一种多聚半乳糖醛酸酶PG7fn及其基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种多聚半乳糖醛酸酶PG7fn及其基因和应用。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。多聚半乳糖醛酸酶PG7fn最适pH值为5.0，最适温度为60℃；在pH 3.0-8.0下37℃处理1h还保持90％的酶活力，在50℃下处理1h之后还保持85％的酶活力，这说明此酶具有很好的pH稳定性和热稳定性。利用毕赤酵母表达后，比活高达27,561U/mg。
【专利说明】一种多聚半乳糖醛酸酶PG7fn及其基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种多聚半乳糖醛酸酶PG7fn及其基因和应 用。
【背景技术】
[0002] 果胶是一类带负电的高分子杂多糖，是果蔬植物细胞中胶层的主要成分，广泛存 在于各类高等植物尤其是水果和蔬菜的组织中（Stevenson et al.，1988)。果胶质含有由 不同酯化度的D-半乳糖醛酸以α-1，4糖苷键连接而成的多糖链，侧链常带有阿拉伯糖、 鼠李糖、木糖、半乳糖等成分，是非淀粉多糖（NSP)的成分之一。果胶质填充在植物的细胞 壁之间，具有使细胞粘合在一起的作用。果胶类物质可分为4类：原果胶（protopectin)、 果胶（pectin)、果胶酸（pectic acid, pectate)和果胶酯酸（pectinic acid, pectinate)。 果胶作为细胞初生壁中间层结构的主要成分，它与纤维素、半纤维素一起构成一个植物细 胞阻挡外界的坚韧屏障（O'Neill et al.，2004)，所以在很多工业生产中果胶是一种不利 因素需要去除，而果胶酶则能有效降解果胶。
[0003] 在众多的果胶酶系中，多聚半乳糖醒酸酶（Polygalacturonase)是降解果胶骨架 结构的主要酶种之一，同时也是果蔬汁加工中应用最为广泛的酶。根据消去半乳糖醛酸的 方式不同，多聚半乳糖醛酸酶分为内切PG酶（EC3. 2. 1. 15)和外切PG酶（EC3. 2. 1.67)两 种。内切PG酶能随机地从多聚半乳糖醛酸链内部打开α-1，4糖苷键，产生聚合度为10- 14的寡聚半乳糖醛酸。内切PG酶的水解作用可使果汁溶液的澄清度提升，粘度显著下降， 产生强烈的解聚降粘作用，是目前商品化复合果胶酶系中的主要组成酶种。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种能高效应用的多聚半乳糖醛酸酶。
[0005] 本发明的再一目的是提供编码上述多聚半乳糖醛酸酶的基因。
[0006] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
[0007] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0008] 本发明的另一目的是提供一种制备上述多聚半乳糖醛酸酶的基因工程方法。
[0009] 本发明从Thielavia arenaria ΧΖ7中分离得到一种多聚半乳糖醒酸酶PG7fn，其 氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] MILSTLVLSLGALAAANPVPANSNLSKRASCTFTDATSAISGKKSCSTITLKDITVPAGTTLDLTKLND GTKVIFSGTTTFGYKEWEGPLISVSGNNILVEGATGHVIDGNGAKWWDGKGSNGGKTKPKFFYAHSMKNSNIKGLHV KNTPVQAFSINGATNLGVYDVSLDNSAGDSAGGHNTDAFDVGSSNGVYISGAVVKNQDDCLAINSGTNITFTGGKCS GGHGLSIGSVGGRSDNTVKTVRILNSSISNSQNGVRIKTVYGATGSVSDVKYEGITLSGITKYGVVIEQDYENGSPT GTPTAGVPITDLTLNGVTGSVSSGATEVYILCAKGACKNWTWNKVSVTGGKKSAKCENVPSPASC
[0011] 该酶包括365个氨基酸，N端16个氨基酸为信号肽序列。
[0012] 因此，成熟的多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0013] NPVPANSNLSKRASCTFTDATSAISGKKSCSTITLKDITVPAGTTLDLTKLNDGTKVIFSGTTTFGYKE WEGPLISVSGNNILVEGATGHVIDGNGAKWWDGKGSNGGKTKPKFFYAHSMKNSNIKGLHVKNTPVQAFSINGATNL GVYDVSLDNSAGDSAGGHNTDAFDVGSSNGVYISGAVVKNQDDCLAINSGTNITFTGGKCSGGHGLSIGSVGGRSDN TVKTVRILNSSISNSQNGVRIKTVYGATGSVSDVKYEGITLSGITKYGVVIEQDYENGSPTGTPTAGVPITDLTLNG VTGSVSSGATEVYILCAKGACKNWTWNKVSVTGGKKSAKCENVPSPASC
[0014] 信号肽序列为 MILSTLVLSLGALAAA(SEQ ID NO. 3).
