专利名称：获得遗传修饰植物的方法及通过此方法得到的植物材料和植物产地的制作方法
技术领域：
本发明涉及获得遗传修饰植物的方法，其中的植物尤指木本植物，特别是桉属(Eucalyptus)及松属(Pinus)植物，以及由此遗传修饰得到的植物，植物材料以及植物产品。更明确的说，本发明涉及获得遗传修饰植物的一些技术，遗传修饰植物包括转基因木本植物及种间杂交木本植物，特别是桉属和松属植物。
背景技术：
植物遗传工程的最新进展使得将DNA转入植物，包括重要的商用林业树种，成为可能。遗传工程在重要商用林业植物品种中的应用为在林业植物品种中引入新的或被改进的诸如抗病性、雄性不育、产量提高、生根性(rooting ability)、优良木材品质等具商业利益的特性提供了可能性。
商业规模的林业树种一般是直接由种子或生根的插条得到。在这两个培育系统中，一般采用传统的植物育种技术来得到优良的植物母株。与使用传统的育种技术得到的母株相比，将同源和/或异源遗传物质稳定地导入植物的遗传工程技术的应用能够得到改进的植物母株。
总的来说，遗传修饰植物技术的效率取决于用于将同源和/或异源遗传物质稳定的导入植物细胞或组织的转化技术的效率及用于由转化细胞得到有活力植物的再生技术的效率。一般来说，用于遗传修饰诸如桉属等林业植物的转化和再生技术的效率都很低。
有成功的将DNA转入诸如桉属植物在内的商用林业树种的报道，“桉属植物转化进展”，Biological Sciences Symposium，TAPPIPresspp.313-326，1997。一般通过农杆菌(Agrobacterium)介导的转化得到遗传转化。转化技术使用报道基因，诸如GUS(β-D-葡糖醛酸糖苷酶)、nptII(新霉素磷酸转移酶)和cat(氯霉素乙酰转移酶)等。由转化细胞再生植物需要一个可重复的可靠的组织培养物再生体系。为林业植物品种发展的再生体系的重复性和效率都很低。再生步骤是转基因林业植物获得的主要限制因子。
植物组织培养的技术已得到了很好的发展并被广泛的用于不同种桉属植物的微量繁殖(Micropropagation)中，LeRoux和Van Staden，“关于不同桉属植物的微量繁殖和组织培养的综述”，TreePhysiology9435-477，1991。用于微量繁殖的技术通常包括腋芽增殖。用茎节的叶腋诱导产生腋芽，使腋芽延伸为枝条，重复上述过程，以得到更多的腋生枝。当得到足够量的克隆时，令枝条生根再将其移植。由于该体系能可信的产生稳定的纯种无性繁殖体，它被广泛的应用于供重新造林的克隆的商用生产中。
尽管腋芽增殖体系已得到了很好的发展，它并不是再生遗传修饰植物的优选再生方案。由于由腋芽增殖再生技术得到的腋芽通常是由可能同时带有转化细胞和未转化细胞的芽产生，因此由此法得到的转基因植物经常是嵌合的。由嵌合组织得到的转基因植物中只有部分被转化并带有被导入的遗传物质。
申请人在出版物上看到了两篇关于桉属植物再生的方案。在一篇发表于Plant Cell Reports13473-476,1994，的方案中，描述了使用叶外植体的器官发生方法。在一篇发表于Suid-AfrikaanseBosboutydskrif15759-65，1991，的方案中，描述了使用叶外植体的体细胞胚胎发生方法。这些报道的方法的效率都很低，并且它们所需的用于再生过程的时间过长，长达六个月的再生时间对于商用是不实际的，此外，这些方法都没有被申请人成功的重复。
获得遗传修饰植物方法的成功性和效率主要取决于组织培养再生体系的选择和优化，再生系统应提供由转化细胞从头开始起源得到植物材料的方法和遗传修饰植物材料长成遗传修饰植物的发育。迄今为止，用于获得诸如桉属植物在内的遗传修饰林业植物的技术存在着再生方法的重复率低、再生过程持续时间长、植物再生效率低(0-5％)及转化效率低等缺点。本发明为获得遗传修饰植物，尤其是林业植物，特别是桉属和松属植物，提供了一种改进的方法。
