酶促修饰果胶的方法

专利名称：酶促修饰果胶的方法
技术领域：
本发明涉及一种方法。
本发明具体涉及使用酶的方法。
本发明更具体地涉及酶促修饰果胶的方法。
果胶是结构多糖，在植物细胞壁中通常以原果胶的形式存在。果胶的骨架含有(1→4)连接的-α-D-半乳糖醛酸残基，其中间插含有少量(1→2)连接的-α-L-鼠李糖单位。
此外，果胶含有高度分支的区域，该区域具有几乎交替出现的鼠李糖-半乳糖醛酸聚糖链。这些高度分支的区域还含有其它糖单位(如D-半乳糖，L-阿拉伯糖和木糖)，这些糖单位通过糖苷键与鼠李糖单位的C3或C4原子或半乳糖醛酸单位的C2或C3原子结合。通常，将-(1→4)-α连接的半乳糖醛酸残基长链称为“光滑”区，而将高度分支的区域称为“具毛区”。
半乳糖醛酸残基的一些羧基被酯化(例如羧基被甲基化)。例如，一些半乳糖醛酸残基被甲醇酯化。典型的羧基酯化发生在半乳糖醛酸残基聚合之后。然而，所有羧基都被酯化(如甲基化)的情况十分罕见。
通常，酯化的程度为0-90％不等。如果50％或更多的羧基被酯化，所得果胶被称为“高酯果胶”(简称为“HE果胶”)或“高甲氧基果胶”。如果低于50％的羧基被酯化，所得果胶被称为“低酯果胶”(简称为“LE果胶”)或“低甲氧基果胶”。如果50％的羧基被酯化，所得果胶被称为“中酯果胶”(简称为“ME果胶”)或“中甲氧基果胶”。如果果胶不含任何-或仅含极少量酯化基团，通常称之为果胶酸。
果胶的结构，特别是酯化(如甲基化)程度决定着果胶很多的所得物理和/或化学特性。例如，果胶的胶凝作用取决于果胶的化学结构，尤其是酯化程度。此外，果胶的胶凝作用还取决于可溶性固体的含量，pH和钙离子浓度。关于后者，已知钙离子与游离羧基，尤其是LE果胶上的游离羧基形成复合物。
根据果胶酶进攻果胶分子的聚半乳糖醛酸部分所采取的模式对其进行分类。有关一些果胶酶的评论可参见Pilnik和Voragen(食品酶学，编者P.F.Fox；Elsevier；(1991)；pp303-337)。特别是，也被称为PME的果胶甲脂酶(EC 3.1.1.11)可以使HE果胶脱酯，成为LE果胶或果胶酸。与之相反，例如，果胶解聚酶可以裂解半乳糖醛酸甲酯残基之间的糖苷键。
更详细地，PME活性可产生游离羧基和游离甲醇。自动滴定可以容易地监测游离羧基的增加。在这一点上，早期研究已证实一些PME能以随机的方式使果胶脱酯，也就是说它们能使一个或一个以上果胶链上的任何酯化(如甲基化)半乳糖醛酸残基脱酯。能随机地使果胶脱酯的PME的例子可得自真菌来源，例如棘孢曲霉(参见WO94/25575)和日本曲霉(Ishii等，1980，食品科学杂志，44，p611-14)。Baron等(1980Lebensm.Wiss.μ-Technol，13pp 330-333)显然已从黑曲霉中分离到真菌的PME。据报道，该真菌PME的分子量为39000D，等电点为3.9，最适pH为4.5，Km值(mg/ml)为3。
与之相反，已知一些PME以分段的方式使果胶脱酯，也就是说，据信它们在非-还原末端或游离羧基的邻接处进攻果胶，然后通过单链机制沿着果胶分子前进，从而产生对钙敏感的非-酯化半乳糖醛酸单位区段。例如，植物PME能以分段的方式酶促果胶脱酯。有人提出柑橘中存在12种PME同工型(Pilnik W.和Voragen A.G.J(食品酶学，编者P.F.Fox；Elsevier；(1991)；pp303-337))。这些同工型具有不同的特性。
高效离子交换层析可以区分游离羧基的随机或分段分布(Schols等，食品水胶体，1989，6，pp115-121)。这些试验经常被用于检查经巴氏灭菌之后的柑橘汁中残留的PME活性，因为残留的PME除了会导致橘汁中甲醇的累积外，还可导致橘汁中所谓的“云状物损失”。
PME底物，如得自天然植物来源的果胶通常为具有约70％DE的高酯果胶形式。必须在含有这些高酯PME底物的提取物中加入糖，以提供足量的可溶性固体来诱导胶凝。通常最少需要55％可溶性固体。
可能会发生凝缩。例如，当使用HE-果胶时，可溶性固体含量低(＜55％)的橘子酱和果酱中会发生凝缩。然而，上述应用并不经常使用HE-果胶。如果使用果胶，如在SS＜55％的果酱中，一般会使用酰胺化果胶或LE-果胶。
当发生凝缩时，必须使用昂贵的添加剂来诱导胶凝作用。
Versteeg等(食品科学杂志，45(1980)p969-971)显然已从橙子中分离出PME。据报道，这种植物PME以多种具有不同特性的同工型存在。同工型I的分子量为36000D，等电点为10.0，最适pH为7.6，Km值(mg/ml)为0.083。同工型II的分子量为36200D，等电点为11.0，最适pH为8.8，Km值(mg/ml)为0.0046。同工型III(HMW-PE)的分子量为54000D，等电点为10.2，最适pH为8，Km值(mg/ml)为0.041。然而，迄今为止关于这些PME的序列数据知之甚少。
根据Pilnik和Voragen(文献同上)的报道，已在多种其它高等植物中发现PME，所述植物如苹果，杏，鳄梨，香蕉，浆果，酸橙，柚子，中国柑橘，樱桃，黑醋栗，葡萄，芒果，番木瓜，西番莲，桃，梨，李子，豆，胡萝卜，花椰菜，黄瓜，韭菜，洋葱，豌豆，马铃薯，萝卜和番茄。然而，迄今为止关于这些PME的序列数据同样知之甚少。
WO-A-97/03574中报道了一种植物PME(该文献的内容列入本文作为参考)。该PME具有下列特征分子量约为36kD至约64kD；当用0.15M NaCl中的0.5％酸橙果胶测定时，最适pH为pH7-8；最适温度至少为50℃；温度稳定性范围为10℃-至少40℃；Km值为0.07％；在NaCl水平约为0.25M时活性最大；在Na2SO4水平约为0.2M时活性最大；和在NaNO3水平约为0.3M时活性最大。
WO97/31102中报道了另一种PME(该文献的内容列入本文作为参考)。
PME在工业上具有重要的用途。例如，它们可用于或用作钙离子的螯合剂。在这一点上，根据Pilnik和Voragen(文献同上)，可在榨汁后的柑橘皮中添加氢氧化钙浆液以制备牛饲料。添加之后，高pH和钙离子能激活柑橘皮中的任何天然PME，导致果胶快速脱酯，发生果酸钙凝结作用。结合的液相被释放，并且易于被压出，使得仅有一小部分原始水含量需要通过昂贵的热干燥法被除去。压出的溶液也可用作动物饲料。
如上所述，已从棘孢曲霉(参见WO94/25575)中得到PME。显然，这种PME可用于改善含果胶物质的硬度，或者使果胶去甲基化，或者增加含果胶物质的粘度。
另外，经常在由含果胶的水果或蔬菜物料制备的食品(如果酱或防腐剂)中使用PME。例如，WO-A-94/25575还报道了使用得自棘孢曲霉的PME制备橘子酱和番茄酱的方法。
JP-A-63/209553中公开了在多价金属离子的存在下，果胶甲脂酶作用于果胶多糖而获得的凝胶及其生产方法，其中所述果胶多糖含有高-甲氧基多聚α-1，4-D-galacturonide链作为主要成分。
Pilnik和Voragen(文献同上)列出了内源性PME的用途，包括如果果汁中含有太多得自水果的果胶的话，将所述PME加入果汁中以降低果汁的粘度，将所述PME作为果胶酶溶液加入气泡中，从而便于从未经触动的果汁部分除去果皮和其它膜，所述气泡反映了柑橘已被加热至20℃至40℃的核心温度(US-A-4284651)；将所述PME用于保护和改善几种经加工的水果和蔬菜的结构和硬度，所述水果和蔬菜如苹果(Wiley & Lee 1970食品技术，24，1168-70)，罐装番茄(Hsu等，1965，食品科学杂志，30，583-588)和马铃薯(Bartolome & Hoff 1972农业食品化学杂志20，p262-266)。
据Glahn和Rolin(1994 Food Ingredients Europe，Conf Proceedings p252-256)报道了工业上的“YM-100型GENU果胶”与酸奶饮料相互作用的假设应用。关于如何制备YM-100型GENU果胶，未提供任何细节。
EP-A-0664300公开了制备钙敏感型果胶的化学分级分离法。据说这种钙敏感型果胶对食品工业较为有利。
Plastow G.S(1988，分子微生物学，2(2)247-254)报道了菊欧文氏杆菌B374的果胶甲脂酶基因。据作者称“欧文氏杆菌基因的分离提供了一种简单的生产PME的方法，所述PME不含解聚的果胶酶，从而扩展了其潜在的用途”。
Plastow G.S还提到“由大肠杆菌上清液生产的PME已被成功地用于使高-甲氧基果胶脱酯，从而生产出钙-敏感型凝胶。所得凝胶等同于用提取自橘子皮的酶产生的果胶酸盐所制备的凝胶(结果未公开)”。
因此，除了PME外，果胶和脱酯果胶都具有重要的工业用途。
然而，如PCT/IB98/00673(1998年4月24日提交)所报道，使用PME制备例如食品的益处在某种程度上取决于所用PME的质，量和类型，和PME底物，尤其是果胶的质，量和类型，所述底物可能存在于制备食品所用的物质中。例如，如果底物源自水果或蔬菜，对不同类型的水果或蔬菜而言，所述底物中天然果胶的量和/或结构将有所不同。这一点也可由WO-A-94/25575，尤其是图7中所述的数据证实，从中可以清楚地看出其PME系统不甚理想。
根据本发明的第一方面，提供了用果胶甲脂酶(PME)处理果胶的方法；其中PME不是植物PME；但其中PME能表现出至少一种植物PME的特性；其中至少一种植物PME的特性包括至少分段式地使果胶脱酯。
根据本发明的第二方面，提供了经PME处理的果胶，所述果胶是通过本发明的方法制备的。
根据本发明的第三方面，提供了含有经PME处理的果胶的食品，所述果胶是通过本发明的方法制备的。
根据本发明的第四方面，提供了如本文所限定的PME的用途，所述用途是以分段的方式减少果胶中的酯基数目。
根据本发明的第五方面，提供了如本文所限定的PME的用途，所述用途是使至少基本上所有果胶链上的两个或多个邻接的果胶半乳糖醛酸残基脱酯。
本发明还涉及下列任何一个或多个主题构建体，其表达或含有如本文所限定的PME或如本文所限定的核苷酸序列。
载体，其表达或含有本发明的构建体或如本文所限定的PME或如本文所限定的核苷酸序列。
构建体组合，其含有至少第一种构建体和第二种构建体，其中所述第一种构建体表达或含有如本文所限定的PME酶或如本文所限定的核苷酸序列，第二种构建体含有所需基因(GOI)和启动子。
细胞，组织或器官，其表达或含有本发明的载体，或本发明的构建体，或如本文所限定的PME，或如本文所限定的核苷酸序列，或本发明的构建体组合。
转基因生物体，其表达或含有细胞，组织或器官，其中所述细胞，组织或器官表达或含有本发明的载体，或本发明的构建体，或如本文所限定的PME，或如本文所限定的核苷酸序列，或本发明的构建体组合。
重组PME酶，该酶能与抗本文所限定PME酶的抗体发生免疫学反应。
除了所附序列表中所示的序列(及其片断，衍生物或同系物)外，本发明还包括与上述序列表中的序列互补的序列(及其片断，衍生物或同系物)。本发明还包括能与上述序列表中的序列杂交的序列(及其片断，衍生物或同系物)。本发明还包括与上述序列表中的序列的杂交序列互补的序列(及其片断，衍生物或同系物)。
本发明还涉及本文所提供的新的氨基酸序列和新的核苷酸序列。
优选所述新的氨基酸序列和新的核苷酸序列是分离的和/或纯化的。本文中的术语“分离的”和“纯化的”指的是从其天然环境中提取，并从至少一种与其天然相关的其它组分中分离的分子，或者是核酸或者是氨基酸序列。
本发明基于令人十分惊奇的发现，即可以从非植物来源中获得PME，所述PME能以分段的方式使果胶脱酯，但所述PME具有与植物PME类似的特性。
更具体地，本发明基于令人十分惊奇的发现，即可以从细菌来源中获得PME，所述PME能以分段的方式使果胶脱酯。
本发明与诸如Plastow G.S(文献同上)的教导是有区别的，因为作者未公开果胶分段式的脱酯作用。另外，该作者提到未公开的工作包括与“提取自橘皮的酶”之间的比较-但仍未详细提供比较研究中所用酶的类型，更不用说酶活性了。此外，该论文中“钙敏感型”凝胶的提及和与果酸盐产生的凝胶之间的比较表明果胶被脱酯为低酯果胶，这与本发明特别优选的方面形成鲜明的对比。
因此，本发明涉及用PME处理果胶的方法；其中PME不是植物PME；但其中PME能表现出至少一种植物PME的特性；其中至少一种植物PME的特性包括至少分段式地使果胶脱酯。
优选地，PME的分子量约为36,000D，和/或pI约为＞9，和/或对酸橙果胶而言的最适pH(通过上述方法测定)约为7，和/或对酸橙果胶而言的最适温度(通过上述方法测定)约为48℃。
优选PME含有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或其变体，衍生物或同系物，包括其组合。
优选PME具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或其变体，衍生物或同系物。
优选PME具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
优选PME由含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的核苷酸序列，或其变体，衍生物或同系物，或其组合表达。
优选PME由具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的核苷酸序列，或其变体，衍生物或同系物表达。
优选PME由具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的核苷酸序列表达。
