一种突变的多聚半乳糖醛酸酶pg63t341y及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体设及一种突变的多聚半乳糖醒酸酶PG63T341Y及 其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 当前果蔬汁加工中研究最多应用最为广泛的是果胶解聚酶中的多聚半乳糖醒酸 酶（polygalac化ronase)，多聚半乳糖醒酸酶属于糖巧水解酶第28家族（G肥8)，作用于果 胶质时能随机地从多聚半乳糖醒酸链内部消解a-1，4-糖巧键，产生聚合度为10~14的 寡聚半乳糖醒酸，或从寡聚半乳糖醒酸链的非还原末端消除单个半乳糖醒酸，产生聚合度 逐步降低的寡聚半乳糖醒酸链和半乳糖醒酸单体。多聚半乳糖醒酸酶的水解作用可使其果 汁溶液的粘度显著下降，对果胶有强烈的解聚降粘作用。因此多聚半乳糖醒酸酶是目前商 品化复合果胶酶系中的主要应用酶种。本研究室长期进行各种糖巧水解酶的开发和酶学性 质研究及改良并在国内率先开展了食品果汁酶的研究，在近期的研究中获得一个来自青霉 Penicilliumsp.CGMCC1669的酸性多聚半乳糖醒酸酶PG63,其最适抑值都与苹果汁天然 抑值3. 5 -致且在低溫范围内都能保持稳定的活性，单酶应用试验结果表明它性质优良， 能达到商业复合酶的水平。
[0003] 与其他研究历史较长的糖巧水解酶家族不同，虽然已经注册的多聚半乳糖醒酸酶 序列很多，但真正进行相关研究的并不多。已有的研究主要集中在原酶纯化及性质确定、基 因克隆及序列分析、异源表达和植物组织表达模式分析等。因此，获取具有高催化效率的果 胶酶是当前的研发趋势。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种突变的多聚半乳糖醒酸酶PG63T341Y。 阳0化]本发明的再一目的是提供编码上述突变的多聚半乳糖醒酸酶PG63T341Y的编码 基因。
[0006] 本发明的另一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。
[0007] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0008] 本发明的另一目的是提供一种制备上述突变的多聚半乳糖醒酸酶PG63T341Y的 基因工程方法。
[0009] 本发明W来源于Penicilliumsp.CGMCC1669的多聚半乳糖醒酸酶PG63作为 母本，经理性设计和分子生物学技术而获得的催化效率提高的多聚半乳糖醒酸酶突变体 PG63T341Y。设及到的氨基酸突变点为化r341Tyr。改造后的多聚半乳糖醒酸酶PG63T341Y 催化效率较原酶提高了 17倍。
[0010] 所述突变体氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示（对多聚半乳糖醒酸酶PG63的304 位氨基酸进行定点突变，T虹341Tyr)。
[0014] 本发明还是提供一种制备所述多聚半乳糖醒酸酶突变体的方法，其技术方案如 下：
[0015] 1)采用over-lap PCR的方法扩增所述突变体序列片段；
[0016] 2)将上述突变体序列片段克隆到表达载体pPIC化上，重组载体命名 pPIC化-PG63T341Y;将本发明的多聚半乳糖醒酸酶突变体基因插入到表达载体合适的限制 性酶切位点之间，使其核巧酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最 优选的实施方案，优选为将多聚半乳糖醒酸酶基因插入到质粒PPIC化上的SnaBI和Not I 限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pPIC化-PG63T341Y。
[0017] 3)将突变体重组载体转化宿主细胞，诱导表达，获得突变株，优选所述菌株为大肠 杆菌、酵母菌（毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞等）、芽抱杆菌或乳酸杆菌， 优选将重组表达质粒转化毕赤酵母细胞，得到重组菌株GSl 15/PG63T341Y。
[0018] 本发明还提供了一种制备所述突变体的方法，包括W下步骤：
[0019] 1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0020] 2)培养重组菌株，诱导重组多聚半乳糖醒酸酶表达；
[0021] 3)回收并纯化所表达的突变酶。
[0022] 本发明还提供了上述突变体的应用。