[0015] 本发明提供了编码上述多聚半乳糖醛酸酶基因 PG7fn，具体地，该基因的基因组序 列（含有两个内含子）如SEQ ID NO. 4所示。
[0016] ATGATCTTGTCCACCCTCGTTCTTTCTCTCGGCGCCCTTGCGGCAGCCAATCCGGTCCCTGCCAACTCC AACTTGTCCAAGAGAGCTAGCTGCACCTTTACTGACGCCACATCGGCCATCAGCGGCAAGAAGAGCTGCAGCACCAT CACCCTGAAGGATATTACGGTCCCGGCTGGAACCACCTTGGACCTGACCAAGCTGAACGACGGCACAAAGGTCATCT TCTCTGGGACCACCACGTTCGGCTACAAGGAGTGGGAGGGTCCCCTGATTTCTGTTTCTGGAAACAACATCCTTGTG GAGGGCGCCACAGGTCATGTCATTGACGGCAACGGAGCCAAGTGGTGGGATGGCAAGGGCAGCAACGGTGGCAAGAC GAAGCCTAAGTAGGGGTGTCCAGTCTTTGTTCAGATCAAAATCGCAACTAATCATCTCCCAGATTCTTCTACGCCCA TAGCATGAAGAACTCCAACATCAAAGGCCTCCATGTTAAGAACACGCCCGTTCAGGCCTTCAGCATCAACGGTGCCA CAAACCTCGGGGTGTAAGTTACAGCCCAAGTGTGATATATAGCACCCCGCAGGGTCTCCAGTTGGGACTAACATGAA GAAACAGCTACGACGTCAGTCTTGACAACTCGGCCGGCGACAGTGCCGGTGGCCACAACACGGACGCATTCGACGTC GGATCCTCCAACGGTGTCTACATCTCTGGCGCCGTGGTGAAGAACCAGGACGACTGCCTGGCCATCAACTCAGGCAC CAACATCACCGTATGTTTTCTTTTACCCCTCAAACTTGACAACCCCCTTACCCAGCTCCTAACCCCAACATCTGGCA GTTTACCGGCGGCAAATGCAGCGGCGGCCACGGCCTCTCGATCGGCTCCGTCGGGGGCCGATCCGACAACACGGTCA AAACAGTACGCATCCTCAACTCGTCCATCAGCAACTCGCAGAACGGTGTGCGCATCAAGACGGTGTATGGCGCGACG GGGTCTGTCTCGGACGTGAAGTACGAGGGTATCACGCTGTCCGGCATTACCAAGTACGGTGTGGTTATCGAGCAGGA CTATGAGAATGGCTCCCCCACGGGCACACCCACTGCGGGCGTTCCGATTACGGATCTGACGCTGAATGGCGTTACGG GGAGTGTGAGTTCCGGTGCGACAGAGGTGTATATCCTCTGTGCTAAGGGGGCTTGCAAGAATTGGACTTGGAATAAG GTCAGTGTTACGGGCGGGAAGAAGTCGGCTAAGTGTGAGAATGTGCCTAGTCCGGCATCTTGCTAG
[0017] 该基因的cDNA序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0018] ATGATCTTGTCCACCCTCGTTCTTTCTCTCGGCGCCCTTGCGGCAGCCAATCCGGTCCCTGCCAACTCC AACTTGTCCAAGAGAGCTAGCTGCACCTTTACTGACGCCACATCGGCCATCAGCGGCAAGAAGAGCTGCAGCACCAT CACCCTGAAGGATATTACGGTCCCGGCTGGAACCACCTTGGACCTGACCAAGCTGAACGACGGCACAAAGGTCATCT TCTCTGGGACCACCACGTTCGGCTACAAGGAGTGGGAGGGTCCCCTGATTTCTGTTTCTGGAAACAACATCCTTGTG GAGGGCGCCACAGGTCATGTCATTGACGGCAACGGAGCCAAGTGGTGGGATGGCAAGGGCAGCAACGGTGGCAAGAC GAAGCCTAAATTCTTCTACGCCCATAGCATGAAGAACTCCAACATCAAAGGCCTCCATGTTAAGAACACGCCCGTTC AGGCCTTCAGCATCAACGGTGCCACAAACCTCGGGGTCTACGACGTCAGTCTTGACAACTCGGCCGGCGACAGTGCC GGTGGCCACAACACGGACGCATTCGACGTCGGATCCTCCAACGGTGTCTACATCTCTGGCGCCGTGGTGAAGAACCA