艾纳香查尔酮合酶基因Bb-CHS、其编码蛋白质以及基因克隆方法
【专利摘要】本发明涉及一种艾纳香查尔酮合酶基因Bb?CHS，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1，一种艾纳香查尔酮合酶基因Bb?CHS编码的蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID NO:2，本发明还涉及RT?PCR和RACE技术相结合，用于克隆艾纳香查尔酮合酶基因Bb?CHS基因全长的方法。为进一步研究艾纳香Bb?CHS基因的表达、调控奠定了基础，为Bb?CHS基因参与艾纳香黄酮组成及调控机制研究提供参考，同时也为菊科植物Bb?CHS基因功能和进化研究提供了新的背景资料。另外Bb?CHS基因的大量表达，有助于提高艾纳香的生物学产量，同时提高植株有效成分榭皮素等类黄酮化合物的含量，从而同时提高艾纳香的产量和品质。
【专利说明】
艾纳香查尔酬合酶基因化-CHS、其编码蛋白质从及基因克隆 方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，设及一种基因及其克隆方法，同时也设及到该基因编 码蛋白质，尤其设及一种艾纳香查尔酬合酶基因抓-CHS、其编码蛋白质W及基因克隆方法。
【背景技术】
[0002] 艾纳香(Blumea balsamifera L.DC.)为菊科艾纳香属多年生木质草本植物，主要 分布于我国海南、贵州、广西、广东、云南、台湾等省。W其全草或地上部分入药，具有镇痛、 发汗、桂风除湿、去疲止咳、通经止血等功效，在黎族、苗族、壮族等少数民族地区有着悠久 的用药历史，是一种重要的民间药物。同时艾纳香也是获取天然冰片(艾片）的重要植物来 源之一。并且，在精致艾片过程中所产生的艾油具有扩张血管、降低血压、抑制交感神经的 作用，因而被广泛应用于医药行业。另外，艾油因其独特的芳香气味，还被广泛应用于香料 W及化妆品行业。虽然W艾纳香为原材料的产品众多，然而关于其化学成分的研究较少。
[0003] 对于艾纳香而言，其化学成分比较复杂，但具有药理作用的主要集中在黄酬类和 挥发油成分上。关于艾纳香挥发油成分的研究：周欣等（2001)、马芝玉等（2009)采用GC/MS 方法检测到艾纳香中挥发油成分主要为:k龙脑、精脑、e-石竹締、芳精醇、大叶香締D、香木 兰締、顺-a-没药締、e-孽澄茄油締、丫-依兰油締、ent-贝壳杉締等祗类化合物。邓芹英等 (1996)，曹家庆等(2008)，陈铭等(2009)分别对艾纳香中黄酬类成分进行了分析，主要含有 艾纳香素、木犀草素、搬皮素、儿茶素W及阿亚黄素等。除此之外，艾纳香中还含有多其他种 化合物，如小麦黄素、芹菜素、原儿茶酸（甲醋）、咖啡酸（甲醋）、香草酸等化合物。其中樹皮 素等类黄酬化合物具有广泛的生理活性，在抗肿瘤方面具有良好的作用。
[0004] 查尔酬合酶（chalcone synthase,CHS)是类黄酬类物质代谢合成过程中的关键 酶，在植物与环境的相互作用中起到了重要的作用（如抗病、防止UV损伤、影响植物根瘤形 成等），对植物的生长发育起着至关重要的作用，同时与植物的花色的形成密切相关。目前 在研究植物生长发育及抗性中设及较多研究，而从植物次生代谢及产物药理药效活性方面 研究较少。
[0005] 目前，CHS基因在高梁、玉米、矮牵牛、兰花、金鱼草、拟南芥、豆类和松树等植物上 成功克隆，但目前还没有关于艾纳香查尔酬合酶(CHS)基因的相关报道。因此，对艾纳香查 尔酬合酶基因的克隆W及对他们的生物学功能研究，将有助于明确艾纳香中类黄酬类次生 代谢的分子机理，为调控其艾纳香中有效成分等奠定基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种首次从艾纳香种获得的查尔 酬合酶基因。本发明的另一个目的是提供艾纳香查尔酬合酶编码的氨基酸序列及编码蛋白 质性质生物信息学预测。同时，本发明还提供该艾纳香查尔酬合酶基因的克隆方法及引物 对。
[0007]为了达到上述目的，本发明的技术方案是运样实现的：
