一种内切多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆、表达及应用

一种内切多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆、表达及应用
【专利摘要】本发明公开了一种内切多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆、表达及应用，所述的内切多聚半乳糖醛酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3经过毕赤酵母表达，纯化后，比酶活高达4,757.4U/mg；rEPG3最适pH值为5.5，最适温度为55℃；在pH 3.0?7.5下25℃处理24h还保持75.2％的酶活力，在45℃下处理1h之后还保持89.8％的酶活力，这说明此酶具有良好的pH稳定性和热稳定性。CGMCC 3.1550520150831
【专利说明】
-种内切多聚半乳糖酵酸酶基因的克隆、表达及应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体设及一种能够分解聚半乳糖醒酸或果胶的内切多 聚半乳糖醒酸酶巧PG3的应用。
【背景技术】
[0002] 果胶是一种主要由部分甲醋化的D-半乳糖醒酸经a-(l，4)-糖巧键聚合而成的多 糖类物质。果胶是植物组织的重要组成部分，其广泛存在于高等植物组织中，尤其在果实、 茎块、浆果中含量最为丰富。鉴于果胶结构的复杂性，果胶酶按其作用方式大致可W分为原 果胶酶、果胶醋酶、多聚半乳糖醒酸酶和果胶裂解酶。在运些复合酶中，内切多聚半乳糖醒 酸酶是最重要的组成部分，其能够随机水解由两个非甲醋化的半乳糖醒酸残基所组成的糖 巧键，从而使高聚合度的果胶发生解聚。
[0003] 果胶酶是一类具有重要应用价值的复合酶，是全球产销量最大的工业酶制剂之 一，其已被广泛应用于食品、饲料、造纸、纺织和果胶废液处理等领域。酸性果胶酶主要由真 菌产出，并主要应用于食品领域，特别是果蔬汁、果酒的加工，其能够显著提高压棒果蔬汁 的出汁率，降低果汁果酒的粘度，增加澄清效果，从而保证果汁果酒的品质。内切多聚半乳 糖醒酸酶rEPG3具有较高的催化活性W及良好的抑稳定性和热稳定性，运些特征使得其具 有较高的潜在应用价值。

【发明内容】

[0004] 本发明的一个目的是提供一种性质优良的内切多聚半乳糖醒酸酶。该酶含有379 个氨基酸，其序列如SEQ ID NO: 1所示。该酶属于内切多聚半乳糖醒酸酶的重组酶，记为 巧 PG3。
[0005] 其中，rEPG3的N端19个氨基酸为其预测的信号肤序列。因此，成熟的内切多聚半乳 糖醒酸酶的蛋白巧PG3有360个氨基酸，序列如SEQ ID N0:2所示。
[0006] 所述的巧PG3的信号肤序列如SEQ ID NO:3所示。
[0007] 本发明克隆了运一内切多聚半乳糖醒酸酶基因，克隆得到的内切多聚半乳糖醒酸 酶基因记为epg3，DNA全序列分析结果表明：epg3结构基因全长1419bp，含有4个内含子，序 列如沈Q ID NO:4所示。
[000引所述的ep的的cDNA长1140bp，序列如沈Q ID N0:5所示。
[0009] 所述的ep的去除其信号肤序列后的CDNA序列如SEQ ID N0:6所示。
[0010] 其中，所述的邱的的信号肤的CDNA序列如沈Q ID N0:7所示。
[00川含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌也是本发 明保护的范围。
[0012] 上述重组载体为将上述DNA分子插入质粒得到的重组载体。
[0013] 上述重组载体包含在己氏毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达的pPIC9K载体。本 发明的重组载体具体为在PPIC9K载体的SnaB巧日Avr II酶切位点间插入序列表中SEQ ID NO: 6核巧酸得到的重组载体pPIC9K-rEPG3。
[0014] 上述重组菌为将所述重组载体导入宿主菌中得到的重组菌。
[0015] 上述宿主菌包含了重组载体pPIC9K-rEPG3的宿主菌，优选为酵母菌;所述酵母菌 具体可为己氏毕赤酵母。
[0016] 上述的DNA分子或上述的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌在制 备内切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3中的应用也是本发明保护的范围。