优选使用重组DNA技术制备PME。
优选PME可得自微生物，优选得自细菌。
优选在钠离子的存在下用PME处理果胶。
优选钠离子源自NaCl，NaNO3或Na2SO4或其组合。
优选本发明的方法还包括将经PME处理的果胶与活性PME分开的步骤。可以用物理学的方法从活性PME中分离出经PME处理的果胶，或者反其道而行之。然而，优选通过简单地灭活PME，例如通过加热，从活性PME中分离出经PME处理的果胶。
优选经PME处理的果胶是高酯果胶。
优选经PME处理的果胶含有约70％至约80％酯基。
优选经PME处理的果胶含有约72％至约80％酯基。
优选经PME处理的果胶含有约74％至约80％酯基。
优选经PME处理的果胶含有约76％至约80％酯基。
优选经PME处理的果胶含有约77％至约79％酯基。
优选经PME处理的果胶含有约78％酯基。
优选本发明的方法还包括在适于消耗的介质中加入经PME处理的果胶的步骤。
优选介质是水溶液。
优选介质是酸性环境。
优选酸性环境的pH约为3.5至5.5，优选酸性环境的pH为4至约5.5。
优选酸性环境的pH约为4。
优选水溶液是饮料。
优选饮料是酸奶饮料，可饮用的酸奶酪，含有水果的奶饮料，或富含蛋白质的饮料，所述蛋白质如植物和/或牛奶蛋白质，如乳清蛋白和/或大豆蛋白。实施例章节之后示出了确定经处理的果胶是否适用于饮料的方法。
货架期长的酸奶饮料十分受欢迎，在远东地区尤其如此。在某些情况下，必须进行热处理以使货架期延长。为了避免加热过程中和之后蛋白质的沉降，可加入果胶作为稳定剂。在某些应用中，酸奶饮料的品质取决于所用果胶的特性和浓度。
在一个优选的方面，介质含有和/或富含蛋白质。此处优选蛋白质源自或可以源自或包含在乳制品，如牛奶或奶酪中，优选其中蛋白质是酪蛋白或乳清蛋白，和/或源自或可以源自或包含在植物制品中。
如果饮料是酸奶饮料，一般可通过酸化牛奶，然后在低pH下加入果胶来制备该饮料。
如果饮料是大豆蛋白饮料，一般通过在中性pH下溶解大豆蛋白来制备该饮料。通过在中性pH下溶解于大豆蛋白溶液中来加入果胶。然后通过加入例如果汁使溶液酸化。
使用以分段的方式酶促脱酯的果胶(优选使用重组DNA技术制备)是有利的，因为它可以使诸如乳清蛋白和乳蛋白(如酪蛋白)的蛋白质在酸性溶液中稳定。这对于诸如脱脂奶，果汁和乳清蛋白饮料的饮料市场至关重要，在此之前，如果存在大量稳定剂的话，在如此高的酸性条件下(如pH4.2)仅能保留主要蛋白质的味道。
现在，我们发现对某些应用而言，可以使用少量通过本发明的方法制备的脱酯果胶。低水平的本发明脱酯果胶不仅可用作稳定剂，也不会对终产品具有不良作用。
必要时，使用本发明的脱酯果胶可以使食品制造商增加食品(如饮料)的pH。在这一点上，在某些情况下，酸性较低的饮料更符合人们(尤其是婴儿)的口味。因此，与现有技术的方法相反，现在可以使用以分段的方式酶促脱酯的果胶，尤其是通过例如使用重组DNA技术制备的以分段的方式酶促脱酯的果胶，在高于4.2，如高达pH5.5(如pH5.2)的pH条件下保留蛋白质的味道。
另外，据信甚至在诸如pH4.2或更低的低pH条件下，以分段的方式酶促脱酯的果胶，尤其是优选通过使用重组DNA技术制备的以分段的方式酶促脱酯的果胶，相对于在所述pH条件下使用的现有技术的稳定剂而言，能使蛋白质更加稳定。
另一个优点是本发明的PME能产生基本上均质的，以分段的方式脱酯的果胶。也就是说，基本上所有的果胶链都含有至少两个邻接的脱酯羧基。然而，对于某些应用而言，不必要制备或使用这种基本上均质的，以分段的方式脱酯的果胶。
不必受理论的束缚，据信以分段的方式酶促脱酯的果胶，尤其是通过使用重组DNA技术制备的上述果胶，通过包围负电荷层中的蛋白质，由此形成稳定的实体而使蛋白质变得稳定。
当果胶与酶在基本上为水的介质中接触时，本发明的PME酶对分段式脱酯的果胶是有用的。在某些情况下，脱酯果胶可增加果胶的钙离子敏感性，这反而也是有利的。
或者，当果胶与酶在基本上不含水的介质，如存在甲醇或存在高浓度硫酸铵的介质中接触时，本发明的PME酶对酯化果胶是有用的。如果需要降低果胶的钙敏感性，这将是有利的。
酯化果胶的方法是有利的，因为它不需要与现有技术的方法相关的高温和甲醇酯化条件。因此，本发明也包括该酯化果胶用于制备食品的用途，以及果胶本身。
根据本发明，本发明的脱酯果胶对于制备食品是有利的。
优选食品是人和/或动物消耗的食品。典型的优选食品包括果酱，橘子酱，果子冻，奶制品(如牛奶或奶酪)，肉制品，家禽制品，鱼制品和面包制品。食品甚至可以是饮料。饮料可以是饮用的酸奶酪，果汁或含乳清蛋白的饮料。
除了含有经PME处理的果胶的食品外，食品可含有更多其它成分，如一种或多种适当的食品成分。典型的食品成分包括任何一种或多种酸，如柠檬酸，或糖，如蔗糖，葡萄糖或转化糖，或水果，或其它酶，防腐剂，着色剂和其它适当的成分。
在一个优选的实施方案中，本发明的食品含有水果。所述水果可赋予凝胶以味道，颜色和结构，以及赋予果胶，酸和少量固体。根据水果中天然味道和颜色的水平，水果含量一般占果酱的25％至60％。一般水果的固体含量为10％Brix，但也可使用一般为65-70％Brix的水果浓缩物。水果的pH差别很大，这取决于所用的水果，但大多数水果的pH为3.0至3.5。
果胶含量也有所不同，这取决于所用的水果。例如，红葡萄干，黑葡萄干和橘子中的果胶含量高，只需另外加入少量果胶即可从这些水果中获得令人满意的凝胶。果胶的选择取决于所需果酱的类型。例如，在不含水果块的果酱或仅含有很少水果块的果酱中，可使用GRINDSTEDTMPectin SS 200。这种果酱中的水果分离不成问题，可使用缓慢-凝结的果胶和较低的盛装温度。
例如，在含有大水果块或整个水果(如樱桃或草莓)的果酱中，可使用GRINDSTEDTMPectin RS 400。在含有整个水果的果酱中，难以避免水果分离，因此，必须使用快速-凝结的果胶，如GRINDSTEDTMPectinRS 400。
果胶类型的选择也取决于所用容器的大小。当使用标准罐子时，关于果胶稳定性的盛装温度较不严格，因为盛装之后罐子可以相对较快地冷却下来，果胶不会降解。然而，如果将果酱盛装在大的容器，如500或1000kg的容器中，冷却时间将会很长。在这种大容器的中央，果胶尤其会遭受降解，中央的凝胶将会比四周的弱。因此，对大容器而言，通常需使用凝结更加缓慢的果胶，可以在较低的温度下盛装，从而避免果胶降解。
鉴于以下多个原因，在果酱中加入糖1.为了提供可溶性固体-HE果胶在胶凝之前至少需要55％的可溶性固体含量。
2.为了提供甜度。
3.为了提供增加的物理，化学和微生物的稳定性。
4.为了提供改善的口感。
5.为了提供改善的颜色和光泽。
通常使用的糖是蔗糖，但也可以使用其它糖，这取决于所需的味道，增甜效果，结晶或结构。所用糖的类型也受价格的影响。
转化糖具有与蔗糖相同的增甜效果，而葡萄糖浆，葡萄糖和山梨糖醇的增甜效果较低。高果糖玉米浆和果糖的增甜效果比蔗糖更强。
糖组成的变化在某种程度上会影响凝胶的结构和强度以及胶凝温度。
加入酸的原因有两个1)一方面是为了降低pH水平至3.0-3.2以用果胶获得令人满意的凝胶，和2)一方面是为了增强水果的味道。使用HE果胶胶凝的最适pH取决于所用果胶的类型和固体含量。
如果在具有65-68％Brix的果酱中使用GRINDSTEDTMPectin SS200，最适pH为3.0-3.2。如果固体含量高于此，最适pH为3.1-3.3。反之，如果固体含量较低，最适pH为2.8-3.0。如果使用GRINDSTEDTMPectin RS 400，最适pH约比使用GRINDSTEDTMPectin SS 200时的最适pH高0.2个单位。
最常用的酸是柠檬酸一水合物的50％w/v溶液。
也可使用其它酸(如马来酸，酒石酸或磷酸)，但必须总是使用溶液形式的酸。
酸的选择取决于法规，价格和终产品所需甜度。
柠檬酸赋予终产品相对较强的酸味，而马来酸产生的酸味较温和但更持久。
酒石酸可导致稍弱的味道，磷酸导致较甜的味道。
经过酶处理的果胶可以防止凝缩，而凝缩常在制备具有低可溶性固体含量的橘子酱和果酱时出现。
在某些情况下，本发明的脱酯果胶也可以有利地用作稳定剂和/或粘度改良剂，用于制备药物，药用器具，化妆品和化妆器具。
优选以分段的方式酶促脱酯的果胶是高酯果胶，其含有约80％或更少酯基(即酯化程度(DE)为80％或更低)，优选含有约75％或更少酯基(即DE约为75％或更低)。在这一点上，果胶上游离羧基与酯化羧基的比例为1∶1至1∶4，优选为1∶2至1∶3。
优选以分段的方式酶促脱酯的果胶含有约78％的酯基。
测定PME底物酯化程度的方法见于WO-A-97/03574(其内容列入本文作为参考)的第58页。为了便于参考，在实施例章节之后会重新提及此方法。
测定钙敏感性的方法见于WO-A-97/03574(其内容列入本文作为参考)的第57页。为了便于参考，在实施例章节之后也会重新提及此方法。
优选以分段的方式酶促脱酯的果胶具有高分子量。通常，分子量为约50KD至约150KD。
优选通过用PME处理果胶来制备以分段的方式酶促脱酯的果胶，所述PME能使至少基本上所有果胶链上的两个或多个邻接的果胶半乳糖醛酸残基脱酯。
优选PME源自可得自微生物，优选得自细菌的PME。
术语“源自可得自微生物的PME”指的是PME具有类似于可得自微生物的PME的序列，条件是PME可以以分段的方式使果胶脱酯。
术语“源自可得自细菌的PME”指的是PME具有类似于可得自细菌的PME的序列，条件是PME可以以分段的方式使果胶脱酯。
术语“果胶”包括正常意义上的果胶，及其部分和衍生物，以及经修饰的果胶(例如经化学修饰的果胶和经酶修饰的果胶)。
例如，果胶可以是衍生化的果胶，经降解(如部分降解)的果胶或经修饰的果胶。经修饰的果胶的例子是以前曾用诸如PME的酶处理过的果胶，所述PME可以是与本发明的PME相同，或不同的PME或其组合。果胶衍生物的例子是经化学处理，如酰胺化的果胶。
优选果胶不是以前曾用多聚半乳糖醛酸酶处理以基本上降低果胶骨架长度的果胶。
如上所述，在优选的方面，本发明包括本文所示序列的变体，同系物和衍生物。本发明还包括这些序列的片断。
与本发明的重组酶相关的术语“变体”，“同系物”或“片断”包括序列中一个(或多个)氨基酸的任何取代，变异，修饰，替代，缺失或添加，条件是所得氨基酸序列具有PME活性，优选重组酶具有至少与含有SEQ ID No.2所示序列的重组酶相同的活性。特别地，术语“同系物”覆盖了与结构和/或功能相关的同源性，条件是所得重组酶具有PME活性。关于序列同源性(即相似性)，优选与所附序列表中所示的序列具有至少为75％，更优选至少为85％，更优选至少为90％的同源性。更优选与所附序列表中所示的序列具有至少为95％，更优选至少为98％的同源性。
因此，本发明的酶也可以被修饰以含有一个或多个(例如至少2，3，5或10个)取代，缺失或插入，包括保守取代。
例如，可根据下表进行保守取代。第二栏相同格中的氨基酸，优选第三栏相同行中的氨基酸可以互相取代
如上所述，本发明的蛋白质一般可以通过如本文所述的重组方法，和/或使用本领域技术人员众所周知的技术的合成方法，如固相合成法进行制备。所述序列的变体和衍生物包括融合蛋白，其中融合蛋白至少包括与另一种氨基酸序列(直接或间接)相连的本发明的氨基酸序列。这些其它氨基酸序列(有时也称之为融合蛋白配对物)一般会赋予有利的功能性，例如有助于提取和纯化本发明的氨基酸序列。融合蛋白配对物的例子包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，6xHis，GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)和β-半乳糖苷酶。较便利的做法是在融合蛋白配对物和本发明的蛋白质序列之间包括蛋白酶裂解位点以除去后者。优选融合蛋白配对物不会阻碍本发明蛋白质的功能。
在一个方面，本发明的氨基酸序列的变体，同系物，衍生物或片断可包括至少下列结构域，所述结构域如式(I)所示A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22(I)其中A1是疏水或极性氨基酸或中性氨基酸A2是疏水氨基酸A3是疏水氨基酸A4是极性氨基酸A5是极性或带电氨基酸或中性氨基酸A6是极性氨基酸A7是极性或带电或疏水氨基酸A8是疏水氨基酸A9是疏水或极性氨基酸A10是疏水或极性氨基酸A11是带电氨基酸A12是带电或极性或疏水氨基酸A13是疏水或带电氨基酸或中性氨基酸A14是疏水或极性氨基酸或带电或中性氨基酸A15是带电或极性或疏水氨基酸
A16是极性或疏水或带电氨基酸或中性氨基酸A17是极性或带电氨基酸或中性氨基酸A18是极性或带电或疏水氨基酸A19是极性氨基酸或中性氨基酸A20是疏水或极性氨基酸A21是疏水氨基酸A22是极性或疏水氨基酸。
该结构域描述于我们较早期的UK专利申请9910935.7(于1999年5月11日提交)。
在本发明的此方面，优选A1是疏水氨基酸。
优选A5是极性氨基酸。
优选A7是极性氨基酸。
优选A9是疏水氨基酸。
优选A10是疏水氨基酸。
优选A12是带电氨基酸。
优选A13是疏水氨基酸。
优选A14是疏水氨基酸。
优选A15是带电氨基酸。
优选A16是极性氨基酸。
优选A17是极性氨基酸。
优选A18是极性氨基酸。
优选A20是疏水氨基酸。
优选A22是极性氨基酸。
对式(I)的氨基酸序列而言，疏水氨基酸的优选例子包括A1a(A)，Val(V)，Phe(F)，Pro(P)，Met(M)，Ile(I)，Leu(L)。
对式(I)的氨基酸序列而言，带电氨基酸的优选例子包括Asp(D)，Glu(E)，Lys(K)，Arg(R)。