[000引本发明的第一个方面是提供一种艾纳香查尔酬合酶基因，从艾纳香（Blumea balsamifera DC)中克隆，命名为抓-C服基因，其核巧酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0009] 本发明的第二个方面是提供一种本发明第一个方面所述的艾纳香查尔酬合酶基 因编码的蛋白质，命名为抓-C服蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0010] 本发明的第S个方面是提供本发明第一个方面所述的艾纳香查尔酬合酶基因化- C服的克隆方法，其特征在于:包括W下步骤：
[0011] (1)从艾纳香叶片中提取总RNA;
[001。。似总RNA为模板进行反转录获得CDNA;
[0013] (3)设计简并引物对，进行PCR扩增，回收PCR产物，其中，简并引物对为：
[0014] PFl:TCACCAAACA AAGCCTGTCC，
[0015] PR1：TCACCCACCT CGTATTTTGC；
[0016] (4)PCR产物与pGEM-T easy Vector连接，连接产物转化E.COli JM109感受态细 胞，采用蓝白斑筛选阳性克隆，筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，获得化-CHS基因 片段；
[0017] (5似总RNA为模板，采用SMART? race Kit提供的反转录引物合成RACE第一链 CDNA;根据获得化-CHS基因片段设计3 '和5 '末端快速扩增引物对，WRACE第一链CDNA为模 板进行快速扩增，其中，3 '和5 '末端快速扩增引物对为：
[001 引 66-(：服基因5'尺4〔6引物:〔4〔4466口'4 1'〔44641666，
[0019] 66-(：服基因3'尺4〔6引物：〔660：7^66 1'〔444〔661'1';
[0020] (6)步骤(5)得到的PCR产物经检测、回收、亚克隆和测序，获得化-CHS基因3 '和5 ' 末端序列，并进行拼接；
[0021] (7)根据上述拼接序列，于抓-CHS基因开放阅读框两端设计全长CDNA扩增引物对， 进行全长序列的克隆，其中全长CDNA扩增引物对为：
[0022] Bb-C服基因5'引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT，
[0023] Bb-CHS基因3' 引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。
[0024] 进一步地，步骤(5)中5'-&3'-RACE PCR反应体系为：TaKaRa Ex Taq(SUAU)O.化 l;10x Ex !"aq Buffe;r，Mg2+plus 5]il;dNTP Mixture各2.5mmol/L，4]il;3'-RACE-Ready cDNA 化1 ;GSP，10皿ol/L，化I; UPM，IOx，5iU ; d地20补充至50iU ;
[0025] 进一步地，步骤(7)中化-CHS基因全长序列的克隆的反应体系为:PCR反应总体积 为50ia，1.5mmol/LMgCl2,4种dNTP各200i^mol/L，引物各150ng，1.5UTaqplusDNA polymerase,高保真，IOOng cDNA。
[0026] 进一步地，步骤(1)中采用TRNzol法提取总RNA。
[0027] 进一步地，步骤（2)中采用TaKaRa公司生产的PrimeScript? 1st Shand cDNA Synthesis Kit进行反转录获得cDNA。
[0028] 本发明的第四个方面是提供一种克隆本发明第一个方面所述的艾纳香查尔酬合 酶基因抓-C服的简并引物对，其特征在于，所述简并引物对为：
[00巧]PF1:TCACCAAACA AAGCCTGTCC，
[0030] PRl:TCACCCACCT CGTATTTTGC。
[0031] 本发明的第五个方面是提供一种克隆本发明第一个方面所述的艾纳香查尔酬合 酶基因抓-C服的3'和5'末端快速扩增引物对，所述3'和5'末端快速扩增引物对为：