[0017] 本发明的另一个目的是提供一种制备内切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3的方法，所述 方法包括W下步骤：
[0018] 1)用pPIC9K-rEPG3重组载体转化己斯德毕赤酵母(PicMa pastoris GS115)，筛 选得到重组菌株GS115/VEPG3。
[0019] 2)培养重组菌株，甲醇诱导重组内切多聚半乳糖醒酸酶基因ep的的表达。
[0020] 3)回收并纯化所生产的内切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3。
[0021] 本发明的实验证明，本发明从草酸青霉CZ1028的基因组序列中发现了一个编码内 切多聚半乳糖醒酸酶的基因ep的，可在宿主细胞中表达该基因W生产内切多聚半乳糖醒酸 酶巧PG3,用于降解聚半乳糖醒酸或果胶。对该内切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3进行酶活力相 关检测，其酶促反应的最适抑为5.5、最适溫度为55°C ;在最适pH和最适溫度下，该酶对底物 聚半乳糖醒酸的比酶活力为4，757.4U/mg;在抑3.0-7.5下25 °C处理2地还保持75.2 %的酶 活力，在45°C下处理化之后还保持89.8%的酶活力，说明此酶具有良好的pH稳定性和热稳 定性。运些特征使得其具有较高的潜在应用价值。
【附图说明】
[0022] 图1为草酸青霉CZ1028的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图。
[0023] 图2为草酸青霉CZ1028总RNA的琼脂糖凝胶电泳图。
[0024] 图3为草酸青霉CZ1028总RNA经过逆转录后的CDNA琼脂糖凝胶电泳图。
[0025] 图4为草酸青霉CZ1028基因组中含有一个假定内切多聚半乳糖醒酸酶全长基因的 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0026] 图5为草酸青霉CZ1028-个假定内切多聚半乳糖醒酸酶的CDNA的PCR产物的琼脂 糖凝胶电泳图。
[0027] 图6为草酸青霉CZ1028的一个假定内切多聚半乳糖醒酸酶的成熟蛋白质的编码区 的基因序列。
[0028] 图7为重组质粒pPIC9K-rEPG3的构建。
[0029] 图8为重组己氏毕赤酵母菌株GS115/VEPG3的菌液PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0030] 图9为制备及纯化重组假定内切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3的SDS-PAGE分析。
[0031] 图10为纯化的重组假定内切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3水解聚半乳糖醒酸的产物的 TLC分析。
[0032] 图11为内切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3的最适作用抑和溫度曲线。
[0033] 图12为内切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3的抑耐受性曲线。
[0034] 图13为内切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3的溫度耐受性曲线。
[0035] 图14为内切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3的酶反应动力学常数Km和Vmax的测定。
【具体实施方式】
[0036] 下述实施例中所使用的实验方法如没有特别提及，均采用本领域的通用方法。下 述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的百 分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。W下实施例中的定量试验，均设置=次重复实 验，结果取平均值或平均值±标准偏差。
[0037] 1.菌株、载体、酶、试剂盒及糖类物质来源