[0023]本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种高催化效率 的、适合于在食品、饲料工业等领域中应用的突变多聚半乳糖醒酸酶。本发明的突变酶最适 pH(pH3. 5-4. 0)与最适溫度（40-50°C)均与原酶保持相当的活性范围，催化效率提高9倍， 能很好的满足食品、饲料工业等领域中应用的需求，有着非常广阔的应用前景。
【具体实施方式】
[0024] 试验材料和试剂
[00巧]1、菌株及载体：表达宿主PichiapastorisGS115,表达质粒载体pPIC化为本实验 室保存。
[0026] 2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自化rmentas公司，连接酶购自Promaga公司， 多聚半乳糖醒酸购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂（均可从普通生化试剂公司购 买得到）。
[0027] 3、培养基： 阳02引（I)LB培养基：0.5%酵母提取物，1 %蛋白腺，1 %化Cl,pH7.0
[0029] 似Yro培养基：1%酵母提取物，2%蛋白腺，2%葡萄糖
[0030] (3)MD固体培养基：2%葡萄糖，1.5%琼脂糖，1.34%YNB'O. 00004%Biotin 阳的1] (4)MM固体培养基：1.5%琼脂糖，1.：34%YNB，0. 00004%Biotin，0. 5% 甲醇 阳03引 （5)BMGY培养基：1 %酵母提取物，2 %蛋白腺，1 %甘油（V/V)，1. 34 %YNB， 0. 00004%Biotin
[0033] (6)BMMY培养基：1%酵母提取物，2%蛋白腺，1.:34% YNB，0. 00004%Biotin, 0.5% 甲醇（V/V)
[0034] 4、本实施例中未做详细具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》（第=版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
[0035] 实施例1本发明中所述突变体所设及的具体定点突变方法如下：
[0036]对多聚半乳糖醒酸酶PG63灯Uan et al.，2011)进行定点突变，突变位点设计为第 95位组氨酸突变为络氨酸。通过over lapPCR的方法引入突变位点，并对其进行测序验 证，获得突变基因PG63T341Y。设计所用引物如表1所示：
[0037] 表1.所述突变体PG63T341Y特异性引物
[0039]实施例2所述突变体的制备。
[0040] 将表达载体pPIC化进行双酶切（SnaBI+NotI)，同时将编码所述突变体的基 因PG63T341Y双酶切（SnaBI+NotI)，切好的编码成熟所述突变体的基因片段（去除信 号肤片段）与表达载体pPIC化连接，获得含有所述突变体基因PG63T341Y的重组质粒 pPIC化-PG63T341Y并转化毕赤酵母GSl15,获得重组酵母菌株GSl15/PG63T341Y。
[0041] W同样的方法，构建包含信号肤序列的重组表达载体，并转化宿主。
[0042] 取含有重组质粒的GSl15菌株，接种于300血BMGY培养基的ILS角瓶中，置于 30°C，220巧m摇床培养4她；后将培养液3000g离屯、5min，弃上清，沉淀用IOOmL含有0. 5% 甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30°C，220巧m条件下诱导培养。每隔1化补加0. 5血 甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0. 5%，同时取上清用于酶活性检测。
[0043] 实施例3所述突变体和野生型的活性分析 W44] -、DNS法：具体方法如下：在给定的抑、溫度条件下，1血的反应体系包括100yL 适当的稀释酶液，900yL底物，反应lOmin，加入1. 5血DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后 540nm测定OD值。1个酶活单位扣）定义为在给定的条件下，每分钟分解多聚半乳糖醒酸 生成Iymol0-(+)-半乳糖醒酸所需的酶量。
[0045] 二、所述突变体和野生型的性质测定
[0046] 1、所述突变体和野生型的最适抑测定方法如下：