[0032] Bb-CHS基因5'RACE引物：CACAAGGCTA TCAAGATGGG，
[0033] 66-(：服基因3'尺4〔6引物：〔660：7^66 1'〔444〔661'1'。
[0034] 本发明的第六个方面是提供一种克隆本发明第一个方面所述的艾纳香查尔酬合 酶基因抓-C服的全长CDNA扩增引物对，所述全长CDNA扩增引物对为：
[0035] Bb-C服基因5'引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT，
[0036] Bb-CHS基因3' 引物：TCAAATGGAC ACACTATGGA。
[0037] 本发明的第屯个方面是提供一种克隆本发明第一个方面所述的艾纳香查尔酬合 酶基因抓-CHS的引物组，所述引物组包括简并引物对、3'和5'末端快速扩增引物对、W及全 长CDNA扩增引物对，其中，
[0038] 所述简并引物对为：
[0039] PF1:TCACCAAACA AAGCCTGTCC，
[0040] PR1：TCACCCACCT CGTATTTTGC；
[0041 ] 所述3 '和5 '末端快速扩增引物对为：
[0042] Bb-C服基因5'RACE引物:CACAAGGCTA TCAAGATGGG，
[0043] 66-(：服基因3'尺4〔6引物：〔660：7^66 1'〔444〔661'1';
[0044] 全长cDNA扩增引物对为：
[0045] Bb-C服基因5'引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT，
[0046] Bb-CHS基因3' 引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。
[0047] 本发明的有益效果是：
[0048] 本发明设及一种艾纳香查尔酬合酶基因化-CHS与编码的蛋白质及其克隆方法。本 发明采用RT-PCR与RACE技术相结合的方法，对艾纳香种化-CHS基因进行了研究，首次从艾 纳香叶片中克隆得到化-CHS基因全长序列，并对其所编码的氨基酸序列进行了分析，为进 一步研究艾纳香化-CHS基因的表达、调控奠定了基础，为化-CHS基因参与艾纳香黄酬组成 及调控机制研究提供参考，同时也为菊科植物化-C服基因功能和进化研究提供了新的背景 资料。另外抓-CHS基因的大量表达，有助于提高艾纳香的生物学产量，并同时提高植株有效 成分樹皮素等类黄酬化合物的含量，从而同时提高艾纳香的产量和品质。
【具体实施方式】
[0049] 下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，W更好地理解本发明。
[0050] 步骤1，选用艾纳香(Blumea balsamifera DC)叶片作为试验材料，采用TR化〇1法 提取总RNA，其含量及质量采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0化1] 步骤2，^总1?酷为模板，采用化1(日1?日公司生产的？'1111日5。'191了《1318付日11(1。0魁 Synthesis Kit进行反转录获得cDNA。
[0052] 步骤3, W该cDNA为模板，根据NCBI上其他植物CHS基因保守区域，设计简并引物 对，进行PCR扩增，简并引物对为：
[0053] PF1:TCACCAAACA AAGCCTGTCC，
[0054] PRl:TCACCCACCT CGTATTTTGC;
[0055] 反应体系为:PCR反应总体积为50iU，1.5mmol/L MgCl2,4种dNTP各200皿ol/L，引 物各 150ng，l.抓！"aq plus DNA polymerase(高保真），100ng cDNA。
[0化6] PCR反应条件为：
[0化7]
[005引步骤4，PCR产物回收后与pGEM-T easy Vector连接，连接产物转化E. COli JM109 感受态细胞，采用蓝白斑筛选阳性克隆，筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，获得抓- C服基因片陈?