[0038] 草酸青霉CZ1028为本实验室通过草酸青霉(Penicillium oxalicum)诱变筛选得 到的高产多聚半乳糖醒酸酶菌株，已保存于中国普通微生物菌种保藏管理中屯、，保藏号为 CGMCC3.15505,保藏方式为公开保藏，公众可W获得。己氏毕赤酵母(Pichia pastor is)菌 株GS115购自 Invitrogen公司（California,USA)。表达载体pPIC9K购自 Invihogen公司 (California,USA)。限制性内切酶SnaB I和Avr II、T4DNA连接酶及用于PCR的LA Taq酶均 购自化KaRa公司（迂宁，中国），糖巧内切酶H购自化W England Biolabs公司（北京，中国）。 用于cDNA第一条链合成的反转录试剂盒购自化ansGen Biotech公司（北京，中国），用于RNA 提取的RNAiso Plus、用来连接PCR产物的pMD?18-T载体克隆试剂盒和用于PCR的化qTM化t Stad Version试剂盒都购自TaKaRa公司（迂宁，中国），化a壯ord法蛋白浓度测定试剂盒购 自捷瑞生物公司（上海，中国）。半乳糖醒酸、=半乳糖醒酸、聚半乳糖醒酸、橘皮果胶和苹果 皮果胶均购自Sigma公司。
[0039] 2.培养基
[0040] 1)真菌培养基
[0041 ]固态斜面培养基采用马铃馨-葡萄糖琼脂培养基(PDA)。
[0042] 提取RNA和DNA所用的产酶液体培养基成分为(g^):橘皮果胶10，（NH4)2S化1.4， MgS〇4.7H2〇 0.3，KH2P04 2.0，CaCl2*2H2〇 0.4,化N03 5.0，Tween 801.0,和Iml微量元素 (g/l:CoCl2 2.0，MnS〇4 ?出0 1.6，ZnS〇4 ?出0 1.4和FeS〇4*7出0 0.5)，最终各成分用 0.05M巧樣酸钢缓冲液溶解至pH 5.5。
[0043] 2)酵母培养基
[0044] YPD培养基：1%酵母浸出物、2%膜蛋白腺、2%葡萄糖，固体培养基还另需要加入 2 %琼脂。
[0045] YTO遗传霉素(G418)固体培养基：1 %酵母浸出物、2 %膜蛋白腺、2 %葡萄糖、2 %琼 脂和不同量的G418。
[0046] MD固体培养基：1.34%无氨基酸酵母氮源(YNB)、4Xl〇-5%生物素、2%葡萄糖和 2 %琼脂。
[0047] BMGY培养基：1 %酵母浸出物、2 %膜蛋白腺、1 OOmM憐酸钟化6.0、1.34%YNB、4 X 1 (T5 %生物素和1 %甘油。
[004引 BMMY培养基：1 %酵母浸出物、2 %膜蛋白腺、1 OOmM憐酸钟化6.0、1.34%YNB、4 X 10-5%生物素和0.5%甲醇。
[0049] 3.多聚半乳糖醒酸酶活力及蛋白质浓度测定：
[0050] W聚半乳糖醒酸为底物测定多聚半乳糖醒酸酶的活力，参照Miller等所描述的方 法（Miller GL.1959.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.Anal.Chem.31:426-428)。
[0051 ] I)半乳糖醒酸标准曲线的制作
[0052] 用去离子水配制2g/L的半乳糖醒酸标准溶液，在2ml离屯、管中用去离子水将标准 液适当稀释成8个500化不同浓度的葡萄糖溶液(g/L):0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、 1.4,每个样品浓度分别设S个重复。在所有样品中加入1ml的DNS试剂，混匀，沸水中煮10分 钟，用冰水冷却至室溫，3420 X g离屯、5分钟，每个样品分别取200ul上清液加入到96孔酶标 板中，在波长540nm下测定样品的吸光值。W半乳糖醒酸浓度为横轴(X轴），W光吸收值为纵 轴（Y轴）作散点图，添加趋势线得到标准曲线为y = 〇.9591x+0. 1559(相关系数R2 = 0.9994)。
[0053] 2)酶活力测定及酶活力单位的定义
[0054] 在2mL的离屯、管中加入45化L含0.5%聚半乳糖醒酸的缓冲液(pH值根据实验需要 来设定），在设定溫度的水浴锅中保溫5分钟后(溫度根据实验需要来设定），加入50化酶液 并快速混匀。保溫反应15分钟后加入ImL的DNS试剂终止反应并沸水浴10分钟显色。用冰水 冷却至室溫，3420 X g离屯、5分钟，取20化L反应液加入到96孔酶标板中，用酶标仪于540nm处 测定光吸收值。每组实验重复=次，对照酶液用沸水煮灭活。在设定的测定条件下，每分钟 水解半乳糖醒酸聚合物释放出Iwiiol还原糖所需的酶量，定义为一个酶活力单位化)。
[0055] 3)蛋白质含量的测定使用Radford法（Bradford ,M . M. 1976 . A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Analytical Biochemistry.72: 248-254)。