[0047] 将实施例2纯化的突变酶和野生型在不同的抑下进行酶促反应W测定其最适抑。 底物多聚半乳糖醒酸用不同抑的0.Imol/L巧樣酸-憐酸氨二钢缓冲液中50°C下进行多聚 半乳糖醒酸酶活力测定。结果表明，所述突变体和野生型的最适反应抑相近，为3. 5-4. 0， 且在抑2. 5-7. 0范围内有相同的作用趋势。
[0048] 2、所述突变体和野生型的最适溫度测定方法如下：
[0049] 所述突变体和野生型的最适溫度的测定为在0.1mol/L巧樣酸-憐酸氨二钢缓冲 液（pH4.0)缓冲液体系及不同溫度下进行酶促反应。酶反应最适溫度测定结果表明，所 述突变体与野生型最适溫度相近，为40-50°C，且在0-80°C下有相同的作用趋势。
[0050] 3、重组高催化效率多聚半乳糖醒酸酶突变体和野生型的动力学参数测定方法如 下：
[0051] 参照李宁的方法（李宁，2009)，测定反应的一级反应时间。确定测定Km及Vmax的 反应时间为5min。用不同浓度的多聚半乳糖醒酸（1. 〇,〇. 5,0. 4,0. 3,0. 2,0. 1和0. 05% ) 为底物，在最适条件（溫度、pH)下测定酶活性，计算出相应的反应速度，利用GraFit7软件 计算Km及Vmax值。
[0052]W多聚半乳糖醒酸为底物时，重组高催化效率多聚半乳糖醒酸酶突变体和野生型 在40°C、pH4. 0下动力学参数为：
[0053]
[0054] 改造后突变体PG63T341Y的催化效率化。。,/1〇较野生酶提高17倍，能很好的满足 食品、饲料工业等领域中应用的需求。
【主权项】
1. 一种突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63T341Y，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。2. 多聚半乳糖醛酸酶突变体基因，其特征在于，编码权利要求1所述突变的多聚半乳 糖醛酸酶PG63T341Y。3. 根据权利要求2所述的多聚半乳糖醛酸酶突变体基因，其特征在于，所述基因的核 苷酸序列如SEQIDNO. 2所示。4. 包含权利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶突变体基因的重组载体。5. 包含权利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶突变体基因的重组载体pPIC9r。6. 包含权利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶突变体基因的重组菌株。7. 根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌、酵母菌、 芽孢杆菌或乳酸杆菌。8. 制备权利要求1所述突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63T34IY的方法，其特征在于，包含 以下步骤： ① 用包含权利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶突变体基因的重组载体转化宿主细胞，制 备获得重组菌株； ② 培养重组菌株，诱导突变酶表达； ③ 将表达后的突变酶回收并采用亲和层析制备突变酶。9. 权利要求1所述突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63T341Y的用途。10. 权利要求1所述突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63T341Y的用途作为添加剂在食品或 动物饲料领域的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63T341Y及其编码基因，涉及基因工程和遗传工程领域。本发明以来源于Penicillium？sp.CGMCC？1669的多聚半乳糖醛酸酶PG63作为母本，经理性设计和分子生物学技术而获得的催化效率提高的多聚半乳糖醛酸酶突变体PG63T341Y。涉及到的氨基酸突变点为Thr341Tyr。改造后的多聚半乳糖醛酸酶PG63T341Y催化效率较原酶提高了17倍。
【IPC分类】C12N15/56, C12N1/21, C12N1/19, C12N15/81, C12N9/26
【公开号】CN105219751
【申请号】CN201510742027
【发明人】姚斌, 罗会颖, 涂涛, 王亚茹, 孟昆, 王苑, 黄火清, 石鹏君, 柏映国, 苏小运
【申请人】中国农业科学院饲料研究所
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月4日