[0化9]
[0060]
[0061] 步骤5，根据上述抓-C服基因片段设计3 '和5 '末端快速扩增(RACE)引物对；
[0062] 66-(：服基因 5'尺4〔6引物:〔4〔4466口'4 1'〔44641666，
[0063] 66-(：服基因 3'尺4〔6引物：〔660：7^66 1'〔444〔661'1'。
[0064] 步骤6:采用SMART? race Kit提供反转录引物，W总RNA为模板，进行反转录，合成 RACE 第一链 cDNA:
[00化]3'-RACE-Ready cDNA反应体系：Total RNA liig，3'-RACE CDS Primer:化1，补 dd出0至终体积扣I;
[0066] 5'-RACE-Ready cDNA反应体系：Total RNA liig，3'-RACE CDS Primer 化1，BD SMART II? Oligonucleotide TC溫育2min，补dd出0至终体积化I。
[0067] 将各反应体系混匀后，短暂离屯、，于70°C溫育2min，迅速于冰中冷却2min，短暂快 速离屯、后，在反应管中加入下列试剂：5X First-Strand Buffer 2iil，DTT liil，dNTP Mix 1 ]il，BD PowerScript Reverse Transcriptase 化1，加 d地2〇补至lOyl，混匀，短暂离屯、，42 。(:溫育化，加入10化I Tricine-EDTA缓冲液稀释反应产物;72°C加热10min，4°C保存备用。 [006引步骤7,采用3'和5'末端快速扩增(RACE)引物对，WRACE第一链CDNA为模板进行快 速扩增。
[0069] 5，-&3'-RACE PCR反应体系：TaKaRa Ex Taq(SUAU)O.化1，IOx Ex Taq Buffer (Mg2+plus)扣l，dNTP Mixture(各2.5mmol/L)4山，3'-RACE-Ready cDNA 化1，GSP(10皿ol/ L)化1，1]口]?(10义）541，(1地2〇补充至50山。
[0071]
[0070] PCR厉献签化.
[0072]
[0073] 步骤8，PCR产物经检测、回收、亚克隆和测序。获得抓-CHS基因3 '和5 '末端序列，并 进行拼接。
[0074] 步骤9,根据上述拼接序列，于化-CHS基因开放阅读框(ORF)两端设计全长CDNA扩 增引物对：
[0075] Bb-C服基因5'引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT，
[0076] Bb-CHS基因3' 引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。
[0077] 进行抓-C服基因全长序列的克隆：
[007引反应体系为:PCR反应总体积为50iU，1.5mmol/L 1旨(：12,4种(1肿?各200皿01/1，弓| 物各 150ng，l.抓！"aq plus DNA polymerase(高保真），100ng cDNA。
[0079] PrRl^历义化击.