[0056] 4.假定内切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3编码基因ep的的获得：
[0057] 1)产多聚半乳糖醒酸酶的草酸青霉CZ1028菌丝体的制备
[005引（1)草酸青霉CZ1028抱子悬浮液的制备:将草酸青霉CZ1028的抱子接种到固体PDA 斜面上，30°C静置培养5天后，取新鲜抱子置于含0.1 % triton XlOO无菌超纯水的S角瓶 中，用=角瓶中的玻璃珠充分打散抱子。
[0059] (2)草酸青霉CZ1028产酶培养:将抱子液接种于前述的产酶液体培养基(每IL体积 S角瓶中含100mL液体培养基)至终浓度IX IO5个/mL,置于30°C、150巧m摇床培养2天后，生 长的菌丝体用于提取基因组DNA和RNA。
[0060] 2)草酸青霉CZ1028基因组DNA的提取:收集产酶液体培养基中的菌丝体，先后用无 菌生理盐水和20mM/L的抓TA洗涂菌体，得到干燥菌丝体，加液氮充分研磨菌丝体后用SDS法 提取基因组DNA。将提取所得的DNA溶液进行浓度为1.0%的琼脂糖凝胶电泳(没有特别说明 均使用此浓度的琼脂糖凝胶），结果如图1所示:泳道M为A隧菌体DNA用限制性内切酶化ndm 进行完全酶切之后得到的产物，含有7个DNA片段，从大到小分别为:23.13、9.416、6.557、 4.361、2.322、2.027和0.564化;泳道1为草酸青霉〔21028的基因组0魁。电泳结果表明已经 成功提取得到草酸青霉CZ1028的基因组DNA。
[0061 ] 3) RNA的提取及CDNA第一条链的合成
[0062]使用RNAiso Plus试剂提取草酸青霉CZ1028的总RNA，提取方法按照说明书进行， 提取得到的RNA进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图2所示:泳道M为化2000DNA Marker，含有6个 DNA片段，从大到小分别为：2.00、1.00、0.75、0.50、0.25和0.1 Okb,泳道1为为草酸青霉 CZ1028的总RNA，可W清晰看到18S和28S RNA两条带。电泳结果表明成功提取得到草酸青霉 CZ1028的总RNA。使用反转录试剂盒，按照说明书上所述的操作方法将其中的mRNA反转录为 CDNA并进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图3所示：泳道M为化2000DNA Marker,泳道1为草酸青 霉CZ1028CDNA第一条链的反转录结果。电泳结果表明成功合成CDNA的第一条链。
[0063] 4)假定内切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3全长DNA的获得及分析
[0064] 设计一对引物（引物1)，上游引物为5'-416〇：1'〔467^41'〔44〇：1'1'押640-3'，下游引 物为5 '-CTAGCAGCTAGCCACGCTGGG-3 '，W提取得到的草酸青霉CZ1028基因组DNA作为模板， 使用LA Taq酶进行PCR扩增，反应体系参照说明书，PCR反应程序如下：94 °C 5min一 [ 94 °C 30sec 一 55°C30sec 一 72°C90sec]5 一 [94°C30sec 一 60°C30sec 一 72°C90sec]3〇 一 72°C10min， 4°C保存。
[0065] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下切下HOObp左右的条带，使用 DNA纯化回收试剂盒进行回收并进行琼脂糖凝胶电泳检测，如图4:泳道M为化2000DNA Marker，泳道1为假定的内切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3的全长DNA。回收所得的产物，使用T载 体克隆试剂盒连接至PMD18-T载体上并转化至大肠杆菌中。使用引物1进行菌落PCR，将含有 重组质粒的阳性大肠杆菌送去测序，得到该基因全长DNA的序列为序列表中的SEQ ID NO: 4。该序列全长1419bp，用NCBI数据库化ttp://www.ncbi .nlm.nih.gov/)中的草酸青霉114- 2全基因组测序结果对比分析表明该序列含有4个内含子，其在SEQ ID N0:4中的位置(bp) 分别为:252-327、753-817、950-1021、1107-1172。