发明概述本发明包括获得遗传修饰植物材料，特别是桉属或松属木本植物材料的方法。优选土壤农杆菌介导的转化技术，由此通过熟知的技术将一个或多个包含报道基因和期望被导入的遗传物质的构建体转入农杆菌菌株。再用携带这些目标遗传构建体的农杆菌接种靶植物材料。
靶植物的优选组织外植体包含由微量繁殖的枝条培养物得到的茎节。首先在增殖培养基中预处理靶植物茎节，再将它们转移至延伸培养基中促进成熟枝条的形成。从靶植物茎节中切下的节、叶和/或从枝条外植体中选择的节优先被移出。通过穿孔或切割的方法对茎节和/或节进行进一步损伤。接着将茎节和/或节与转化了的农杆菌培养物一起培养以将期望的遗传物质接入靶植物外植体。接种后，在组织培养物中用组合再生剂对农杆菌侵染的茎节进行不定枝芽再生的诱导。由于使用的转化和再生技术提供了由转化细胞从头开始的枝条起源，本发明中的体系对于生产遗传修饰植物十分有利。
培养一段适当的时间使不定枝生芽，由茎节上切下推定的被转化不定枝。用选择技术来确定转化成功的不定枝。根据使用的不同报道构建体，选择技术可能有所区别。在一种优选实施方案中，转入农杆菌后又转入外植体的报道构建体含有抗生素抗性基因。在这种系统中，合适的选择剂包括抗生素。优选一种两步选择技术，第一步，将不定枝置于含第一种浓度选择试剂的第一步选择培养基中，其中的选择剂优选为抗生素，第二步，将存活的不定枝移入含第二种浓度的选择试剂的第二步选择培养基中，其中，第二步的选择剂浓度比第一步的高。这种两步选择技术基本上排除了被选择不定枝中的嵌合型。
经过对转化不定枝的选择，将转化的不定枝移植至生根培养基中运用本领域中熟知的生根技术使其生根。将生根后的枝条，或小植株，移植至栽培培养基中至完成转化和再生的过程。小植株中包含通过遗传构建体引入的遗传物质。遗传修饰小植株可长成成熟的遗传修饰植物。由成熟的遗传修饰植物得到的产品，如木材、木浆、木质燃料等等，也含有这些遗传修饰。
本发明中的转化和再生方法可被重复，并且与过去报道过的用于林业植物的方法相比，本发明中的方法显著减少了得到遗传修饰植物材料过程转化和再生所需的时间。应用于桉属植物，本发明中的方法将转化和再生的持续时间由六个月或更多缩短至十到十五个星期。这种缩短是巨大的。本发明中的方法适用于商用遗传修饰植物的生产，包括林业植物，如桉属和松属植物。
本发明中的方法尤其适用于得到林业植物的遗传修饰植物和植物材料，特别是桉属和松属植物。使用这些方法可将新的基因、已有基因的额外拷贝或基因组的非编码区导入选择的克隆中而对植物基因组影响很小。引入许多期望的性状如抗虫性、抗病性、抗除草剂、雄性不育、生根性、耐寒、耐旱、耐盐、及木质和生长速度的改变等。转入的遗传物质可以与靶植物的基因组同源或异源。
在本发明中也考虑了由本发明方法得到的植物、植物材料及源于遗传修饰植物的植物产品。植物包括由本发明方法得到的小植株长成的成熟和不成熟植物，以及这些植物的后代和由这些植物材料繁殖而得的植物。植物材料包括这类植物的细胞或诸如种子、花、树皮、茎等的植物组织。植物产品包括所有源于这些植物材料的材料，如木材产品、木浆类产品等。
附图简述以下将参照附图叙述本发明的详细细节。有关本发明的文件至少包含一幅彩色附图。向专利和商标局要求和付款后可得到附有彩色图片本的专利复本。
图1A、1B和1C为实例4、5中得到桉属植物枝芽的GUS正染色结果。蓝色染色区显示枝条的转化区域。
图2显示实例6中桉属植物枝芽中外源DNA的稳定整合。泳道1为标准分子量DNA；泳道2为桉属植物蓝色枝芽DNA的PCR产物；泳道3为阳性对照质粒DNA的PCR产物。
