF探针染色的细胞的荧光强度大大降低，与文献报道的数据一致。然而，有趣的是Bodipy-Calix[4]arene复合物染色的细胞在培养基中培养后的荧光强度变化与CFDA SE探针染色的细胞一致。这些数据表明我们的Bodipy-Calix[4]arene复合物在细胞中有很好的存留性。Bodipy-Calix [4] arene探针在细胞内的存留机理还不是非常明确。在近中性的细胞液中，Bodipy-Calix[4]arene探针只失掉一个电子带一个单位负电荷，电荷少于带四个单位负电荷的BCECF。荧光探针上更多的负电荷不利于探针在细胞中的存留。因此Bodipy结构可能是该探针在细胞中存留的关键因素。据报道，在37°C新鲜培养基中培养72小时后，Bodipy衍生物8-氯甲基-4，4- 二氟-1，3，5，7-四甲基-Bodipy(CMFDA)仍能保持很强的突光强度。将CMFDA结构上的氯原子用四个苯酹结构取代,形成Bodipy-Calix[4]arene复合物，也许可以进一步增加其在细胞中的存留时间。我们将对Bodipy-Calix[4]arene复合物进行结构修饰以便深入研究其机理。5.探针的细胞毒性
荧光探针的细胞毒性对于该探针在细胞的凋亡研究实验中也是很重要的。如果探针在细胞中引起细胞逐渐凋亡，细胞内的PH将会发生变化从而干扰研究。我们用Hoechst33342探针来表征细胞毒性。当细胞凋亡发生时，染色体中的DNA结构发生变化引起更多的Hoechst33342产生更强的荧光27。我们在实验中，将Bodipy-Calix[4]arene复合物与Hoechst33342双染的细胞作为试验组，对照组中细胞仅用Hoechst33342染色。当细胞在新鲜的培养基中培养24个小时后，记录下细胞的荧光如图6。相对于对照组(D的蓝色荧光没有比C强)，试验组(B的蓝色荧光没有比A强)的细胞培养24小时前后蓝色荧光没有增强。表明Bodipy-CaliX[4]arene复合物在细胞中没有引起任何细胞凋亡。因此我们的荧光探针可以在24个小时内提供 稳定的荧光，这将有利于研究细胞凋亡实验。用Bodipy-Calix[4]arene 复合物 and Hochest33342 双染后培养，(A)O 小时和(B)24 小时6.细胞凋亡响应细胞凋亡伴随着细胞内酸化达到O. 3-0. 4pH28。因为我们的探针可以对细胞内近中性至酸性的环境进行检测，我们将之运用到追踪细胞凋亡过程的研究中。细胞凋亡早期的模型通过将细胞浸泡在低浓度(20μΜ)的双氧水中建立得到，据报道在3小时之内便会引起细胞凋亡29。在用双氧水之前，同时使用Bodipy-Calix[4]arene复合物与Hoechst33342对细胞进行染色。图7是开始与I小时后细胞的荧光成像(上图为细胞凋亡前的荧光照片，左侧蓝色荧光为Hoechst33342探针，中间绿色为复合物探针，右侧为明场照片；下图为细胞凋亡后的荧光照片，左侧蓝色荧光(增强)为Hoechst33342探针，中间绿色(荧光增强)为复合物探针，右侧为明场照片)。Hoechst33342探针的蓝色荧光明显增强，表示细胞确实已经逐渐凋亡。同时与所预期的相同,Bodipy-Calix[4]arene复合物探针染色的细胞绿色荧光也相应增强。有趣的是，明场成像显示在细胞早起凋亡阶段细胞的形态没有发生变化。这些现象表明我们的探针可以对细胞近中性范围的PH的很小的变化发生响应，这种很小的变化伴随着早期的细胞凋亡。因此,Bodipy-Calix[4]arene复合物可以用来研究细胞内PH与早起细胞凋亡的联系。结论总而言之，Bodipy_Calix[4]arene复合物是第一个可以用于细胞内近中性pH检测的Bodipy类pH荧光探针。该探针具有好的细胞渗透性，很好的细胞存留性以及小的细胞毒性，使其能够在细胞中保持荧光超过24小时。所有这些特性使得该探针在细胞凋亡的早期便能精确响应很小的PH变动，帮助我们可以很好的理解细胞内pH与细胞凋亡的联系。文献(l)Roos, A. ;Boron, ff. F. Physiol. Rev. 1981, 61, 296-434.(2)Perezsala, D. ; Colladoescobar, D. ;Mollinedo, F. J. Biol.Chem. 1995，270，6235-6242.(3) Humez, S. ; Monet, M. ; van Coppenol le, F. ; Delcourt, P. ; Prevarskaya, N.Am. J. Physiol. -Cell Physiol.2004，287，C1733-C1746.(4) Varadi, A. ; Rutter, G. A. Endocrinology 2004, 145, 4540-4549.(5) Gottl ieb, R. A. ; Nordberg, J. ; Skowronski, E. ; Babio r, B. M. Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A. 1996，93，654-658.(6) Al -Hi 11 i , S. M. ; Wi 11 ander，M. ; Ost, A. ; Stralfors, P. J. Appl.Phys. 2007，102，5.(7)Gillies, R. J. ;Ugurbilj K. ;Denhollanderj J. A. ; Shulmanj R. G. Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America-BiologicalSciencesl981，78，2125-2129.(8) Chai I let, J. R. ; Ams Ierj K. ;Boron, W. F. Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. 1986,83，522—526.(9) Hanj J. Y. ; Burgess , K. Chem. Rev. 2010，110，2709-2728.(IO)Rinkj T. J. ;Tsienj R. Y. ;Pozzan, T. J. Cell Biol. 1982，95，189—196.(Il)Paradisoj A. M. ; Tsienj R. Y. ;Machenj T. E. Nature 1987，325，447-450.(12) Zhang Z，S. W. Anal. Chim. Acta 1984，160，47.