[0066] 5)假定内切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3全长CDNA的获得及分析
[0067] W得到的草酸青霉CZ1028CDNA的第一条链作为模板，使用引物1和LA Taq酶进行 PCR扩增，反应体系参照说明书，PCR反应程序如下:94°C5min一[94°C30sec一55°C30sec一 72°C60sec]5 一 [94°C30sec 一 60°C30sec 一 72°C960sec]3〇 一 72°C10min，4°C 保存。将 PCR 产物 进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下切下IlOObp左右的条带，使用DNA纯化回收试剂盒进 行回收并进行琼脂糖凝胶电泳检测，如图5:泳道M为化2000DNA Marker,泳道1为假定内切 多聚半乳糖醒酸酶巧PG3的全长cDNA。回收所得到的产物，使用T载体克隆试剂盒连接至 PMD18-T载体上并转化至大肠杆菌中。使用引物1进行菌落PCR，将含有重组质粒的阳性大肠 杆菌送去测序，得到该基因全长CDNA的序列为序列表中的SEQ ID N0:5。该序列全长 1 HObp，使用在线软件分析化ttp://www.cbs.dtu.化/services/SignalP/)表明为：全长 cDNA(SEQ ID N0:5)由成熟的编码区（SEQ ID N0:6)和信号肤区（SEQ ID N0:7)组成。编码 379个氨基酸(SEQ ID NO: 1)，其中成熟区为360个氨基酸(SEQ ID N0:2)，信号肤区为19个 氨基酸(SEQ ID N0:3)。
[006引 5.重组质粒pPIC9K-rEPG3的构建
[0069]设计引物2，上游引物为5' -GACCTACGTATCGCCTGTCGCCCAGCCAG-3 '，下游引物为5 ' - CGACCTAGGCTAGCAGCTAGCCACGCTGGG-3'，W得到的草酸青霉CZ1028cDNA的第一条链作为模 板，使用TaKaRa Taq?化t Start Version试剂盒进行PCR扩增成熟编码区的CDNA，反应体 系参照说明书，PCR 反应程序如下:95°C5min 一 [95°C30sec 一 56°C30sec 一 72°C80sec]3G 一 72 °C10min，4°C保存。使用DNA纯化回收试剂盒进行回收并进行琼脂糖凝胶电泳检测，如图6: 泳道M为化2000DNA Marker,泳道1为用来构建pPIC9K-rEPG3成熟编码区的基因。分别将将 表达载体PPIC9K和假定内切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3成熟编码区的基因进行限制性酶切 (SnaB I+Avr II)，琼脂糖凝胶电泳观察后，分别切下双酶切处理的表达载体和成熟编码区 的基因并使用DNA纯化回收试剂盒进行回收。将纯化后的表达载体和成熟编码区基因用 化KaRa T4DNA连接酶进行连接，反应体系参照说明书。连接产物转化大肠杆菌，使用引物2 进行菌落PCR，对阳性大肠杆菌的重组质粒进行酶切验证，琼脂糖凝胶电泳检测，如图7:泳 道Ml为A隧菌体DNA用限制性内切酶化ndm进行完全酶切之后得到的产物、泳道1为不携带 外源基因的载体PPIC9K双酶切、泳道2为重组质粒双酶切、泳道3为重组质粒单酶切、泳道4 为重组质粒、M2为化2000DNA Marker。从图7泳道2可W看到两条带，一条为线性的PPIC9K载 体，另一条为连接在载体上的目的基因，由此得出结论:重组质粒构建成功。将酶切验证过 的重组质粒拿去测序，用DNAman软件对测序结果分析表明，未发现基因突变、缺失或移码情 况，将该重组质粒命名为pPIC9K-rEPG3 (' r '代表重组的意思）。
[0070] 6.含有质粒pP I C9K-rEPG3的重组己氏毕赤酵母的构建
[0071] 1)重组质粒转化毕赤酵母
[0072] 分别将不携带外源基因的载体PPIC9K和携带成熟编码基因的载体pPIC9K-rEPG3 用限制性内切酶SacI进行单酶切，得到线性化质粒。分别将运两个线性化质粒用LiCl法转 化至己氏毕赤酵母菌株GSl 15中。具体方法详见Invitrogen公司的毕赤酵母表达试剂盒
[0073] 2)重组己氏毕赤酵母的筛选与鉴定
[0074] (1)将LiCl处理后的细胞悬浮液适当稀释后涂在MD平板上，在30°C恒溫培养箱中 倒置培养3天。
[0075] (2)用灭菌处理过的超纯水和玻璃珠将MD平板上的菌落洗脱下来，适当稀释后分 别取IOOul各个梯度的菌液涂在G418浓度为0.5-4. Omg/mL的Yro平板上，在30°C恒溫培养箱 中倒置培养3-4天。