对式(I)的氨基酸序列而言，极性氨基酸的优选例子包括Ser(S)，Thr(T)，Tyr(Y)，His(H)，Cys(C)，Asn(N)，Gln(Q)，Trp(W)。
对式(I)的氨基酸序列而言，中性氨基酸的优选例子是甘氨酸(G)。
优选A1是A，V，G或T。
优选A2是V或L。
优选A3是L，F或I。
优选A4是Q。
优选A5是N，D，K，G或S。
优选A6是C或S。
优选A7是D，Q，K，E，Y或L。
优选A8是I，L或F。
优选A9是H，N，V，M或L。
优选A10是A，C，I，P，L，C或S。
优选A11是R。
优选A12是K，R，L，Q或Y。
优选A13是P，G或R。
优选A14是N，G，M，A，L，R或S。
优选A15是S，K，E，P或D。
优选A16是G，Y，H，N，K或V。
优选A17是Q，G或K。
优选A18是K，Q，F，Y，T或S。
优选A19是N，C或G。
优选A20是M，L，I，T，V，H或N。
优选A21是V或I。
优选A22是T，L或S。
我们也相信氨基酸序列应该保持如式(II)所示序列的氨基酸N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-H-H-N-H-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-H-N-N-N-P-C-P-H-N-H-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-H-N-G-N-N-C-N-H-H-G-N-N-N (II)其中H独立地表示疏水氨基酸C独立地表示带电氨基酸P独立地表示极性氨基酸G表示甘氨酸N独立地表示甘氨酸或疏水或带电或极性氨基酸。
对式(II)的氨基酸序列而言，疏水氨基酸的例子包括Ala(A)，Val(V)，Phe(F)，Pro(P)，Met(M)，Ile(I)，Leu(L)；带电氨基酸的例子包括Asp(D)，Glu(E)，Lys(K)，Arg(R)；极性氨基酸的例子包括Ser(S)，Thr(T)，Tyr(Y)，His(H)，Cys(C)，Asn(N)，Gln(Q)，Trp(W)。
与编码本发明重组酶的核苷酸序列相关的术语“变体”，“同系物”或“片断”包括序列中一个(或多个)核酸的任何取代，变异，修饰，替代，缺失或添加，条件是所得核苷酸序列编码具有PME活性的重组酶，优选重组酶具有至少与含有SEQ ID No.2所示序列的重组酶相同的活性。特别地，术语“同系物”覆盖了与结构和/或功能相关的同源性，条件是所得核苷酸序列编码具有PME活性的重组酶。关于序列同源性(即相似性)，优选具有至少为75％，更优选至少为85％，更优选至少为90％的同源性。更优选具有至少为95％，更优选至少为98％的同源性。
在优选的方面，与编码本发明重组酶的核苷酸序列相关的术语“变体”，“同系物”或“片断”包括如SEQ ID No.1所示序列中一个(或多个)核酸的任何取代，变异，修饰，替代，缺失或添加，条件是所得核苷酸序列编码具有PME活性的重组酶，优选重组酶具有至少与含有SEQ ID No.2所示序列的重组酶相同的活性。特别地，术语“同系物”覆盖了与结构和/或功能相关的同源性，条件是所得核苷酸序列编码具有PME活性的重组酶。关于序列同源性(即相似性)，优选具有至少为75％，更优选至少为85％，更优选至少为90％的同源性。更优选具有至少为95％，更优选至少为98％的同源性。
上述术语与序列的等位基因变异是同义词。
如上所述，本发明涉及所附序列表中所示的序列，或其变体，衍生物或同系物。
优选变体，衍生物或同系物与任何一个或多个所示序列具有至少75％的序列同源性(即同一性)。
特别地，本文所用术语“同源性”等同于术语“同一性”。
此处，可简单地通过“肉眼”比较任何一个或多个序列与另一个序列来测定序列同源性，从而看出其它序列是否与此序列有至少75％的同一性。
也可通过商购的计算机程序测定相对序列同源性(即序列同一性)，所述程序能计算出两个或多个序列之间的％同源性。这种计算机程序的典型例子是CLUSTAL。
另外，可使用任何适当的同源性算法，使用例如缺省参数来测定序列同源性(或同一性)。使用BLAST算法较为有利，该算法的参数被设置为缺省值。BLAST算法详细描述于http//www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html(列入本文作为参考)。下文定义了检索参数，这些参数可有利地被设置为限定的缺省参数。
有利的是，当用BLAST进行评估时，“基本上同源”等同于匹配序列的EXPECT值至少约为7，优选至少约为9和最优选为10或更高。BLAST检索中的EXPECT缺省阈值通常为10。
BLAST(基本的局部序列对比检索工具)是程序blastp，blastn，blastx，tblastn和tblastx所用的启发式检索算法；这些程序使用经过少许改进的Karlin和Altschul的统计学方法(参见http//www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast help.html)将显著性归于他们的发现。BLAST程序是专为序列相似性检索而制作的，例如可用于鉴定查询序列的同系物。该程序一般不能用于基元-式检索。有关序列数据库相似性检索的基本问题的讨论，可参见Altschul等(1994)，自然遗传学6119-129。
可得自http//www.ncbi.nlm.nih.gov的5个BLAST程序执行下列任务blastp将氨基酸查询序列与蛋白质序列数据库进行比较；blastn将核苷酸查询序列与核苷酸序列数据库进行比较；blastx将核苷酸查询序列(两条链)的6-读框概念翻译产物与蛋白质序列数据库进行比较；tblastn将蛋白质查询序列与被动态翻译成所有6个阅读框的核苷酸序列数据库(两条链)进行比较；tblastx将核苷酸查询序列的6-读框翻译产物与核苷酸序列数据库的6-读框翻译产物进行比较。
BLAST使用下列检索参数HISTOGRAM显示每次检索评分的直方图；缺省为yes(见BLAST手册中的参数H)。
DESCRIPTIONS将所记载的匹配序列短描述的数目限定为特定的数目；缺省限是100个描述(见手册页的参数V)。也见于EXPECT和CUTOFF。
ALIGNMENTS将数据库序列限定为所记载的高分片断配对(HSP)的特定数目；缺省限是50。如果更多的数据库序列碰巧满足记载所需的统计学显著性阈值(见下文的EXPECT和CUTOFF)，仅记载统计学显著性最高的匹配(见BLAST手册中的参数B)。
EXPECT记载匹配序列对数据库序列的统计学显著性阈值；缺省值为10，以使根据Karlin和Altschul(1990)的随机模型，有望仅仅碰巧发现10个匹配。如果归因于匹配的统计学显著性高于EXPECT阈值，将不会记载匹配。较低的EXPECT阈值更加严格，导致记载匹配的机会很少。分数值也是可以接受的(见BLAST手册中的参数E)。
CUTOFF记载高分片断配对的阈值分。由EXPECT值(见上文)计算缺省值。仅当归因于HSP的统计学显著性至少与归因于单独的HSP的统计学显著性一样高时，才会记载数据库序列的HSP，所述单独HSP具有与CUTOFF值相等的得分。较高的CUTOFF值更加严格，导致记载匹配的机会很少(见BLAST手册中的参数S)。一般，使用EXPECT能更加直观地处理显著性阈值。
MATRIX特别说明BLASTP，BLASTX，TBLASTN和TBLASTX的另一种评分矩阵。缺省矩阵是BLOSUM62(Henikoff & Henikoff，1992)。有效的另一种选择包括PAM40，PAM120，PAM250和IDENTITY。BLASTN中没有另一种评分矩阵；需特别指出的是，BLASTN中的MATRIX命令需要返回错误的反应。
STRAND将TBLASTN检索局限于数据库序列的上链或下链；或将BLASTN，BLASTX或TBLASTX检索局限于查询序列上链或下链的读码框。
FILTER遮盖经Wootton & Federhen(1993)计算机和化学，17149-163的SEG程序测定具有低组成复杂度的查询序列片断，或者遮盖经Claverie & States(1993)，计算机和化学，17191-201的XUN程序测定，或者对BLASTN而言，经Tatusov和Lipman的DUST程序测定，由短-周期性内部重复组成的片断(见http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。过滤可以消除blast输出数据中具有统计学显著性但在生物学上没有什么意义的记载(例如一般的酸性-，碱性-或富含脯氨酸区域的命中)，只留下更具生物学意义的查询序列区域，与数据库序列进行特异性的匹配。
在核苷酸序列中使用字母“N”替代过滤程序发现的低复杂度序列(如“NNNNN NNNNNNNN”)，而在蛋白质序列中用字母“X”表示(如“XXXXXXXXX”)。
过滤仅适用于查询序列(或其翻译产物)，而不适用于数据库序列。缺省过滤是DUST(对BLASTN而言)，SEG(对其它程序而言)。
当在SWISS-PROT中用于序列时，SEG，XUN或这两者经常什么也遮盖不了，因此，不应希望过滤总能发挥作用。
另外，在某些情况下，序列整个被遮盖，这表明任何针对未过滤的查询序列记载的匹配的统计学显著性都应该是可疑的。
NCBI-gi导致除了登记号和/或基因座名称外，NCBIgi标识符也在输出信号中示出。
对于某些应用而言，优选使用http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST提供的简单的BLAST检索算法进行序列比较。
当测定序列同一性时，应该使用空位处罚，优选使用下列参数
其它测定两个序列之间的同一性和相似性的计算机程序法包括但不限于GCG程序包(Devereux等，1984，核酸研究，12387)和FASTA(Atschul等，1990，分子生物学杂志，403-410)。
本发明还包括与本文所示序列互补的核苷酸序列，或其任何衍生物，片断或同系物。如果某序列与其片断互补，则可将该序列用作探针来鉴定其它生物体中的类似编码序列。
本发明还包括能与本文所示序列杂交的核苷酸序列，或其任何衍生物，片断或同系物。
本发明还包括能与同本文所示序列互补的序列杂交的核苷酸序列，或其任何衍生物，片断或同系物。
术语“互补”也包括与编码序列的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
术语“变体”也包括与能同本文所示核苷酸序列杂交的序列互补的序列。
优选术语“变体”包括与能在严紧条件(如65℃和0.1×SSC[1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH7.0])下同本文所示核苷酸序列杂交的序列互补的序列。
本发明还涉及能与本发明的核苷酸序列(包括本文所示核苷酸序列的互补序列)杂交的核苷酸序列。
本发明还涉及与能同本发明的核苷酸序列(包括本文所示核苷酸序列的互补序列)杂交的序列互补的核苷酸序列。
本文所用术语“杂交”应该包括“核酸链通过碱基配对与互补链连接的方法”(Coombs J(1994)生物技术词典，Stockton出版社，纽约)以及在按Dieffenbach CW和GS Dveksler(1995，PCR引物，实验室手册，冷泉港出版社，Plainview NY)所述的聚合酶链反应技术中进行的扩增方法。
本发明的范围中还包括能在中度至最高严紧度的条件下与本文所示核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。按照Berger和Kimmel(1987，分子克隆技术指南，酶学方法，Vol152，Academic出版社，San Diego CA)的教导，杂交条件基于核酸结合复合物的解链温度(Tm)，如下文所解释的那样，赋予确定的“严紧度”。
最高严紧度一般发生在约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)；高严紧度一般发生在约比Tm低5℃至10℃；中严紧度一般发生在约比Tm低10℃至20℃；低严紧度一般发生在约比Tm低20℃至25℃。本领域技术人员应理解，可使用最高严紧度的杂交鉴定或检测相同的多核苷酸序列，而用中(或低)严紧度的杂交鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。
在优选的方面，本发明包括能在严紧条件下(如65℃和0.1×SSC)与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
与本发明相关的术语“核苷酸”包括基因组DNA，cDNA，合成的DNA和RNA。优选它指的是DNA，更优选指的是本发明编码序列的cDNA。
术语“构建体”(与诸如“缀合物”，“盒”和“杂合体”的术语同义)包括本发明的核苷酸序列，或对构建体组合而言，包括直接或间接与启动子连接的GOI。一个间接连接的例子是提供适当的间隔序列，如内含子序列(如Shl-内含子或ADH内含子)，置于启动子和本发明的核苷酸序列或GOI之间。与本发明相关的术语“融合”也是这样，包括直接或间接连接。在每种情况下，术语未包括通常与野生型基因启动子相连的酶基因的天然组合，以及当它们都处于其天然环境时的天然组合。