GGACGACTGCCTGGCCATCAACTCAGGCACCAACATCACCTTTACCGGCGGCAAATGCAGCGGCGGCCACGGCCTCT CGATCGGCTCCGTCGGGGGCCGATCCGACAACACGGTCAAAACAGTACGCATCCTCAACTCGTCCATCAGCAACTCG CAGAACGGTGTGCGCATCAAGACGGTGTATGGCGCGACGGGGTCTGTCTCGGACGTGAAGTACGAGGGTATCACGCT GTCCGGCATTACCAAGTACGGTGTGGTTATCGAGCAGGACTATGAGAATGGCTCCCCCACGGGCACACCCACTGCGG GCGTTCCGATTACGGATCTGACGCTGAATGGCGTTACGGGGAGTGTGAGTTCCGGTGCGACAGAGGTGTATATCCTC TGTGCTAAGGGGGCTTGCAAGAATTGGACTTGGAATAAGGTCAGTGTTACGGGCGGGAAGAAGTCGGCTAAGTGTGA GAATGTGCCTAGTCCGGCATCTTGCTAG
[0019] 去除信号肽序列后核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0020] AATCCGGTCCCTGCCAACTCCAACTTGTCCAAGAGAGCTAGCTGCACCTTTACTGACGCCACATCGGCC ATCAGCGGCAAGAAGAGCTGCAGCACCATCACCCTGAAGGATATTACGGTCCCGGCTGGAACCACCTTGGACCTGAC CAAGCTGAACGACGGCACAAAGGTCATCTTCTCTGGGACCACCACGTTCGGCTACAAGGAGTGGGAGGGTCCCCTGA TTTCTGTTTCTGGAAACAACATCCTTGTGGAGGGCGCCACAGGTCATGTCATTGACGGCAACGGAGCCAAGTGGTGG GATGGCAAGGGCAGCAACGGTGGCAAGACGAAGCCTAAATTCTTCTACGCCCATAGCATGAAGAACTCCAACATCAA AGGCCTCCATGTTAAGAACACGCCCGTTCAGGCCTTCAGCATCAACGGTGCCACAAACCTCGGGGTCTACGACGTCA GTCTTGACAACTCGGCCGGCGACAGTGCCGGTGGCCACAACACGGACGCATTCGACGTCGGATCCTCCAACGGTGTC TACATCTCTGGCGCCGTGGTGAAGAACCAGGACGACTGCCTGGCCATCAACTCAGGCACCAACATCACCTTTACCGG CGGCAAATGCAGCGGCGGCCACGGCCTCTCGATCGGCTCCGTCGGGGGCCGATCCGACAACACGGTCAAAACAGTAC GCATCCTCAACTCGTCCATCAGCAACTCGCAGAACGGTGTGCGCATCAAGACGGTGTATGGCGCGACGGGGTCTGTC TCGGACGTGAAGTACGAGGGTATCACGCTGTCCGGCATTACCAAGTACGGTGTGGTTATCGAGCAGGACTATGAGAA TGGCTCCCCCACGGGCACACCCACTGCGGGCGTTCCGATTACGGATCTGACGCTGAATGGCGTTACGGGGAGTGTGA GTTCCGGTGCGACAGAGGTGTATATCCTCTGTGCTAAGGGGGCTTGCAAGAATTGGACTTGGAATAAGGTCAGTGTT ACGGGCGGGAAGAAGTCGGCTAAGTGTGAGAATGTGCCTAGTCCGGCATCTTGCTAG
[0021] 其中，信号肽的基因序列如SEQ ID NO. 7所示。
[0022] ATGATCTTGTCCACCCTCGTTCTTTCTCTCGGCGCCCTTGCGGCAGCC
[0023] 本发明还提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的重组载体，优选为 pPIC9r-PG7fn。
[0024] 本发明还提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的重组菌株，优选所述菌株为 大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。
[0025] 本发明还提供了一种制备高比活多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的方法，包括以下步 骤：