[0076] (3)用牙签将含G418(>2.0mg/mL)的Yro平板上的较大菌落接种于Yro液体培养基 中，在30°C，250巧m的摇床中培养2地，产生的发酵液用来做菌体PCR，鉴定重组子。用正向引 物5 ' AOX: 5 ' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3 ' 和反向引物3 ' AOX: 5 ' -GCAAATGGCATTCTGACATCC- 3' 引物进行菌体PCR。菌体PCR反应条件如下：95°C5min一[92°C30sec一52°C30sec一72°C 2min]30一72°C 1 Omin，4°C保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后如图8所示：泳道Ml为1 kb DNA ladder，含有 10 个 DNA 片段，从大到小分别为 10.00、9.00、8.00、7.00、6.00、5.00、4.00、 3.00、2.00和1.00化，泳道I的PCR产物是W转化pPIC9K-rEPG3得到的单菌落为模板的扩增， 泳道2的PCR产物是W转化不携带外源基因的载体PPIC9K得到的单菌落为模板的扩增，泳道 M2为化2000DNA Marker。从图8的泳道1中可W看到PCR有一条ieOObp的条带，长度为载体上 的原有序列长度(详见Invi化Ogen公司的载体PPIC9K的商品说明书）与外源DNA长度之和， 泳道2可W看到PCR有一条5(K)bp的条带，长度为载体上的原有序列长度。
[0077] (4)将PC閲金证后的阳性克隆用牙签分别接种于含2ml BMGY培养基的指形瓶中，30 °C，250巧m的摇床培养至过夜，然后在室溫下3000 X g离屯、5分钟，最后将沉淀垂悬于含4ml BMMY培养基的指形瓶中，培养条件仍为30°C，250巧m，其间每隔24h加入0.5%体积的甲醇。 培养72h后收集发酵上清液在50°C，pH 5.0条件下测每个阳性克隆的多聚半乳糖醒酸酶活 力，最终确定一株表达最高多聚半乳糖醒酸酶活力的菌株，命名为GS115/VEPG3,含有不携 带外源基因载体pP IC9K的对照菌株命名为GS115/CK。
[0078] 7.重组己氏毕赤酵母中ep的基因的表达及纯化
[00巧]I)诱导重组己氏毕赤酵母菌株GS115/VEPG3表达重组蛋白质巧PG3 [0080] 将生长在固体Yro板上的GS115/VEPG3菌株用牙签分别接种于含50ml BMGY培养基 的250mlS角瓶中，30°C，250巧m的摇床培养至0D600达到2-4,然后取25ml该发酵液在室溫 下3000 Xg离屯、5分钟，最后将沉淀垂悬于含50ml BMMY培养基的250mlS角瓶中，同样条件 下培养，其间每隔24h加入0.5 %体积的甲醇后并取样保留W用来SDS-PAGE检测化aemml i UK.1976.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.化1:ure . 227:680-685)，共计培养8天。结果如图9-A所示：泳道M为蛋白 质分子量标记，包含7条带，从上到下依次为97.2、66.4、44.3、29.0、20.1和14.3kDa;泳道l- 8为重组己氏毕赤酵母菌株GS115/rEPG3每段间隔时间的表达产物分析a-8天）。由图9-A得 到结论:重组己氏毕赤酵母菌株GSl 15/VEPG3诱导6天后蛋白表达量接近高峰。
[0081 ] 2)重组蛋白质巧PG3的纯化
[0082] (1)在4°C，l，1325Xg条件下离屯、10分钟收集诱导6天的GS115/VEPG3发酵上清液。
[0083] (2)在4°C，5000 Xg条件下用截留分子量为10.OkDa的15ml超滤管(Millipore)将 收集的发酵上清液进行浓缩，浓缩过程中用〇.〇2mM的Tris-Hcl的缓冲液更换浓缩液中的发 酵液。
[0084] (3)将收集到的浓缩液4°C保存，取其中部分用GE公司的分子筛（HiLoad 16/ GOOsupredex 75co Iumn)进行纯化(流速:0.5ml/min、缓冲液:0.02mM Tri S-Hc 1、收集：Iml/ 管）