构建体甚至可含有或表达标记，从而在例如已转入该标记的丝状真菌，优选为曲霉属，如黑曲霉，或植物，如马铃薯，甜菜中选择基因构建体。可以使用现存的多种标记，例如编码甘露糖-6-磷酸异构酶(尤其适用于植物)的标记，或提供抗生素抗性的标记，所述抗性的例子为G418，潮霉素，博来霉素，卡那霉素和庆大霉素抗性。
术语“载体”包括表达载体和转化载体。
术语“表达载体”指的是能在体内或体外表达的构建体。
术语“转化载体”指的是能从一个物种转移至另一个物种的构建体，例如大肠杆菌质粒转移至丝状真菌，优选转移至曲霉属中。它甚至可以是能由大肠杆菌质粒转移至农杆菌再转移至植物中的构建体。
术语“组织”包括组织本身和器官。
与本发明相关的术语“生物体”包括可含有编码本发明重组酶的核苷酸序列和/或由其得到的产物的任何生物体，其中当生物体中存在启动子时，该启动子可允许本发明的核苷酸序列表达。
优选生物体是丝状真菌，优选为曲霉属，更优选为黑曲霉。
与本发明相关的术语“转基因生物体”包括含有编码本发明重组酶的核苷酸序列和/或由其得到的产物的任何生物体，其中启动子可允许本发明的核苷酸序列在生物体内表达。优选核苷酸序列掺入生物体的基因组中。
优选转基因生物体是丝状真菌，优选为曲霉属，更优选为黑曲霉。
因此，本发明的转基因生物体包括含有以下任何一个或其组合的生物体启动子，编码本发明重组酶的核苷酸序列，本发明的构建体(包括其组合)，本发明的载体，本发明的质粒，本发明的细胞，本发明的组织或其产物。
术语“转基因生物体”未包括受其天然启动子控制的本发明的天然核苷酸编码序列，其中所述启动子和编码序列都处于其天然环境中。另外，本发明未包括属于下列几种情况的本发明的天然酶处于其天然环境；由也处于天然环境的其天然核苷酸编码序列表达；和核苷酸序列处于其天然启动子的控制之下，所述启动子也处于其天然环境中。
经转化的细胞或生物体可制备可接受量的所需化合物，所述化合物易于从细胞或生物体中重新获得。
优选本发明的构建体含有本发明的核苷酸序列和启动子。
术语“启动子”以本领域的正常含义被使用，例如RNA聚合酶结合位点。
在一个方面，本发明的核苷酸序列处于启动子的控制之下，所述启动子可以是细胞或组织特异性启动子。如果生物体为植物，启动子可以是在块茎，茎，芽，根和叶组织的任何一个或多个中影响核苷酸序列表达的启动子。
例如，如我们于1994年10月21日提交的共同悬而未决的英国专利申请9421292.5中所述，本发明核苷酸序列的启动子可以是α-Amy 1启动子(也已知为Amy1启动子，Amy637启动子或α-Amy637启动子)。或者，如我们于1994年10月21日提交的共同悬而未决的英国专利申请9421286.7中所述，本发明核苷酸序列的启动子可以是α-Amy 3启动子(也已知为Amy3启动子，Amy351启动子或α-Amy351启动子)。
启动子可以另外包括确保或增加适当宿主中的表达的特征。例如，所述特征可以是保守区域，如Pribnow Box或TATA盒。启动子甚至可含有其它能影响(例如维持，增强，降低)本发明核苷酸序列，或者对构建体组合而言为GOI的表达水平的序列。例如，适当的其它序列包括shl-内含子或ADH内含子。其它序列包括可诱导的元件-例如温度，化学，光或应力可诱导的元件。也可存在能增强转录或翻译的适当元件。后一种元件的例子是TMV5’信号序列(见Sleat Gene 217217-225；和Dawson Plant Mol.Biol.2397)。
此外，本发明也包括启动子和/或编码蛋白质或重组酶的核苷酸序列和/或元件的组合。
本发明也包括启动子表达编码本发明重组酶的核苷酸序列或GOI的用途，其中启动子的一部分失活，但启动子仍能行使启动子的功能。启动子的部分失活在某些情况下是有利的。特别是，可以使上文提及的Amy351启动子失活一部分，使得部分失活的启动子以更加特异性的方式表达本发明的核苷酸或GOI，如仅在一个特异性的组织类型或器官中表达。
术语“失活”指的是部分失活，意思是说启动子的表达模式被修饰，但部分失活的启动子仍能行使启动子的功能。然而，如上所述，经修饰的启动子能在至少一个(但不是全部)原始启动子特异性组织中表达本发明的核苷酸序列或GOI。一个这样的启动子是上述的Amy351启动子。部分失活的例子包括改变启动子序列的折叠模式，或与核苷酸序列部分结合的方式，使得核苷酸序列的一部分不能被例如RNA聚合酶识别。另一种(也是优选的)部分失活启动子的方法是截短启动子以形成启动子片断。另一种方法是突变至少部分序列以使RNA聚合酶不能结合该部分或另一部分。另一种修饰是突变调控蛋白的结合位点，例如突变已知能发挥碳分解代谢产物阻抑作用的丝状真菌CreA蛋白的结合位点，从而消除天然启动子的分解代谢产物阻抑作用。
与本发明的构建体组合相关的术语“GOI”指的是任何所需基因。GOI可以是任何核苷酸，它对生物体(如丝状真菌，优选为曲霉属，或植物)而言可以是外源的或天然的。GOI的典型例子包括编码蛋白质和酶的基因，所述酶可修饰代谢和分解代谢过程。GOI可编码导入或增加病原体抗性的因子。GOI甚至可以是反义构建体，该构建体能修饰相关组织中存在的天然转录物的表达。GOI甚至可编码丝状真菌(优选为曲霉属)的非-天然蛋白质，或者编码对动物或人有利的化合物。
GOI的例子包括其它果胶酶，半乳糖醛酸酶，果胶解聚酶，多聚半乳糖醛酸酶，果胶酸盐裂合酶，果胶裂合酶，鼠李糖-半乳糖醛酸酶，半纤维素酶，内切-β-葡聚糖酶，arabinase，或乙酰基酯酶，或其组合，及其反义序列。
可在加入PME的同时，或者在加入PME之前或之后加入其它类型的酶。
例如，GOI可以是WO-A-97/03574公开的PME，或者是WO-A-94/25575或WO-A-97/31102中公开的PME以及这些专利申请所公开序列的变体，衍生物或同系物。
GOI可以是对食品或作物具有营养价值的蛋白质。典型例子包括能抑制抗-营养因子形成的植物蛋白质，和具有更加合乎需要的氨基酸组成(例如比非转基因植物的赖氨酸含量高)的植物蛋白质。GOI甚至可编码能用于食品加工的酶，例如凝乳酶，奇甜蛋白和α-半乳糖苷酶。GOI可以是编码下列任何一个的基因害虫毒素，反义转录物，如patatin或α-淀粉酶的反义转录物，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(例见EP-A-0455316)，蛋白酶反义，葡聚糖酶或基因组PME。
GOI甚至可编码特定酶的内含子，但其中内含子可以是有义或反义方向。在后一种情况下，特定的酶可以是基因组PME。GOI基因组外显子或内含子序列的反义表达指的是天然PME表达会降低或消除，但其中重组PME表达不会受影响。这对于反义内含子或有义内含子表达而言是非常正确的。
GOI可以是编码α-淀粉酶的核苷酸序列，这是我们于1994年7月4日提交的共同悬而未决的英国专利申请9413439.2中的主题。GOI可以是编码α-淀粉酶的核苷酸序列，这是我们于1994年10月21日提交的共同悬而未决的英国专利申请9421290.9中的主题。GOI可以是编码ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的任何核苷酸序列，这是我们于1994年4月7日提交的共同悬而未决的PCT专利申请PCT/EP94/01082中的主题。GOI可以是编码α-葡聚糖裂合酶的任何核苷酸序列，所述序列描述于我们于1994年10月15日提交的共同悬而未决的PCT专利申请PCT/EP94/03397中。
宿主生物体可以是原核或真核生物体。适当原核宿主的例子包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。本技术领域已详细记载了有关转化原核宿主的教导，例见Sambrook等(分子克隆实验室手册，第2版，1989，冷泉港实验室出版社)。如果使用的是原核宿主，必须在转化之前对基因进行适当修饰，例如除去内含子。
如上所述，优选的宿主生物体为曲霉属，如黑曲霉。
可通过下列教导制备本发明的转基因曲霉Rambosek，J和Leach，J.1987(丝状真菌中的重组DNA进展和展望，CRC Crit.Rev.Biotechnol.6357-393)，Davis R.W.1994(曲霉的异源基因表达和蛋白质分泌，Martinelli S.D.，Kinghorn J.R(编)曲霉属50年来的工业微生物学进展，vol29.Elsevier Amsterdam 1994.p525-560)，Ballance，D.J.1991(丝状真菌的转化系统和真菌基因结构总览，Leong，S.A.，Berka R.M.(编)分子工业真菌学，丝状真菌系统和应用，Marcel Dekker公司，纽约，1991.p1-29)和Turner G.1994(基因操作载体，Martinelli S.D.，KinghornJ.R(编)曲霉属50年来的工业微生物学进展，vol29.ElsevierAmsterdam 1994.p641-666)。然而，下列评论提供了产生本发明转基因曲霉的简要教导。
近百年来，丝状真菌已被广泛用于很多类型的工业中，用于生产有机化合物和酶。例如，传统的日本酒曲和酱油发酵就使用了曲霉属的种。在本世纪，黑曲霉被用来生产有机酸，特别是柠檬酸，并且用来生产多种工业用酶。
丝状真菌在工业中得以广泛应用的原因主要有两个首先，丝状真菌可生产出大量细胞外产物，例如酶和有机化合物，如抗生素或有机酸。第二，丝状真菌可在低成本的底物(例如谷物，麸糠，甜菜浆等)上生长。相同的原因使得丝状真菌成为我们感兴趣的生物体，它们可用作本发明异源表达的宿主。
为了制备转基因曲霉，可通过将本发明的核苷酸序列(或者甚至是GOI)插入构建体来制备表达构建体，所述构建体经设计可用于在丝状真菌中进行表达。
已开发出几种可用于异源表达的构建体。这些构建体优选含有在真菌中具有活性的启动子。启动子的例子包括高水平表达胞外酶的真菌启动子，例如葡糖淀粉酶启动子或α-淀粉酶启动子。本发明的核苷酸序列(或者甚至是GOI)可以与信号序列融合，该信号序列可介导由本发明的核苷酸序列(或者甚至是GOI)编码的蛋白质的分泌。通常使用真菌来源的信号序列。在真菌中具有活性的终止子可终止表达系统。
已开发出另一种真菌表达系统，其中本发明的核苷酸序列(或者甚至是GOI)可与编码稳定蛋白质的真菌基因的较小或较大部分融合。这样就可以稳定由本发明的核苷酸序列(或者甚至是GOI)编码的蛋白质。在该系统中，可将被特异性蛋白酶识别的裂解位点导入真菌蛋白质与由本发明的核苷酸序列(或者甚至是GOI)编码的蛋白质之间，因此，所产生的融合蛋白可以在此位置被特异性蛋白酶裂解，从而释放由本发明的核苷酸序列(或者甚至是GOI)编码的蛋白质。例如，可导入能被KEX-2样肽酶识别的位点，所述肽酶至少在一些曲霉中出现。这种融合导致体内裂解，对表达产物而不是较大的融合蛋白产生保护作用。
已报道了几个编码细菌，真菌，脊椎动物和植物蛋白质的基因在曲霉中的异源表达。如果本发明的核苷酸序列(或者甚至是GOI)未与信号序列融合，蛋白质将会存放在细胞内。该蛋白质将会累积在胞质中，通常未被糖基化，这对一些细菌蛋白质而言是有利的。如果本发明的核苷酸序列(或者甚至是GOI)配备有信号序列，蛋白质将会在胞外累积。
关于产物的稳定性和宿主菌株修饰，当一些异源蛋白质被分泌至真菌的培养液中时，并不是十分稳定。大多数真菌会产生几种能降解异源蛋白质的胞外蛋白酶。为了避免这一问题，可将蛋白酶产量较低的特定真菌菌株用作异源生产所用的宿主。
为了转化丝状真菌，已开发出几种适用于很多丝状真菌的转化方法(Ballance 1991，文献同上)。很多方法基于制备原生质体，并使用PEG和钙离子将DNA导入原生质体。然后再生经转化的原生质体，并使用多种选择标记选择经转化的真菌。转化所用的标记是多种营养缺陷型标记，如argB，trpC，niaD和pyrG，抗生素抗性标记，如benomyl抗性，潮霉素抗性和腐草霉素抗性。常用的转化标记是构巢曲霉的amdS基因，当丙烯酰胺为唯一氮源时，高拷贝数的该基因可以使真菌生长。
在另一个实施方案中，转基因生物体可以是酵母。在这一点上，酵母已被广泛用作异源基因表达的载体。酿酒酵母的工业应用历史久远，其用途包括表达异源基因。有关在酿酒酵母中表达异源基因的评论可参见Goodey等(1987，酵母生物技术，D R Berry等编，p401-429，Allen和Unwin，伦敦)和King等(1989，酵母分子和细胞生物学，E F Walton和G T Yarronton编，p107-133，Blackie，Glasgow)。
鉴于以下几个原因，酿酒酵母较适于异源基因表达。首先，它对人而言为非-病原体，不能产生某些内毒素。第二，在几百年多种用途的商业开发之后，它有较长的安全使用历史，可以为公众广泛接受。第三，对此生物体所作的深入的商业应用和研究使得人们较全面地了解到酿酒酵母的遗传学，生理学以及大规模的发酵特征。
有关酿酒酵母中异源基因表达的原理和基因产物的分泌，可参见EHinchcliffe E Kenny(1993，“用作异源基因表达载体的酵母”，酵母，Vol5，Anthony H Rose和J Stuart Harrison编，第2版，Academic出版有限公司)。
可以使用的酵母载体有以下几种类型，包括整合载体和自我复制的质粒载体，其中整合载体需要与宿主基因组重组才能维持。
为了制备转基因的糖酵母，可通过将本发明的核苷酸序列插入经设计可在酵母中表达的构建体，从而制备表达构建体。已开发出几种可用于异源表达的构建体。构建体含有在酵母中具有活性的启动子，所述启动子与本发明的核苷酸序列融合，通常使用酵母来源的启动子，如GAL1启动子。通常使用酵母来源的信号序列，如编码SUC2信号肽的序列。在酵母中具有活性的终止子终止表达系统。