[0026] 1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0027] 2)培养重组菌株，诱导重组多聚半乳糖醛酸酶表达；
[0028] 3)回收并纯化所表达的多聚半乳糖醛酸酶PG7fn。
[0029] 此低温多聚半乳糖醛酸酶的理论分子量为37. 4kDa。该多聚半乳糖醛酸酶PG7fn 的最适pH为5. 0,在pH4. 0?5. 5的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的70%以上。多 聚半乳糖醛酸酶PG7fn在pH 3. 0-8. 0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶 活性近90%，这说明此酶具有较好的pH稳定性；最适温度60°C，在40°C -65°C范围内，酶活 性均维持在最大酶活性的60%以上。多聚半乳糖醛酸酶PG7fn在50°C下处理60min后剩 余酶活性在85%以上，这说明此酶具有很好的热稳定性。利用毕赤酵母表达后，比活高达 27, 561U/mg。
[0030] 本发明还提供了编码上述多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的基因 PG7fn。
[0031] 本发明通过PCR的方法分离克隆了这一多聚半乳糖醛酸酶基因 PG7fn，DNA全序列 分析结果表明，多聚半乳糖醛酸酶PG7fn结构基因 PG7fn全长1098bp，编码365aa和一个 终止密码子，N端16个氨基酸预测为信号肽序列。蛋白理论分子量为37. 4kDa，等电点为 8. 78,有一个第二十八家族的催化结构域。在GenBank中的比对结果表明PG7fn是一个新 的内切多聚半乳糖醛酸酶。
[0032] 本发明还提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶基因的重组载体，优选为 pPIC9r-PG7fn。将本发明的多聚半乳糖醛酸酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点 之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施 方案，优选为将多聚半乳糖醛酸酶基因插入到质粒pPIC9r上的EcoR I和Not I限制性酶 切位点之间，得到重组表达质粒pPIC9r-PG7fn。
[0033] 本发明还提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶基因的重组菌株，优选为重组菌株 GS115/PG7fn。
[0034] 本发明还提供了一种制备多聚半乳糖醛酸酶的方法，包括以下步骤：
[0035] 1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0036] 2)培养重组菌株，诱导重组多聚半乳糖醛酸酶的表达；
[0037] 3)回收并纯化所表达的多聚半乳糖醛酸酶。
[0038] 其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵 母细胞GS115，得到重组菌株GS115/PG7fn。
【专利附图】
【附图说明】
[0039] 图1 :在毕赤酵母中表达的重组多聚半乳糖醛酸酶的SDS-PAGE分析，其中，M:低分 子量蛋白质Marker ;1:去糖基化处理的酶液；2:纯化的酶液。
[0040] 图2 :重组多聚半乳糖醛酸酶的最适pH。
[0041] 图3 :重组多聚半乳糖醛酸酶的pH稳定性。
[0042] 图4 :重组多聚半乳糖醛酸酶的最适温度。
[0043] 图5 :重组多聚半乳糖醛酸酶的热稳定性。
[0044] 图6 :用HPAEC对重组多聚半乳糖醛酸酶以PGA为底物时的产物分析。
【具体实施方式】
[0045] 试验材料和试剂
[0046] 1、菌株及载体：表达宿主Pichia pastoris GS115,表达质粒载体pPIC9r为本实 验室保存。
[0047] 2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司， 多聚半乳糖醛酸购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂（均可从普通生化试剂公司购 买得到）。
[0048] 3、培养基：
[0049] (1) LB 培养基（g/Ι):酵母粉 5.0,蛋白胨 10.0, NaCl 10.0, ρΗ7·0。