[0085] (4)将所有的收集管保存在4°C冰箱。用SDS-PAGE检测每管收集液纯度，将只含有 一条带的蛋白液进行糖巧内切酶H处理(详见说明书），结果如图9-B所示:泳道M为蛋白质分 子量标记，条带数量和大小参见图9-A。泳道1为重组己氏毕赤酵母菌株GS115/VEPG3诱导6 天后表达产物、泳道2为重组己氏毕赤酵母菌株GS115/CK诱导6天后表达产物、泳道3为纯化 产物，泳道4为纯化产物经化d細处理后的条带。从图9-B可W看到，泳道3中仅有一条蛋白质 条带，该条带对应的分子量约为36.6f5kDa，与经过计算化ttp: //ww. cnh叫O . cn/CalMW/ MyMW. asp)得到的重组蛋白质巧PG3的理论分子量36.7化化相符合，并且经EndoH处理后条 带(泳道4)大小不变，说明纯化得到的巧PG3没有明显糖基化现象。终上所述，依照上述方法 成功纯化得到了重组蛋白质巧PG3。
[00化]8.纯化的重组蛋白质巧PG3的酶学特性
[0087] 1)底物特异性及产物分析
[0088] 如前所诉，重组蛋白质巧PG3的基因ep的与NCBI数据库比较后，发现其为假定的内 切多聚半乳糖醒酸酶，所W必须对其底物特异性及产物分析进行检测，用0.1 M的巧樣酸-憐 酸氨二钢缓冲液分别配制含0.5%聚半乳糖醒酸、橘皮果胶和苹果皮果胶的P册.5的反应底 物，在55°C下测重组蛋白质巧PG3针对各底物的酶活力，W水解聚半乳糖醒酸产生的酶活力 为100%，其它底物下的酶活力折算为相对酶活力。结果发现，重组蛋白质巧PG3针对聚半乳 糖醒酸、橘皮果胶和苹果果胶的酶活力分别为100%、26.5%和16.6%。此实验说明重组蛋 白质巧PG3为多聚半乳糖醒酸酶。在含抑5.5,1%聚半乳糖醒酸的底物中加入一定量的重组 蛋白质巧PG3,40°C保溫48小时，每隔一段时间取样煮沸灭活后4°C保存，将所取样品进行薄 层层析（TLC)实验化 squivel JCC,Voget CE.2004.Purification and partial characterization of an acidic polygalacturonase from Aspergillus kawachii .J.Biotechnol. 110:21-28.)。结果如图10所示:在反应O分钟(min)至I小时化）的 过程中，聚半乳糖醒酸迅速降解，有部分=半乳糖醒酸(G3)生成，未见半乳糖醒酸(Gl)生 成;反应2小时至24小时，反应产物主要为半乳糖醒酸聚合物和=半乳糖醒酸，并未见半乳 糖醒酸明显生成;反应48小时后发现反应产物主要为=半乳糖醒酸。底物特异性和化C结果 表明重组蛋白质巧PG3是典型的内切多聚半乳糖醒酸酶。
[00例 2)最适作用抑值和溫度（I'emperature)
[0090]用0.1 M的巧樣酸-憐酸氨二钢缓冲液配制含0.5%聚半乳糖醒酸的pH2.2-7.0的反 应底物，在50°C下，按前述方法测定不同抑值对纯化的巧PG3的内切多聚半乳糖醒酸酶活力 的影响。设测定的最高酶活力为100%，其它pH值的酶活力与最高酶活力的比值折算为相对 酶活力(Relative activity);结果见图11-A:内切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3的最适作用pH 值为抑5.5。
[0091 ]用pH 5.5的0.1 M的巧樣酸-憐酸氨二钢缓冲液配置0.5%的聚半乳糖醒酸溶液，按 照前述测定多聚半乳糖醒酸酶活力的方法分别在不同溫度下(25-80°C)测定纯化的内切多 聚半乳糖醒酸酶巧PG3的酶活力。设最适溫度下的酶活力为100%，其它溫度下的酶活力折 算为相对酶活力。结果见图11-B:内切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3的最适作用溫度为55°C。所 W可W设定抑5.5、55°C为巧PG3的最适反应条件，并测得其特异性比酶活力为4,757.4U/ mg。
[0092] 3)pH稳定性与溫度稳定性
[0093] 将纯化的内切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3进行抑稳定性检测，分别采用0.1 M巧樣酸- 憐酸氨二钢缓冲液(pH 2.2-7.0),0.1 M IYis-HCl缓冲液(pH 7.0-9.0),0.1 M甘氨酸-氨氧 化钢缓冲液(pH 9.0-10.0)，将酶保存于不同pH值的缓冲液中，于25°C分别放置1小时和24 小时后，在pH 5.5、55°C (最适条件）下测定不同pH缓冲液中的残余酶活力（ReSidual activity)。结果发现纯化的内切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3在抑2.2-10.0缓冲液中保溫1小 时后仍残余73.2%的酶活(见图12-A)，纯化的内切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3在抑3.0-7.5缓 冲液中保溫24小时后仍残余75.2%的酶活(见图12-B)，W上结果表明纯化的内切多聚半乳 糖醒酸酶巧PG3具有良好的pH稳定性，尤其是在酸性条件下。