为了转化酵母，已开发出几种转化方法。例如，可根据Hinnen等(1978，Pro.Nat.Acad.Sci.USA 75，1929)；Beggs，J D(1978，自然，伦敦，275，104)和Ito，H等(1983，细菌学杂志，153，163-168)的教导制备本发明的转基因糖酵母。
使用多种选择标记选择经转化的酵母。转化所用的标记是多种营养缺陷型标记，如LEU2，HIS4和TRP1，和显性抗生素抗性标记，如氨基糖苷抗生素标记，如G418。
另一种宿主生物体是植物。
尽管EP-B-0470145和CA-A-2006454中未公开酶和编码酶的核苷酸序列，但这两篇文献提供了一些有用的背景评论，这些评论提及了可用于制备本发明转基因植物的技术类型。下述的评论将包括一些这样的背景教导。
构建经基因修饰之植物的基本原理是将遗传信息插入植物基因组，以稳定维持所插入的遗传物质。
有几种技术可插入遗传信息，两个主要的原理是直接导入遗传信息，和通过使用载体系统导入遗传信息。一般技术的评论可参见Potrykus(植物生理学和植物分子生物学年评42205-225)和Christou(农业-食品-工业高科技，3月/4月1994 17-27)的论文。
因此，一方面，本发明涉及载体系统，该载体系统携有本发明的核苷酸序列或构建体，并能将核苷酸序列或构建体导入生物体(如植物)的基因组。
载体系统可含有一个载体，但也可含有两个载体。当含有两个载体时，载体系统通常被称为二元载体系统。二元载体系统详细描述于Gynheung An等(1980)，二元载体，植物分子生物学手册A3，1-19。
一个经广泛应用的，用给定启动子或核苷酸序列或构建体转化植物细胞的系统基于使用根瘤农杆菌的Ti质粒或毛根农杆菌的Ri质粒(An等(1986)，植物生理学，81，301-305和Butcher D.N等(1980)，植物病理学家的组织培养法，D.S.Ingrams和J.P.Helgeson编，203-208)。
已构建出几种不同的Ti和Ri质粒，它们适用于构建上述植物或植物细胞构建体。所述Ti质粒的非限制性例子是pGV3850。
优选将本发明的核苷酸序列或构建体插入Ti-质粒，插入位置为T-DNA末端序列之间或与T-DNA序列邻接，从而避免破坏紧接T-DNA边界周围的序列，因为至少有一个此区域似乎是将经修饰的T-DNA插入植物基因组所必需的。
从上述解释中可以了解，如果生物体是植物，那么，本发明的载体系统优选含有感染植物所必需的序列(如vir区域)和至少一个T-DNA序列边界部分，边界部分与基因构建体位于相同载体上。优选载体系统是根瘤农杆菌Ti-质粒或毛根农杆菌Ri-质粒或其衍生物，因为这些质粒是众所周知的，并且被广泛用于构建转基因植物，现存的很多载体系统都基于这些质粒或其衍生物。
在构建转基因植物时，首先在微生物中构建本发明的核苷酸序列或构建体，在所述微生物中可以复制载体，并且该微生物在插入植物之前易于操纵。有用的微生物的例子是大肠杆菌，但也可以使用具有上述特性的其它微生物。当已在大肠杆菌中构建出如上文所限定的载体系统的载体时，必要时可将其转移至适当的农杆菌菌株，如根瘤农杆菌。因此，优选将携有本发明的核苷酸序列或构建体的Ti-质粒转移至适当的农杆菌菌株，如根瘤农杆菌，从而获得携有本发明的核苷酸序列或构建体的农杆菌细胞，随后将其DNA转移至待修饰的植物细胞。
据CA-A-2006454报道，可以使用大量克隆载体，它们含有大肠杆菌复制系统和选择转化细胞所用的标记。载体含有例如pBR322，pUC系列，M13mp系列，pACYC 184等。
通过此方法，可将本发明的核苷酸或构建体导入载体中的适当的限制性位置。使用包含的质粒在大肠杆菌中进行转化。在适当的营养培养基中培养大肠杆菌细胞，然后收集并裂解细胞。回收质粒。通常使用的分析方法有序列分析，限制性分析，电泳和其它生物化学-分子生物学方法。每次操作之后，限制性消化所用DNA序列并与下一个DNA序列相连。每个序列可被克隆至相同或不同的质粒中。
每次导入本发明的所需启动子或构建体或核苷酸序列之后，其它DNA序列的存在和/或插入也是必需的。例如，如果用Ti-或Ri-质粒转化植物细胞，至少可连接Ti-和Ri-质粒T-DNA的右边界，然而经常是右和左边界，作为导入基因的侧翼区。已深入研究了T-DNA用于转化植物细胞的用途，详见EP-A-120516；Hoekema，二元植物载体系统offset-drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam，1985，第五章；Fraley等，Crit.Rev.Plant Sci.，41-46和An等，EMBO J.(1985)4277-284。
用农杆菌直接感染植物组织是一项简单的技术，该项技术已得到广泛应用，其描述于Butcher D.N等(1980)，植物病理学家的组织培养方法，D.S.Ingrams和J.P.Helgeson编，203-208。关于此论题的其它教导可参见Potrykus(植物生理学和植物分子生物学年评42205-225)和Christou(农业-食品-工业高科技，3月/4月1994 17-27)。用此技术可感染植物的某个部分或组织，即叶，根，茎的一部分或植物的另一部分。
通常，用携有启动子和/或GOI的农杆菌直接感染植物组织，会伤害被感染的植物，例如会用剃刀切割植物，或用针刺植物，或用研磨料擦植物。然后在伤口处接种农杆菌，在适当的培养基上培养经接种的植物或植物部分，使其发育成成熟的植物。
当构建植物细胞时，可根据众所周知的组织培养法培养和维持这些细胞，例如在添加有必需生长因子(如氨基酸，植物激素，维生素等)的适当培养基中培养细胞。使用已知的由细胞或组织培养物再生植物的方法，可将经转化的细胞再生为经基因修饰的植物，例如，可使用抗生素选择经转化的苗，再在含有适当营养物质，植物激素等的培养基上对小苗进行再培养。
有关植物转化的其它教导可参见EP-A-0449375。
本发明的方法可以在体外进行，或者甚至可以在体内进行-例如在植物中进行。在后一种情况下，植物可以是转基因植物，如经过基因工程改造能产生不同水平和/或类型的果胶的植物。植物也可以是植物材料，而不是整个植物。此处，植物材料可得自转基因植物，例如经过基因工程改造能产生不同水平和/或类型的果胶的植物。植物或植物材料可以是或可以衍生自蔬菜，水果，或其它类型的含果胶或产果胶植物。此处，蔬菜材料和/或水果材料可以是糖化胶。
总之，本发明提供了用果胶甲脂酶(PME)处理果胶的方法；其中PME不是植物PME；但其中PME能表现出至少一种植物PME的特性；其中至少一种植物PME的特性包括至少分段式地使果胶脱酯。
PME活性自身十分容易测定。实施例章节之后示出了测定PME活性的方法。
使用Pharmacia PhastSystemTM，用10-15％SDS-梯度凝胶，经SDS-PAGE测定PME组分的纯度。按Pharmacia手册的描述进行蛋白质电泳和银染。为了测定pI，可使用IEF 3-9 PhastSystemTM凝胶。
可使用免疫凝胶电泳鉴定抗PME抗体(见下文)，如多克隆抗体。然后在SDS-PAGE上分离酶组分，在PhastSystemTM的半干燥转移装置上，通过半-干燥印迹技术将酶组分转移至NC-纸上。将NC-纸与按1∶50稀释的引发抗体保温，并用第二抗体染色，所述第二抗体与碱性磷酸酶(Dako A/S Glsotrup，丹麦)偶联，使用时的稀释度为1∶1000。
可对PME进行进一步的研究，包括肽作图。在此方面，可用胰蛋白酶或得自Lysobacter enzymogenes的内切-蛋白酶Lys-C(两种酶制品应该都是测序级的，可购自Boerhinger Mannheim，德国)消化PME。
通常，用碘乙酰胺使100mg纯化的PME羧甲基化以保护还原的SH-基团。然后用胰蛋白酶(4mg/20-100ml)裂解该蛋白质。在40℃水解裂解2×3小时。加入20ml TFA以终止反应。以15,000rpm离心5分钟之后，在反相HPLC柱(Vydac 10 C18柱)上纯化肽。上样2×500ml样品。在60分钟内，用0.1％TFA中的0.05-0.35％渐增的乙腈梯度洗脱和分离肽。手工将肽收集在Eppendorf管中。
为了用内切-蛋白酶Lys-C进行消化，将冻干的PME(0.1mg)溶解于50ml 8M尿素，0.4M NH4HCO3，pH8.4中。覆盖一层N2并加入5ml 45mMDTT之后，于50℃，在N2中将蛋白质变性和还原15分钟。冷却至室温后，在室温下，黑暗的氮气氛围中，加入5ml 100mM碘乙酰胺，使半胱氨酸衍生化15分钟。随后，加入90ml水和5mg内切-蛋白酶Lys-C(溶于50ml 50mM tricine和10mM EDTA，pH8.0中)，37℃，在N2中消化24小时。
然后，按与经胰蛋白酶消化的肽相同的方法分离所得肽。
在Devosil 3 C18RP-HPLC柱0.46×10cm(Novo Nordisk，丹麦)上进一步纯化选定的肽。然后，将纯化的肽上样于使用脉冲-液体快速循环的氨基酸测序仪Applied Biosystems 476A。
通过用纯化的酶注射兔，并从抗血清中分离免疫球蛋白，即可产生抗本发明酶的抗体。所用方法可参见N Harboe和A Ingild(“免疫，分离免疫球蛋白，估计抗体滴度”，定量免疫电泳手册，方法和应用，NH Axelsen等(编)，Universitetsforlaget，Oslo，1973)和TG Cooper(“生物化学工具”，John Wiley & Sons，纽约，1977)。
以下将仅通过实施例来描述本发明，实施例将参照下列附图

图1-质粒的描述。
图2-质粒的描述。
图3-质粒的描述。
图4-质粒的描述。
图5-质粒的描述。
实施例克隆菊欧文氏杆菌PME基因材料菊欧文氏杆菌(PD97)(“E.chr.”)购自植物保护机构的培养物保藏中心(PD)Wageningen，荷兰。
欧文氏杆菌菌株的培养于30℃，在LB-培养基中培养菌株。
DNA使用Qiagen RNA/DNA试剂盒(Qiagen)从菌株中分离基因组DNA。
PCR将基因组DNA用作模板。
根据菊欧文氏杆菌B374 PME基因已公开的核苷酸序列(登录在EMBL/GenBank数据库，登记号为Y00549)，设计克隆菊欧文氏杆菌的PME基因所需的引物。
菊欧文氏杆菌PCR引物PME 5’末端引物5’-AGTCGACGTGTATGTTAAAAACGATCTCTGG-3’PME 3’末端引物5’-AGCGGCCGCAATTCGTCAGGGTAATGTCGG-3’5’末端引物含有SalI酶限制性位点(以斜体表示)，3’末端引物含有NotI酶限制性位点(以下划线表示)，便于将扩增的基因克隆至表达载体。
根据厂商说明，使用Expand High Fidelity PCR系统(BoehringerMannheim)，以下列温度循环进行PCR95℃3分钟1个循环94℃15秒，50℃30秒，68℃3分钟10个循环94℃15秒，57℃30秒，68℃3分钟，每隔一个循环再加20秒，20个循环克隆PCR片断按厂商所述，将PCR片断克隆至PCR2.1-TOPO克隆载体(Invitrogen)。
DNA测序基本上根据Sanger等(1979)的双脱氧法，使用Thermo Sequenase荧光标记的引物循环测序试剂盒对双链DNA进行测序，所述试剂盒中含有7-脱氮-dGTP(Amersham Pharmacia Biotech)，5’Cy5-标记的引物和Pharmacia LKB A.L.F.DNA测序仪(参见Sanger，F.，Nicklen，S和Coulson A.R.(1979)用链终止剂进行DNA测序，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 745463-5467)。以下列出了测序所用的引物(以5’至3’方向表示)UNI(M13-20引物)-17聚体Cy5-GTAAACGACGGCCAGTREV-19聚体
Cy5-GGAAACAGCTATGACCATG菊欧文氏杆菌PME-01 17聚体Cy5-GATTATCCATGCTGGTG菊欧文氏杆菌PME-02 18聚体Cy5-CGGCGTCTATAATGAACG菊欧文氏杆菌PME-03 16聚体Cy5-GCGACAGCGACAGCAG菊欧文氏杆菌PME-04 19聚体Cy5-CCGTGGCAGCCGCAATGACPME基因测序的核苷酸序列示于所附序列表中。
在大肠杆菌中表达菊欧文氏杆菌PME基因产生表达载体pATP1为了使用克隆基因自身的翻译起始位点，并除去组氨酸标记，可修饰得自Qiagen的pQE60表达载体，产生pATP1。pQE60表达载体示于图1。
从pQE60表达载体上切下64bp EcoRI-HindIII片断，替代以pSPORT1载体(Gibco/BRL)上50bp的EcoRI-BamHI片断，以导入更多的酶限制性位点。
50bp pSPORT1 EcoRI-HindIII片断5’AAGCTTGGATCCTCTAGAGCGGCCGCCGACTAGTGAGCTCGTCGACCCGGGAATTC3’下划线的是EcoRI酶限制性位点，黑斜体字母表示HindIII酶限制性位点。
得自pSPORT1载体的50bp片断内的10bp EcoRI-SaII片断被含有核糖体结合位点(RBS)的28bp EcoRI-SalI片断所替代，从而产生表达载体pATP1(见图2)。
通过退火两个寡核苷酸产生28bp EcoRI-SalI片断RBS引物15’CACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACCCGTCGACCCGGGAG3’RBS引物2