(13) Wolfbeisj 0. S. ; Fur I inger, E. ; Kroneisj H. ; Marsonerj H. FreseniusZeitschrift Fur Analytische Chemie 1983，314， 119-124.(14)Giuliano，K. A. ;Gillies，R. J. Anal. Biochem. 1987，167，362-371.(15) Overly, C. C. ; Lee, K. D. ;Berthiaumej E. ;Hollenbeck, P. J. Proc. Natl. Acad.Sci. U. S. A. 1995，92，3156-3160.(16) Pena, A. ; Ramirez, J. ; R o s a s , G . ; Calahorraj M.J. Bacteriol. 1995，177，1017-1022.(17) Treibsj A. ; Kreuzerj F. H. Annalen Der Chemie-Justus Liebig1968，718，208-+·(18) Boensj N. ; Leenj V. ; Dehaenj W. Chem. Soc. Rev. , 41, 1130-1172.(19) Uranoj Y. ; Asanumaj D. ; Hama, Y. ; Koyamaj Y. ; Barrett, T. ; Kamiyaj M. ; Nagano，T. ; Watanabej T. ; Hasegawaj A. ; Choykej P. L. ; Kobayashij H. Nat. Med. 2009，15，104-109.(20) Kimj H. J. ;Kim，J. S. Tetrahedron Lett. 2006，47，7051-7055.(21) Qinj W. W. ; Baruahj M. ; Sliwaj M. ; Van der Auweraerj M. ;De Borggraevej W.M. ; Beljonnej D. ; Van Averbekej B. ; Boensj N. J. Phys. Chem. A 2008，112，6104-6114.(22) Coskunj A. ; Akkayaj E. U. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128，14474-14475.(23) Bakij C. N. ; Akkayaj E. U. J. Org. Chem. 2001，66，1512-1513.(24) Paradisoj A. M. ; Tsienj R. Y. ; Machenj T. E. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America-Biological Sciences1984，81，7436-7440.(25) Llopisj J. ;McCaffery, J. M. ;Miyawakij A. ;Farquharj M. G. ; Tsienj R. Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998，95，6803-6808.(26) Hodgkin, P. D. ; Lee，J. H. ; Lyons, A. B. J. Exp. Med. 1996，184，277-281.(27) Alien，S. ; Sotos, J. ; Syltej M. J. ; Czuprynskij C. J. Clin. Diagn. Lab.Immunol. 2001，8，460-464.(28) Lagadic-Gossmannj D. ; Hu c , L. ; Lecureurj V. Cell DeathDiffer. 2004，11，953-961.(29) Whi ttemore, E. R. ; Looj D. T. ; Watt, J. A. ; Cotmanj C. W. Neuroscience1995，67，921-932.
权利要求
1.氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料-杯4芳烃复合物作为探针在细胞pH检测中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，先将细胞在IOmmX35mm的有盖培养皿中贴壁生长；再将培养皿中的培养基移除，加入I. OmL, pH=7. 4的灭菌PBS缓冲溶液洗一次；然后加入I. OmL, I. O μ M的氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料-杯4芳烃复合物溶液，分别在4°C和20°C的条件下培养15min ;染色后，将氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料-杯4芳烃复合物溶液从培养皿中抽出，用PBS缓冲溶液小心清洗三次，通过检测荧光强度确定pH值。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料-杯4芳烃复合物溶液按如下方法配制氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料-杯4芳烃复合物首先溶解在DMSO溶液中使浓度为I. OmM，之后加入磷酸盐缓冲溶液稀释至终浓度为 10. O μ Mo
全文摘要
本发明公开了氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料-杯4芳烃复合物作为探针在细胞pH检测中的应用。这种化合物具有很好的细胞渗透性，并且可以同时检测细胞内近中性和酸性范围内的pH变化。由于探针在细胞中很好的存留性以及很小的毒性，它在细胞中可以24小时提供稳定的荧光，这为准确监测细胞内的pH提供了保证。通过将细胞浸泡在低浓度的双氧水溶液中设计了细胞凋亡的模型。细胞内荧光的增强表明Bodipy-Calix[4]arene复合物在细胞凋亡早期阶段可以对细胞内pH的波动产生响应。这种荧光pH探针将会有利于未来进一步研究细胞内pH与细胞凋亡的关系。
文档编号C12Q1/02GK102816826SQ20121027985
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月8日 优先权日2012年8月8日
发明者韩芳菲, 徐艳梅, 江德臣, 秦玉, 陈洪渊 申请人:南京大学