[0094] 将纯化的内切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3进行溫度耐受性检测，分别采用不同的保 存溫度(45°C 、50°C?和55°C ▲)，将酶用含有0.5%聚半乳糖醒酸的抑5.5缓冲液稀释，然 后稀释酶液在上述溫度的水浴锅中保溫1个小时，每隔15分钟取样并在最适条件下测定酶 活力。W不做如上处理的酶液的酶活力为100%，不同溫度保溫后的残余酶活力折算为相对 酶活力。结果见图13:纯化的内切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3在45°C的条件下保溫1小时后仍 然保留89.8 %的酶活力，说明该酶具有较好的溫度稳定性。
[OOM ] 4)巧PG3的酶反应动力学常数Km、Vmax的测定
[0096] 分别配制不同浓度的聚半乳糖醒酸液(umol/ml)，按照本研究中测定内切多聚半 乳糖醒酸酶的反应体系，在最适条件下测定巧PG3在W上述不同浓度底物的酶活力，蛋白质 浓度检测用化a壯ord法。底物浓度(S)和反应速度(V)的双倒数图见图14,根据双倒数作图 得出的方程来计算得到巧PG3的Km值为:72.3皿01/ml，Vmax为64，565.7U/mg。
[0097] 5)金属离子、有机物对巧PG3酶活力的影响
[0098] (1)将抑5.5的0.5%聚半乳糖醒酸液配制成含不同浓度（ImM或2mM)的金属离子氯 化物的反应底物，在最适作用条件下测定巧PG3的酶活力。结果见表1:发现Mn2+和Cu2+对 巧PG3的酶活力有抑制作用，其中化最为明显。
[0099]

[0100] (2)将抑5.5的0.5%聚半乳糖醒酸液配制成含不同浓度（IOmM或20mM)有机物的反 应底物，在最适作用条件下测定巧PG3的酶活力。结果见表2:发现SDS对巧PG3的酶活力有强 烈抑制作巧.見它有化物对讯PG3的酪活力双有影晌。
[0101]
[0102]
【主权项】
1. 一种内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3,其特征在于，其氨基酸序列如下：SEQ ID NO :1或 SEQ ID NO:2所示。2. -种编码权利要求1所述的内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3的基因 epg3,其特征在于： 其核苷酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示。3. 包含权利要求2所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌。4. 权利要求3所述的重组载体为将权利要求2所述DNA分子插入表达质粒得到的重组载 体。5. 权利要求3所述的重组菌为将权利要求4所述的重组载体导入宿主菌中得到的重组 菌。6. 权利要求2所述的DNA分子或权利要求3所述的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细 胞系及重组菌在制备内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3中的应用。7. 权利要求1所述内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3的制备方法，其特征在于，所述方法包 括以下步骤： 1) 用权利要求4所述的重组载体转化巴斯德毕赤酵母，筛选得到重组菌株； 2) 培养重组菌株，甲醇诱导重组内切多聚半乳糖醛酸酶基因 epg3的表达； 3) 回收并纯化所表达的内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3。8. 权利要求1所述的内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3在降解聚半乳糖醛酸或果胶中的应 用。
【文档编号】C12N15/81GK105925549SQ201511025114
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2015年12月30日
【发明人】程忠, 陈东, 卢波, 罗贞贞, 朱绮霞, 芦志龙, 黄日波
【申请人】广西科学院