5’CTCCCGGGTCGACGGGTTAATTTCTCCTCTTTAATGAATTCTGTGTG3’下划线的是EcoRI酶限制性位点。
斜体字母表示的是SalI酶限制性位点。
黑体字母表示的是核糖体结合位点(RBS)。
从PCR2.1 TOPO载体的SalI和NotI位点切下从菊欧文氏杆菌中克隆的PME基因，所述位点位于PCR克隆该基因所用的引物中。将SalI-NotI基因片断再次克隆至pATP1表达载体pATP1E.chr.PME(图3)。
将pATP1E.chr.PME载体转化至M15/pREP4感受态细胞。
按厂商(Qiagen)所述，将pATP1E.chr.PME载体转化至感受态M15/pREP4细胞。
选择含有pATP1E.chr.PME载体的菌落，用于诱导菊欧文氏杆菌PME基因的表达。
大肠杆菌的培养于37℃，在LB－培养基＋100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素中，将被pATP1E.chr.PME载体转化的大肠杆菌培养过夜，将20ml预培养物加入800ml LB－培养基＋100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素中，于37℃保温。总共制备3×800ml。将细胞培养至600nm光吸收值为0.7。加入800μl 1M IPTG，37℃保温4小时之后收集细胞。
制备无细胞提取物以10000rpm离心10分钟以收集细胞，并将细胞重新悬浮于50ml提取缓冲液(50mM MES pH6.8)。以70％的负载周期超声处理4×3分钟以破碎细胞。在超声处理的间隙和过程中，将样品置于冰上。10000rpm离心10分钟之后，得到PME组分(上清液)。
层析根据下列方法纯化PME。所有操作都在4℃进行。通过阳离子交换层析分离按上文所述得到的上清液。将50ml样品上样于CM-SepharoseTMCL-6B(50ml柱材料)，用缓冲液A50mM MES pH6.8洗涤。大多数蛋白质不与柱结合，但PME吸附在柱上，用缓冲液A洗下未结合的蛋白质之后，用总共450ml渐增的NaCl梯度(0-1MNaCl)洗脱结合的蛋白质。流速为0.5ml/分钟，收集2.5ml级分。测定280nm处的蛋白质光吸收分布图。
分析所有级分的PME活性和蛋白质。用BioRad法分光光度测定蛋白质含量。
集中含有PME活性的级分，用作酶提取物，对果胶进行酶促PME处理。SDS-PAGE揭示出这种部分纯化的菊欧文氏杆菌PME级分仅含有3-4种蛋白质。
为了将PME纯化至均质，使用Centricon过滤系统，通过透析浓缩1ml集中的级分。在相同系统中进行缓冲液交换至50mM Tris，0.1MNaCl pH7。
然后将200μl浓缩的样品上样于SephacrylTMS-200(2.6×70cm)凝胶过滤柱。用50mM Tris，0.1M NaCl pH7平衡该柱。流速为0.5ml/分钟，收集0.5ml级分。
集中含有PME活性的级分，如上述使用Centricon进行浓缩。然后将浓缩样品上样于用50mM Tris，0.1M NaCl pH7平衡过的SuperdexTMG-75。流速为0.5ml/分钟，收集2ml级分。集中含有PME活性的级分并浓缩。
酶活性PME催化甲酯基从果胶上裂解下来。在纯化过程中，通过使用甲基红指示剂试验的快速法检测PME。由于甲基从果胶链中的半乳糖醛酸残基上裂解下来，因此该试验中形成了羧基，pH值降低。pH指示剂甲基红随着pH的降低，颜色由黄(pH6.2)变为粉红(pH4.2)。试验中含有1ml溶解于0.15M NaCl pH7的0.5％酸橙果胶(DE70％)和25μl样品。然后通过滴定法(Versteeg等(1978)Lebensmittel-Wiss.u.Technol.，11267-274)进一步测定在30℃保温10分钟之后显示出阳性甲基红试验的样品。
在滴定法中，试验含有10ml溶解于0.15M NaCl pH6.8的0.5％酸橙果胶和10-100μl样品。用0.02M NaOH进行滴定，并在室温下测定反应。使用自动滴定仪(Versteeg等(1978)Lebensmittel-Wiss.u.Technol.，11267-274)。
SDS-PAGE/Western印迹如上文所述，通过SDS-PAGE测定PME级分的纯度。
抗体的产生通过用纯化的酶注射兔，并从抗血清中分离免疫球蛋白，即可产生抗本发明酶的抗体。所用方法可参见N Harboe和A Ingild(“免疫，分离免疫球蛋白，估计抗体滴度”，定量免疫电泳手册，方法和应用，NH Axelsen等(编)，Universitetsforlaget，Oslo，1973)和TG Cooper(“生物化学工具”，John Wiley & Sons，纽约，1977)。
研究实验1在纯化PME的过程中，将无细胞提取物上样于阳离子交换柱(CM-Sepharose CL-6B)。PME与pH6.8的阳离子交换柱材料紧密结合，而大多数蛋白质不与柱结合，因此被洗脱至洗涤体积中。用渐增的NaCl梯度将PME洗脱成一个峰(级分56-64)。
浓缩之后，使用凝胶过滤层析(Sephacryl S-200柱)，接着使用Superdex G-75凝胶过滤进一步纯化PME级分。集中含有最高PME活性的级分。酶活性为65U/ml。
通过用1％果胶(pH4.8)进行粘度测定，来检测级分的果胶降解活性。结果表明在24小时之后，粘度没有变化。
SDS-PAGE表明纯化的PME级分中只有一条蛋白质带，其分子量为36,000D，PME的等电聚焦显示出pI＞9。
鉴定和动力学数据按“材料和方法”所述，用滴定法进行PME的鉴定和最适值的测定。
用0.15MNaCl中的0.5％酸橙果胶测定PME活性的最适pH。最适值约为pH7。酶的最适pH为中性pH，但pH5时仍能检测到最大活性的70％。
最适温度为48℃。
通过在不同温度下将酶样品置于Eppendorf管中保温15分钟，来测定PME的温度稳定性。保温之后，通过传统的滴定法测定酶活性。酶活性的稳定性为20℃-50℃。于60℃保温15分钟导致酶失活。
通过将不同果胶浓度对活性进行Hanes作图，测定酸橙果胶的亲和性。由曲线计算出Km为0.44mg/ml。Km是用DE70％的果胶测定的，结果表明Km值与用橘子PME测出的Km范围相同，但比用曲霉属真菌PME测出的Km低10倍。这意味着植物和细菌酶的催化活性比真菌酶的高10倍。
菊欧文氏杆菌PME也可以使甜菜果胶脱酯。按“材料和方法”所述测定PME活性，不同的是试验中使用的是溶解于0.15M NaCl中的1％甜菜果胶。
我们还发现酶活性不必需要NaCl。然而，加入达0.1-0.15M的NaCl会增加活性。较高浓度的NaCl会降低活性。
研究实验2用菊欧文氏杆菌PME处理的果胶与用植物PME处理的果胶特性相似钙敏感型果胶用菊欧文氏杆菌PME处理URS果胶，鉴定所得经修饰果胶的％DE和钙敏感性(CS)。
在试验中，两种果胶(Pectin 2084-125-2和Pectin 2084-125-1)因很高的Ca-敏感性而与添加的钙发生胶凝作用，因此不可能得到CS值。仅用分段式脱-甲基化的果胶才能得到很高的Ca-敏感性。
通过使用果胶裂合酶或聚半乳糖醛酸酶对菊欧文氏杆菌的经修饰果胶进行酶促指纹分析，结果表明菊欧文氏杆菌PME以分段的方式使果胶脱-甲基化，产生非聚半乳糖醛酸样片断(随机片断)。
经菊欧文氏杆菌PME处理的果胶对蛋白质饮料的粘度和稳定性的影响
SP＝果胶使酸奶饮料稳定所需的最低浓度。
URS果胶由81％脱酯为78-79％改变了Ca-敏感性。
在酸奶饮料中检测剂量浓度为0.1％，0.15％，0.175％，0.2％和0.25％的酶修饰果胶。通过诸如乳清分离，沉降％和粘度的参数研究所产生的各个酸奶饮料的品质。
结果表明经酶修饰的果胶能在0.15％的低果胶浓度下稳定蛋白质。各个样品具有低粘度。相对于标准的商用稳定剂而言，经菊欧文氏杆菌PME修饰的果胶在果胶浓度为0.15％时的粘度较低。
通过用菊欧文氏杆菌PME处理亲代URS果胶，原本不适于用作酸奶饮料中的稳定剂的果胶转变为适当的果胶，这种经处理的果胶与很好的商用稳定剂的效果一样好。
方法用菊欧文氏杆菌PME酶促处理果胶按下述制备一批酶解果胶在有效搅拌的热水中溶解45g果胶，加入15g NaCl，用水将体积调节为1.81。搅拌该溶液直至盐溶解。将果胶溶液冷却至40℃，使用1N NaOH有效搅拌使pH升高为pH6.5。加入适当的菊欧文氏杆菌PME样品，继续进行酶促反应直至获得所需程度的酯化。通过保温期间自动剂量的1NNaOH将pH维持在pH6.5不变，酶反应之后，消耗NaOH。
当果胶样品已达到所需的酯化程度时，终止加入NaOH，通过加入2％HCl将溶液的pH降低为约3.0。然后将果胶溶液加热至70℃达5分钟以完全灭活酶。用1倍体积的异丙醇沉淀经处理的果胶，用60％异丙醇洗涤，压至约半成干。然后于40℃风干这批经处理的果胶，最后研磨成干粉。
测定果胶样品钙敏感性的指数(CS)通过上述方法测定钙敏感性。
测定果胶样品的酯化程度(％DE)通过上述方法测定酯化程度。
酸奶饮料试验用68℃的足量去离子水混合奶粉20分钟，冷却至30℃，制备出标准化的脱脂奶(17％MSNF)，于30℃，用3.3％glucone-δ-内酯(GDL)将脱脂奶酸化至约pH4。将果胶样品作为糖溶液添加进去，搅拌30分钟。室温下，以200巴使酸奶饮料成为匀浆，然后装入无菌的250ml塑料瓶。在75℃的水浴中加热10分钟，其间振荡5分钟。最后，将饮料冷却至室温，然后置于5℃储存过夜。
酸奶饮料的粘度测定使用Brookfield粘度计11T，以rpm30测定牛奶饮料样品的粘度。搅拌30秒之后测定粘度。
通过离心试验测定蛋白质稳定性室温下，以2300×g离心40g样品(如酸奶饮料)20分钟。弃上清，将离心玻璃管头朝下放置30分钟。称重玻璃管，按下述计算沉降％％沉降＝[(离心后玻璃管的重量-玻璃管重量)/样品重量]×100构建芽孢杆菌表达质粒pCS修饰芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体pDP66K(得自荷兰Groningen大学的L.Dijkhuizen，Rijks博士)，使其适于克隆和表达不同基因。pDP66K载体详细描述于Penninga D等(1996)。(需说明的是，本实验中也可以使用任何其它适当穿梭载体-如商用穿梭载体)。通过修饰启动子，环化糊精糖基转移酶(cgt)信号序列，缺失其余环化糊精糖基转移酶基因和取代转录终止序列，产生pCS质粒。通过PCR修饰p32启动子和环化糊精糖基转移酶信号序列，以使信号序列3’末端ATG密码子处含有NcoI位点。转录终止序列被得自pUB110质粒，经PCR扩增的转录终止序列所取代(McKenzie，T.，Hoshino，T.，Tanaka，T和Sueoka，N(1986)，pUB110的核苷酸序列一些与复制及其调节相关的显著特征，质粒15(2)，93-103和McKenzie，T.，Hoshino，T.，Tanaka，T和Sueoka，N(1987)校正，pUB110核苷酸序列和功能图谱的修正，质粒17(1)，83-85)。为了便于克隆，将5’BamHI和3’HindIII酶限制性位点导入经PCR扩增的转录终止序列。所得pCS质粒示于图5。
产生PME基因片断以克隆至芽孢杆菌pCS质粒扩增两个PME基因PCR产物，含有全长编码区的一个产物的第二个氨基酸由亮氨酸转变为缬氨酸，从而在基因5’ATG起始密码子处导入NcoI位点以便于克隆。为了便于克隆，在3’末端导入BamHI位点。在氨基酸水平上，由第25位丙氨酸氨基酸密码子起始扩增第二个PME基因PCR产物，该产物不含基因信号序列。设计PCR产物，使其在起始丙氨酸氨基酸之前含有甲硫氨酸以导入克隆所必需的NcoI。在PCR产物的3’末端导入BamHI位点。通过DNA测序证实两个PME序列的PCR扩增。使用NcoI和BamHI限制性酶将两个扩增的PME序列克隆至pHM质粒，使用相同的酶将不含信号序列的PME序列克隆至pCS质粒。
在芽孢杆菌中表达PME基因将4个不同的构建体转化至枯草芽孢杆菌，并在含有50mg/ml卡那霉素的2×YT培养基中培养。
在黑曲霉中表达菊欧文氏杆菌PME基因构建表达载体pPR42-FS-PMEA为了在黑曲霉中进行表达，使菊欧文氏杆菌PME基因装备有得自黑曲霉PME基因的真菌信号序列(Khanh，N.Q等(1991)，基因1,71-77)，所述信号序列含有下列序列黑曲霉PME信号序列ATGGTTAAGTCAATTCTTGCATCCGTTCTCTTTGCGGCGACTGCGCTGGCCMetValLysSerIleLeuAlaSerValLeuPheAlaAlaThrAlaLeuAla使用3个重叠的寡核苷酸5’末端引物P1，P2和P3以及3’末端引物P4，通过PCR融合真菌信号序列与菊欧文氏杆菌PME基因编码序列的5’端。
P15’-GCGGCGACTGCGCTGGCCATGTTAAAAACGATCTCTGGAACCCP25’-AAGTCAATTCTTGCATCCGTTCTCTTTGCGGCGACTGCGCP35’-TGAATTCTCATGGTTAAGTCAATTCTTGCATCCGP45’-TACTAGTGTCAGGGTAATGTCGGC5’末端引物P1含有菊欧文氏杆菌PME编码序列的5’端(下划线部分)。为了便于克隆，5’末端引物P3含有EcoRI限制性酶位点(下划线部分)，3’末端引物P4含有SpeI限制性酶位点(下划线部分)。