[0080]
[0081 ] PCR产物经检测、回收、亚克隆和测序，获得化-CHS基因全长序列SEQ ID NO: 1，其 编码的氨基酸序列SEQ ID NO:2。
[0082] W上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于W上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种从艾纳香中获得的艾纳香查尔酮合酶基因 Bb-CHS，其特征在于，其核苷酸序列 如SEQ ID NO: 1所示。2. -种权利要求1所述的艾纳香查尔酮合酶基因 Bb-CHS编码的蛋白质，其特征在于:其 氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3. -种权利要求1所述的艾纳香查尔酮合酶基因 Bb-CHS的克隆方法，其特征在于:包括 以下步骤： (1) 从艾纳香叶片中提取总RNA; (2) 以总RNA为模板进行反转录获得cDNA; (3) 设计简并引物对，进行PCR扩增，回收PCR产物，其中，简并引物对为： PFl：TCACCAAACA AAGCCTGTCC, PRl：TCACCCACCT CGTATTTTGC； (4) PCR产物与pGEM-T easy Vector连接，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，采 用蓝白斑筛选阳性克隆，筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，获得Bb-CHS基因片段； (5) 以总RNA为模板，采用SMART? RACE Kit提供的反转录引物合成RACE第一链cDNA;根 据获得Bb-CHS基因片段设计3 '和5 '末端快速扩增引物对，以RACE第一链cDNA为模板进行快 速扩增，其中，3 '和5 '末端快速扩增引物对为： Bb-CHS基因 5 ' RACE 引物：CACAAGGCTA TCAAGATGGG， Bb-CHS基因 3 ' RACE 引物：CGGCCTTCGG TCAAACGGTT; (6) 步骤(5)得到的PCR产物经检测、回收、亚克隆和测序，获得Bb-CHS基因3 '和5 '末端 序列，并进行拼接； (7) 根据上述拼接序列，于Bb-CHS基因开放阅读框两端设计全长cDNA扩增引物对，进行 全长序列的克隆，其中全长cDNA扩增引物对为： Bb-CHS基因 5 ' 引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT， Bb-CHS基因 3 ' 引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。4. 根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于，步骤(5)中5 ' -&3 ' -RACE PCR反应体系 为：TaKaRa Ex Taq(5U/yl)0.4yl;10x Ex Taq BufTer，Mg2+plus 5yl;dNTP Mixture各 2 · 5mmo 1/L，4μ1; 3 ' -RACE-Ready cDNA ΙμL; GSP，lOymol/L，ΙμL; UPM，IOx，5μ1; ddH20补充至 50μ1〇5. 根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于，步骤(7)中Bb-CHS基因全长序列的克 隆的反应体系为:PCR反应总体积为50μ1，1.5mmol/L MgCl2，4种dNTP各200ymol/L，引物各 150ng，1.5U Taq plus DNA polymerase，高保真，IOOng cDNA。6. 根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于，步骤（1)中采用TRNzol法提取总RNA; 步骤（2)中米用TaKaRa公司生产的PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反 转录获得cDNA。7. -种用于克隆权利要求1所述的艾纳香查尔酮合酶基因 Bb-CHS的简并引物对，其特 征在于，所述简并引物对为： PFl：TCACCAAACA AAGCCTGTCC, PRl:TCACCCACCT CGTATTTTGC。8. -种用于克隆权利要求1所述的艾纳香查尔酮合酶基因 Bb-CHS的3 '和5 '末端快速扩 增引物对，其特征在于，所述3 '和5 '末端快速扩增引物对为： Bb-CHS基因 5 ' RACE 引物：CACAAGGCTA TCAAGATGGG， Bb-CHS基因 3 ' RACE 引物：CGGCCTTCGG TCAAACGGTT。9. 一种用于克隆权利要求1所述的艾纳香查尔酮合酶基因 Bb-CHS的全长cDNA扩增引物 对，其特征在于，所述全长cDNA扩增引物对为： Bb-CHS基因 5 ' 引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT， Bb-CHS基因 3 ' 引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。10. -种用于克隆权利要求1所述的艾纳香查尔酮合酶基因 Bb-CHS的引物组，其特征在 于，所述引物组包括简并引物对、3'和5'末端快速扩增引物对、以及全长cDNA扩增引物对， 其中， 所述简并引物对为： PFl：TCACCAAACA AAGCCTGTCC, PRl：TCACCCACCT CGTATTTTGC； 所述3 '和5 '末端快速扩增引物对为： Bb-CHS基因 5 ' RACE 引物：CACAAGGCTA TCAAGATGGG， Bb-CHS基因 3 ' RACE 引物：CGGCCTTCGG TCAAACGGTT; 全长cDNA扩增引物对为： Bb-CHS基因 5 ' 引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT， Bb-CHS基因 3 ' 引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。
【文档编号】C12N15/10GK105925546SQ201610309822
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】官玲亮, 庞玉新, 夏奇峰, 于福来, 黄梅, 胡远鹏, 胡璇, 谢小丽
【申请人】中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所