[0050] (2)平板筛选培养基（g/1):酵母粉5· 0,蛋白胨10. 0, NaCl 10. 0,琼脂15. 0， ρΗ7· 0。
[0051] 实施例1沙栖梭孢壳ΧΖ7来源的多聚半乳糖醛酸酶编码基因 PG8fn的克隆
[0052] 提取基因组DNA及RNA。根据第二十八家族内切多聚半乳糖醛酸酶真菌基因的保 守[NQDDCL(V)A和NGVRI (V)KT]序列设计合成了简并引物G28n-F和G28n-R :
[0053] G28n-F :5'-GAACCARGAYGAYTGYSTIGC-3' ；
[0054] G28n-R :5'-GGTCTTNAYNCKNACICCRTT-3'
[0055] 以上述的沙栖梭孢壳XZ7基因组DNA为模板进行PCR扩增。降落PCR反应参数为： 94°C变性5min ;94°C变性30sec，51-46°C退火30sec，72°C延伸lmin，10个循环（每个循环 降落0. 5°C )，然后94°C变性30sec，46°C退火30sec，72°C延伸lmin，30个循环，72°C保温 lOmin。得到一约180bp片段，将该片段回收后与连接pEASY-T3载体送三博生物技术有限 公司测序。
[0056] 根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计 方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在spl的内侧，sp3位于sp2的内侧。每 两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般20?30nt，退火温度在61°C。并将它们 分别命名为7fn-uSPl，7fn-uSP2, 7fn-uSP3(上游特异性引物）；
[0057] 7fn-dSPl，7fn-dSP2, 7fn-dSP3 (下游特异性引物）见表 1。按照改进的 TAIL-PCR 中的程
[0058] 序对两端侧翼序列进行扩增。
[0059] 表1.多聚半乳糖醛酸酶PG8fn TAIL-PCR特异性引物
[0060]
【权利要求】
1. 一种多聚半乳糖醛酸酶PG7fn，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1或2所示。
2. -种多聚半乳糖醛酸酶基因 PG7fn，其特征在于，其编码权利要求1所述的多聚半乳 糖醛酸酶PG7fn。
3. 根据权利要求2所述的多聚半乳糖醛酸酶基因 PG7fn，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 5 或 SEQ ID NO. 6 所示。
4. 包含权利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶基因 PG7fn的重组载体。
5. 包含权利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶基因 PG7fn的重组载体pPIC9r-PG7fn。
6. 包含权利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶基因 PG7fn的重组菌株。
7. 如权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，其所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢 杆菌或乳酸杆菌。
8. 根据权利要求7所述的重组菌株，所述重组菌株为重组毕赤酵母菌株GS115/PG7fn。
9. 权利要求1所述多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的应用。
10. -种制备权利要求1所述多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的方法，其特征在于，所述方法 包括以下步骤： 1) 用权利要求4所述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2) 培养重组菌株，诱导重组多聚半乳糖醛酸酶表达； 3) 回收并纯化所表达的多聚半乳糖醛酸酶PG7fn。
【文档编号】C12N15/56GK104232604SQ201410419780
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年8月24日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】姚斌, 孟昆, 涂涛, 石鹏君, 黄火清, 王亚茹, 杨培龙, 罗会颖, 师霞, 其他发明人请求不公开姓名 申请人:中国农业科学院饲料研究所