根据厂商说明，用Expand High Fidelity PCR system (BoehringerMannheim)进行PCR。
根据厂商说明，将扩增的DNA片断克隆至PCR2.1-TOPO克隆载体(Invitrogen)，所述片断含有与菊欧文氏杆菌PME基因融合的真菌信号序列。根据厂商的推荐，使用热测序酶荧光循环测序试剂盒(Amersham)和ALF DNA测序仪(Pharmacia)对克隆的DNA片断进行测序。
从PCR2.1-TOPO克隆载体上切下EcoRI DNA片断，该片断含有真菌信号序列和菊欧文氏杆菌PME基因，将此片断导入含有XlnB启动子和TrpC终止子的真菌表达载体pPR42(见WO 9838321 A)，产生载体pPR42-FS-PMEA(图4)。
转化黑曲霉使用修改自Van Someren等(1991)Curr.Genet.20，293-299的方法，利用与黑曲霉乳清苷-5’-磷酸-脱羧酶基因共转化并选择尿苷营养缺陷型突变的互补体(Goosen等(1987)Curr.Genet.11，499-503)，将pPR42-FS-PMEA载体转化至黑曲霉的尿苷营养缺陷型突变体。
于30℃，将含有5mM尿苷的PDA(马铃薯葡萄糖琼脂-Difco Lab.Detroit)平板保温3-4天，为了纯化黑曲霉的原生质体，将平板上长出的孢子洗至10ml ST(8g/l NaCl，0.5g/l吐温20)中。按106个孢子/ml的密度将孢子接种于500ml摇瓶内的200ml生长培养基中。
生长培养基含有6g/l NaNO3，1.5g/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4.7H2O，0.5g/l KCl，10mM(NH4)2SO4，0.2％酪蛋白酶促水解物(Sigma C-0626)，2％葡萄糖，0.5％酵母提取物(Difco 0127-17-9)，10mM 尿苷，10mg/lEDTA，4.4mg/l ZnSO4.7H2O，1mg/l MnCl2.4H2O，0.32mg/l CoCl2.6H2O，0.32mg/l CuSO4.5H2O，0.22mg/l (NH4)6MO7O24.4H2O，1.47mg/lCaCl2，2H2O，1.0mg/l FeSO4.7H2O，pH6.0。
于30℃，以230-250rpm的转速将烧瓶振荡16-18小时。使用Miracloth收集菌丝体，用SMC(1.33M山梨糖醇，50mM CaCl2，20mMMES，pH5.8)将菌丝体洗涤2-3次。在无菌瓶内，将1g湿菌丝体重新悬浮于20ml含有150mg裂解酶(Sigma L-2265)的SMC中，于37℃保温，以80-100rpm的转速振荡1-3小时直至原生质体释放出来。通过使悬浮液穿过5ml无菌玻璃棉，接着以3000rpm离心10分钟以收集原生质体。用5-10ml STC(1.33 M山梨糖醇，50mM CaCl2，10mM Tris/HCl，pH7.5)将原生质体洗涤2次，最后以1×108个原生质体/ml的密度重新悬浮于STC中。
为了进行转化，小心地将0.2ml原生质体与5-10mg DNA(pPr42-FS-PMEA)，0.5mg选择DNA(pGW635-含有乳清苷-5′-磷酸脱羧酶基因(Goosen等(1987)Curr.Genet.11，499-503))和50ml PEG溶液(0.25g/ml PEG 6000，50mM CaCl2，10mM Tris/HCl，pH7.5)混合。于室温下保温混合物20分钟，然后小心加入2ml PEG溶液并混合。再于室温下保温5分钟，加入6ml STC，小心振荡混合物。以300rpm离心混合物10分钟，除去大多数上清液。
将原生质体重新悬浮于其余的1-2ml上清液中，与TR软琼脂(6g/lNaNO3，1.5g/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4.7H2O，0.5g/l KCl，1.22M山梨糖醇，10mg/l EDTA，4.4mg/l ZnSO4.7H2O，1mg/l MnCl2.4H2O，0.32mg/lCoCl2.6H2O，0.32mg/l CuSO4.5H2O，0.22mg/l(NH4)6MO7O24.4H2O，1.47mg/l CaCl2，2H2O，1.0mg/l FeSO4.7H2O，0.8％琼脂(Difco 0140-01)，pH6.0)混合，铺于TR平板(与TR软琼脂组分相同，但含有1.2％琼脂)。挑选转化的菌落，影印在新鲜的TR平板上。
培养黑曲霉转化子以表达菊欧文氏杆菌PME基因为了在黑曲霉转化子中表达菊欧文氏杆菌PME基因，将孢子(约500,000个/ml)接种于诱导培养基(6g/l NaNO3，1.5g/l KH2PO4，0.5g/lMgSO4.7H2O，0.5g/l KCl，10mM(NH4)2SO4，10mg/l EDTA，4.4mg/lZnSO4.7H2O，1mg/l MnCl2.4H2O，0.32mg/l CoCl2.6H2O，0.32mg/lCuSO4.5H2O，0.22mg/l(NH4)6MO7O24.4H2O，1.47mg/l CaCl2.2H2O，1.0mg/l FeSO4.7H2O，29.4g/l柠檬酸钠.2H2O，0.2％酪蛋白酶促水解物(Sigma C-0626)和2％木糖)中，于30℃振荡保温。2-3天之后，每天取出上清液样品，分析PME活性。
研究实验3通过上述方法检测黑曲霉中表达的PME的活性。比活为600U/mg蛋白质。
通过SDS-PAGE鉴定蛋白质，结果证实蛋白质的分子量为36kDa。成熟蛋白质的正确分子量表明该蛋白质未糖基化。对重组PME蛋白进行MALDI TOF MS分析，结果也表明酶未糖基化。在氨基酸序列中检测到两个潜在的N-糖基化位点。
测定蛋白质N-末端的序列，N-末端序列是ATTYNAVV。该结果表明真菌信号肽和欧文氏杆菌的信号肽都被正确加工，产生了不含任何N-末端信号肽的成熟蛋白质。
黑曲霉中表达的菊欧文氏杆菌PME的最适pH为pH5.5至7。在大肠杆菌中表达的菊欧文氏杆菌PME也具有相同的pH分布图。
使用YM 10膜(Amicon)超滤浓缩曲霉表达的菊欧文氏杆菌PME，然后再对果胶进行酶促修饰。
用曲霉表达的菊欧文氏杆菌PME修饰果胶方法在有效搅拌的热水中溶解40g GRINDSTEDTMPectin URS 1400，加入7.8g NaCl，用水将体积调节为1.331。搅拌果胶溶液直至所有物质都已溶解，然后冷却至37℃。使用1N NaOH有效搅拌使pH升高为pH5.5。加入26U PME，在约2小时内，通过自动剂量的1N NaOH将pH和温度维持在pH5.5和37℃不变，直至消耗8ml 1N NaOH。通过加入2N HCl将溶液的pH降低为3.0以终止酶反应。然后将果胶溶液加热至70℃达5分钟以完全灭活酶。用1倍体积的异丙醇沉淀经处理的果胶，用60vol.％异丙醇洗涤，压至约半成干。然后于50℃风干经处理的果胶，最后研磨成干粉。分离38.7g经酶处理的果胶。
结果分析经曲霉表达的菊欧文氏杆菌PME处理的果胶的％DE和钙敏感性(CS)。结果表明经酶处理的果胶相对于亲代果胶而言具有增加的钙敏感性。酶处理导致产生HE-果胶，其具有显著较高的钙敏感性。这些结果与用大肠杆菌中表达的菊欧文氏杆菌PME得到的结果相同。
讨论已分离和鉴定出细菌PME(菊欧文氏杆菌)。DE为81％的URS果胶已被此PME脱酯成具有不同DE％的经修饰果胶。果胶的鉴定揭示出果胶为具有中度钙敏感性的果胶或是在高DE％时钙敏感性很高的果胶。我们相信这是首次证明细菌PME能以分段的方式使果胶去甲基化。
在本发明的特定实施方案中，已在酸奶饮料系统中检测了DE为78％的经修饰果胶。结果表明浓度为0.15％果胶的经修饰果胶能稳定酸奶饮料中的蛋白质。只有很高果胶浓度(＞0.5)的URS果胶才能稳定酸奶饮料中的蛋白质。
类似地，我们相信这是首次证明细菌PME能以分段的方式使果胶去甲基化，而且能产生钙-敏感型果胶，其中经修饰的果胶能稳定化酸奶饮料。
方案方案I钙敏感性指数(CS)钙敏感性被测定为溶解于含57.6mg钙/g果胶的溶液中的果胶粘度除以未加钙的溶液中完全等量的果胶的粘度。对钙不敏感的果胶的CS值为1。
将4.2g果胶样品溶解于550ml有效搅拌的热水中。使溶液冷却至约20℃，用1N HCl将pH调节至1.5。用水将果胶溶液调节至700ml并搅拌。分别在4个粘度玻璃管中测定145g该溶液。在两个玻璃管中搅拌加入10ml水(双份测定)，在其它两个玻璃管中搅拌加入10ml250mM CaCl2溶液。
在有效磁力搅拌的同时，在所有4个粘度玻璃管中加入50ml醋酸盐缓冲液(0.5M，pH约为4.6)，从而使果胶溶液的pH达到pH4.0。除去磁力，将玻璃管置于20℃过夜。第二天用Brookfield粘度计测定粘度。按下式计算钙敏感性指数CS＝含57.6mg Ca2+/g果胶的溶液的粘度/含0.0mg Ca2+/g果胶的溶液的粘度方案II酯化程度(％DE)在50ml 60％异丙醇和5％HCl溶液中加入2.5g果胶样品，搅拌10分钟。使果胶溶液滤过玻璃滤器，用15ml 60％异丙醇/5％HCl溶液冲洗6次，接着再用60％异丙醇冲洗直至过滤物不含氯化物。于80℃使过滤物干燥过夜。
在锥瓶中混合20.0ml 0.5N NaOH和20.0ml 0.5N HCl，加入2滴酚酞。用0.1N NaOH滴定直至得到持久的颜色改变。0.5N HCl应该比0.5NNaOH稍强。加入的0.1N NaOH的体积以V0表示。
在锥瓶中测定0.5g干燥的果胶样品(过滤物)，将样品用96％乙醇弄湿。加入100ml刚刚煮沸并冷却的蒸馏水，搅拌所得溶液直至果胶完全溶解。然后加入5滴酚酞，用0.1N NaOH滴定溶液(直至颜色改变且pH为8.5)。此处，所用0.1N NaOH的体积以V1表示。加入20.0ml 0.5NNaOH，用力振荡烧瓶，然后静置15分钟。加入20.0ml 0.5N HCl，振荡烧瓶直至粉色消失。然后加入3滴酚酞，用0.1N NaOH滴定所得溶液，所用0.1N NaOH的体积以V2表示。
按下式计算酯化程度(％DE占总羧基的百分数)％DE＝(V2－V0)/[V1＋(V2－V0)]方案III饮料试验1.导言以下将描述仅使用约1.7g果胶至尽可能少的果胶的方案。评价系统性能所用的方法是粘度测定法，离心沉降法和颗粒大小测定。
2.材料和方法2.1材料含有约36％蛋白质的脱脂奶粉得自Mejeriernes FaellesIndkob(Kolding，丹麦)。通过用本发明的经修饰PME处理果胶，得到试验所用的果胶。这些果胶可以具有不同的特性，例如酯化程度和分子量，这取决于所用经修饰PME的类型。
2.1制备牛奶饮料通过混合酸奶溶液和果胶溶液，接着进行进一步加工以制备牛奶饮料。
用68℃的蒸馏水溶解17％(w/w)脱脂奶粉，并搅拌30分钟，制备出牛奶溶液。于30℃，通过加入3.3％(w/w)glucono-d-内酯(GDL)将牛奶溶液酸化至pH4.1。
分几步制备果胶溶液。首先，以3∶2的重量比干混果胶和葡萄糖，然后用蒸馏水制备混合物的1.11％(w/w)溶液。制备果胶溶液的最后一步是加入蔗糖至终浓度为17.8％(w/w)。
然后通过将1份牛奶溶液与1.13份(w/w)果胶溶液相混合，接着进行热处理(见3.2节)，并于20℃，使用Mini Jet匀浆器以20-22MPa进行匀浆(Burgaud等，1990)，制备出牛奶饮料。通过这些操作程序，牛奶饮料中果胶的终浓度为0.3％(w/w)。所有样品都产生双份，储存于5℃，第二天，检测其粘度，颗粒大小和沉降。
2.3粘度测定使用Bohlin VOR Rheometer系统(Bohlin Instruments，Metric GroupLtd.，Gloucestershire，英国)测定粘度。通过Bohlin lower-plate温控装置获得恒温。以91.9s-1的剪切速率测定粘度。测量温度为20℃，在测量前将样品置于20℃约1小时。所用测量系统是C14(同轴圆柱体系统)。所用转矩元件为0.25gcm。整联时间为5s，测量间隔为30s，未使用自动调零。在PC上用Bohlin Rheometer软件4.05版本进行仪器控制和原始数据处理。
2.4颗粒大小测定用Malvern Mastersizer Micro Plus(Malvern Instruments Limited，Worcestershire，UK)测定颗粒的平均直径D[4.3]。仪器设置为显示码5NBD，分析模型多分散。在PC上用Mastersizer Microplus的Windows2.15版本进行仪器控制和原始数据处理。
将得自用4号果胶制备的一批酸奶饮料的超滤渗透物用于稀释。使用装配有GR61PP膜的DDS UF Lab 20-0.36组件进行超滤，所述膜的截留分子量为20,000Da。
2.5沉降通过使用IEC Centra-8R离心机(International Equipment，NeedhamHts，MA，美国)离心样品来进行沉降测定。于20℃，以2400g将2.5g酸奶饮料离心25分钟。除去上清液，将试管倒置15分钟，测定沉降重量，将其表示为百分比(占所用牛奶饮料量的百分比)。对每份样品进行双份实验。
3.结果和讨论3.1试验系统的大小相对于以前的实验系统而言，这个新系统较小，但它仍保留了与基于550g酸奶饮料的现存试验系统相同的特性。制备在酸奶饮料中检测果胶所用模型系统的最简单方法是简单地混合搅拌酸奶饮料与果胶溶液，并对此混合物进行测量。这样做的优点是实际上可以在任何规模上进行检测。然而，Glahn和Rolin证实匀浆化会减少稳定所需的果胶量，匀浆化和热处理对稳定性具有相当大的影响。由于现存的550g规模的系统中包括匀浆化和热处理(如同在工业过程中一样)，因此，小规模的系统中也需要存在这两种处理。
在工业中，使用上游(加热之前)和下游(加热之后)匀浆化。在此模型系统中，我们选择在热处理之后再进行匀浆化，因为这样可以得到更加均一的样品，从而使重现粘度的测量结果变得更加容易。
为了用Mini Jet匀浆器获得可再现的匀浆化，为了补偿样品转移过程中的多种损失，需要在匀浆阶段用40ml样品进行操作。由于试验仅需要8-9ml样品(粘度测定需要2.5ml，沉降需要5ml，颗粒大小测定需要0.5-1ml)，需要最大量样品的步骤是匀浆化，因此，结果是现存的试验系统的规模是550g-40g牛奶饮料。
3.2热处理为了制备尽可能酷似现存试验系统的小规模系统，需要对热处理步骤进行改动。现存的550g系统加热发生在600ml蓝-帽瓶中，75℃水浴30分钟，每5分钟搅拌一下。
在新的40g系统中，热处理在50ml塑料离心管中进行，该离心管被置于装满水的600ml蓝-帽瓶中。此处75℃的水浴太热，可能是因为水的导热性大于凝固的牛奶的缘故。因此，试验了70-75℃之间的不同温度，发现72℃30分钟(不搅拌)给出的温度分布图非常近似于大系统的温度分布图。
3.3检测小规模系统如果用果胶(该果胶已用本发明的经修饰PME处理过)稳定的牛奶饮料显示出很少的沉降和小颗粒，这就表明使用了很好的果胶，另外，还说明本发明的经修饰PME适用于此用途。
4.结论在酸奶饮料中检测稳定果胶粉末的系统的规模已成功地被降至550g至40g牛奶饮料，这意味着所需的果胶量由ca.1.7g降至ca.0.15g。如此少的量足以筛选用本发明的经修饰果胶处理过的实验果胶样品。阐明了两种方法之间颗粒大小，粘度和沉降结果的高度相关性。规模降低的方法相对较简单，但它仍含有加热和匀浆化步骤，这对工业相关性来说非常重要。
方案IVPME活性PME催化甲酯基从果胶上裂解下来。在纯化过程中，通过使用甲基红指示剂试验的快速法检测PME。由于甲基从果胶链中的半乳糖醛酸残基上裂解下来，因此该试验中形成了羧基，pH值降低。pH指示剂甲基红随着pH的降低，颜色由黄(pH6.2)变为粉红(pH4.2)。通常，试验中含有1ml溶解于0.15M NaCl pH7的0.5％ GrindstedTMPectin 1450(DE70％)(由Danisco Ingredients，Danisco A/S提供)和25μl样品。然后通过滴定法(Versteeg等(1978) Lebensmittel-Wiss.u.Technol.，11267-274)进一步测定在30℃保温10分钟之后显示出阳性甲基红试验的样品。
在滴定法中，试验一般含有10ml溶解于0.15M NaCl pH6.8的0.5％酸橙果胶(GrindstedTMPectin 1450-由Danisco Ingredients，Danisco A/S提供)和10-100μl样品。用0.02M NaOH进行滴定，并在室温下测定反应。使用自动滴定仪(Versteeg等(1978)Lebensmittel-Wiss.u.Technol.，11267-274)。
为了方便起见，下表示出了氨基酸密码。
上述说明书中提及的所有出版物都列入本文作为参考。本发明所述方法和系统的多种修饰和变化对本领域技术人员而言是显而易见的，并不背离本发明的范围和精神。尽管联系特定的优选实施方案描述了本发明，但应该理解所要求的发明应该不仅仅局限于这些特定的实施方案。实际上，对分子生物学或相关领域技术人员而言显而易见的，对实施本发明的所述模式所作的多种修饰也包括在下列权利要求书的范围内。
参考文献Glahn.P.E.Rolin，C.Food Ingredients Europe，Conf. Proc.252-256(1994)Burgaud，I.，Dickinson，E.，Nelson，E国际食品科学和技术杂志25，39-46(1990)Finer JJ，Vain P，Jones MW & McMullen MD(1992)将DNA传递至植物细胞所用的颗粒注入枪的发展植物细胞报道11323-328Klein TM，Wolf ED，Wu R & Sanford JC(1987)将核酸传递至活细胞所用的高速微射弹自然32770-73Sanford JC，Klein TM，Wolf ED & Allen N(1987)使用颗粒轰击法将物质传递至细胞和组织微粒科学和技术527-37Vain P，Keen N，Murillo J，Rathus C，Nemes C & Finer JJ(1993)颗粒注入枪的发展植物细胞，组织和器官培养33237-246Penninga D，van der Veen BA，Knegtel RMA，van Hijum SAFT，Rozeboom HJ，Kalk KH，Dijkstra BW，Dijkhuizen L.(1996)环状芽孢杆菌菌株251的环糊精糖基转移酶的粗淀粉结合结构域，生物化学杂志，2712777-32784序列SEQ.I.D.NO.1菊欧文氏杆菌果胶甲脂酶cDNAATGTTAAAAA CGATCTCTGG AACCCTCGCG CTGTCGCTGA TTATCGCTGC CAGCGTACATCAGGCACAGG CAGCGACCAC CTACAACGCT GTGGTATCAA AATCCTCCAG CGACGGCAAAACAATCAAAA CTATTGCCGA CGCAATTGCC AGCGCCCCAG CAGGCAGCAC GCCGTTCGTCATTTTGATCA AGAACGGCGT CTATAATGAA CGCCTGACGA TTACCCGCAA TAACCTGCATCTGAAAGGCG AAAGTCGTAA CGGTGCGGTC ATTGCGGCTG CCACGGCGGC GGGCACCCTGAAATCGGACG GCAGCAAGTG GGGAACGGCA GGCAGCAGCA CCATCACCAT CAGCGCCAAGGATTTCAGCG CCCAGTCGCT GACCATTCGC AACGACTTTG ATTTCCCGGC CAATCAGGCCAAAAGCGACA GCGACAGCAG TAAAATCAAG GACACGCAGG CAGTTGCGCT CTATGTCACCAAAAGCGGCG ACCGCGCCTA CTTCAAAGAC GTCAGTCTGG TCGGCTATCA GGACACGCTGTATGTTTCCG GCGGCCGCAG TTTCTTCTCC GACTGCCGTA TCAGCGGCAC GGTTGACTTTATCTTTGGCG ACGGCACCGC GCTGTTCAAC AACTGCGATC TGGTTTCCCG CTATCGCGCTGATGTGAAAA GCGGCAATGT TTCCGGCTAC CTGACCGCGC CCAGCACCAA CATCAATCAGAAGTATGGCC TGGTGATCAC CAACAGTCGC GTGATACGGG AAAGTGACTC TGTACCGGCGAAAAGCTACG GGCTGGGTCG CCCCTGGCAT CCAACAACAA CCTTCTCTGA TGGCCGTTACGCGAATCCGA ACGCTATTGG TCAGACCGTT TTCCTGAACA CCAGCATGGA TAATCATATTTATGGTTGGG ACAAGATGTC CGGCAAGGAC AAAAACGGCA ACACCATCTG GTTCAACCCGGAAGATTCCC GTTTCTTCGA GTACAAATCC TATGGCGCGG GAGCGGCGGT GAGCAAAGACCGCCGACAGT TGACTGACGC ACAGGCGGCA GAGTACACGC AGAGCAAAGT CCTGGGCGACTGGACGCCGA CATTACCCTG A菊欧文氏杆菌果胶甲脂酶MLKTISGTLA LSLIIAASVH QAQAATTYNA VVSKSSSDGK TIKTIADAIA SAPAGSTPFVILIKNGVYNE RLTITRNNLH LKGESRNGAV IAAATAAGTL KSDGSKWGTA GSSTITISAKDFSAQSLTIR NDFDFPANQA KSDSDSSKIK DTQAVALTVT KSGDRAYFKD VSLVGYQDTLYVSGGRSFFS DCRISGTVDF IFGDGTALFN NCDLVSRYRA DVKSGNVSGY LTAPSTNINQKYGLVITNSR VIRESDSVPA KSYGLGRPWH PTTTFSDGRY ANPNAIGQTV FLNTSMDNKIYGWDKMSGKD KNGNIIWFNP EDSRFFEYKS YGAGAAVSKD RRQLTDAQAA EYTQSKVLGDWTPTLP
权利要求
1.用果胶甲脂酶(PME)处理果胶的方法；其中PME不是植物PME；但其中PME能表现出至少一种植物PME的特性；其中至少一种植物PME的特性包括至少分段式地使果胶脱酯。
2.根据权利要求1的方法，其中PME的分子量约为36,000D，和/或pI约为＞9，和/或对酸橙果胶而言的最适pH(通过上述方法测定)约为7，和/或对酸橙果胶而言的最适温度(通过上述方法测定)约为48℃。
3.根据权利要求1或2的方法，其中PME含有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或其变体，衍生物或同系物，包括其组合。
4.根据上述任一权利要求的方法，其中PME具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或其变体，衍生物或同系物。
5.根据上述任一权利要求的方法，其中PME具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
6.根据上述任一权利要求的方法，其中PME由含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的核苷酸序列，或其变体，衍生物或同系物，或其组合表达。
7.根据上述任一权利要求的方法，其中PME由具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的核苷酸序列，或其变体，衍生物或同系物表达。
8.根据上述任一权利要求的方法，其中PME由具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的核苷酸序列表达。
9.根据上述任一权利要求的方法，其中使用DNA技术制备PME。
10.根据上述任一权利要求的方法，其中PME可得自微生物，优选得自细菌。
11.根据上述任一权利要求的方法，其中在钠离子的存在下用PME处理果胶。
12.根据权利要求11的方法，其中钠离子源自NaCl，NaNO3或Na2SO4或其组合。
13.根据上述任一权利要求的方法，其中方法还包括将经PME处理的果胶与活性PME分开的步骤。
14.根据权利要求13的方法，其中经PME处理的果胶是高酯果胶。
15.根据权利要求13或14的方法，其中经PME处理的果胶含有约70％至约80％酯基。
16.根据权利要求13至15中任一项的方法，其中经PME处理的果胶含有约72％至约80％酯基。
17.根据权利要求13至16中任一项的方法，其中经PME处理的果胶含有约74％至约80％酯基。
18.根据权利要求13至17中任一项的方法，其中经PME处理的果胶含有约76％至约80％酯基。
19.根据权利要求13至18中任一项的方法，其中经PME处理的果胶含有约77％至约80％酯基。
20.根据上述任一权利要求的方法，其中方法还包括在适于消耗的介质中加入经PME处理的果胶的步骤。
21.根据权利要求20的方法，其中介质是水溶液。
22.根据权利要求20或21的方法，其中水溶液是饮料。
23.根据权利要求20至22中任一项的方法，其中介质为酸性环境。
24.根据权利要求23的方法，其中酸性环境的pH约为3.5至5.5，优选酸性环境的pH为4至约5.5。
25.根据权利要求24的方法，其中酸性环境的pH约为4。
26.根据权利要求20至25中任一项的方法，其中饮料是酸奶饮料。
27.根据权利要求20至26中任一项的方法，其中介质含有和/或富含蛋白质。
28.根据权利要求27的方法，其中蛋白质源自或可以源自或包含在乳制品中。
29.根据权利要求27的方法，其中蛋白质源自或可以源自或包含在植物制品中。
30.通过上述权利要求中任一项的方法制备的，经PME处理的果胶。
31.一种食品，其中含有通过上述权利要求中任一项的方法制备的，经PME处理的果胶。
32.如权利要求3至10中任一项所限定的PME用于以分段的方式降低果胶中的酯基数目的用途。
33.如权利要求3至10中任一项所限定的PME用于使至少基本上所有果胶链上的两个或多个邻接果胶半乳糖醛酸残基脱酯的用途。
全文摘要
本发明描述了用果胶甲脂酶(PME)处理果胶的方法,所述PME不是植物PME;但PME能表现出至少一种植物PME的特性;其中至少一种植物PME的特性包括至少分段式地使果胶脱酯。
文档编号A23L1/0524GK1326513SQ99813293
公开日2001年12月12日 申请日期1999年9月15日 优先权日1998年9月16日
发明者T·M·I·E·克里斯滕森, A·A·佩德森, J·布伦斯特德特, J·D·米克尔森 申请人:丹尼斯科有限公司