优选实施方案叙述使用发明中的方法和材料，可将同源或异源遗传物质导入对靶植物基因组进行修饰。通过本发明中的方法可将编码某些特定多肽或特定多肽功能区的额外基因拷贝导入靶植物以提高目标多肽的表达水平，如参与生物合成途径的酶等。同样，也可将编码某些目的多肽或多肽功能区的反义基因拷贝导入细胞以改变目标多肽的水平。此外，通过控制编码诸如参与生物合成的各种酶等不同的多肽的基因的量，来调节每种合成多肽的相对量，从而得到具有修改组分的合成终产物。也可将多核苷酸的非编码区导入靶植物材料以控制特定多肽的表达，非编码区包括调节多核苷酸及编码调控因子的多核苷酸等，如转录因子、和/或转录因子的功能区、和/或这些调控因子的反义序列。另外，还有与这些物质类似的适合修饰靶植物材料基因组的遗传物质。许多其它的物质也可通过本方法被导入。
本发明中的方法优选靶植物的枝条培养物为起始材料。为得到微量繁殖的枝条培养物，取田间生长的幼年或成熟阶段的靶植物的嫩枝在灭菌培养基中进行表面灭菌，对灭菌后的枝条进行冲洗，再将它们移植至增殖或延伸培养基中。熟知的合适灭菌培养基如0.01％的氯化汞，反复冲洗的过程可使用灭菌蒸馏水。此外，微量繁殖的枝条培养物也可从林业公司得到。
根据优选的实施方案，离体微量繁殖的枝条培养物应在增殖培养基中生长一至数星期，优选为三星期。优选的增殖培养基包括完全的MS(Murashige和Skoog)培养基(Sigma公司，M5519)、蔗糖、苄氨基嘌呤(BA)和萘乙酸(NAA)。增殖培养基优选包含浓度为30g/l的蔗糖、0.1mg/l的BA及0.01mg/l的NAA的完全MS培养基。
接下来优选将枝条培养物转移至枝条延伸培养基中。枝条延伸培养基还含有额外的植物生长促进剂。如浓度约为1mg/l的赤霉酸。枝条培养物在枝条延伸培养基中培养的时间优选为最少三星期，更优选为四到六星期。优选将枝条培养物每二到四星期继代培养至新鲜培养基中，并优选在转化前二到三星期将枝条培养基移植至新鲜培养基中。靶植物材料的枝条在被转化导入期望的遗传物质前，生长长度优选为1-8厘米，更优选为3-4厘米。
除特别说明外，离体细胞培养优选条件包括使用白色荧光冷光源得到的16小时的光周期及20℃的培养温度。培养优选采用培养皿，每个培养皿中优选水平放置多个枝条。
转化至靶植物材料的遗传物质包括一个或多个遗传构建体和一个报道构建体，遗传构建体包含一个或多个期望被导入靶植物材料的多核苷酸。被导入靶植物材料的遗传构建体可能包含与靶植物材料同源和/或异源的遗传物质，也可能包含编码一种多肽或多肽的一个功能区的多核苷酸、编码调控因子如转录因子的多核苷酸、非编码的多核苷酸如调控多核苷酸及抑制特定多肽表达的反义多核苷酸。遗传构建体也可能另外包括一个或多个调控元件，如一个或多个启动子。优选在靶植物中有功能的遗传构建体。
根据一个实施方案，与本发明相关的一个遗传构建体包含一个开放阅读框架，编码靶植物的至少一个目标多肽的一个功能区。目标多肽可能是一种结构或功能多肽或诸如转录因子的调控多肽。这里用到的多肽“功能区”是指含有对影响代谢步骤必要的活性位点的部位，即分子中能够结合一个或多个反应物或能够提高或调控反应速度的区域。活性部位可能由一条或多条多肽链上的独立部分组成并且一般具有底物特异性。
本发明中的靶植物可被转入多于一个的遗传构建体，以此控制生物合成途径中多于一个的多肽的活性，影响多于一个的组织的活动或在多于一个的表达时间影响活性。同样一个遗传构建体也可以含有多于一个的编码多肽的开放阅读框架或多于一个的基因非编码区。
这里使用的“多核苷酸”是指核苷酸的多聚物，包括DNA和对应RNA分子，包括有义的和反义的链，并包括cDNA、基因组DNA和重组DNA，以及全部或部分合成的多核苷酸。多核苷酸可以是整个基因或其任意部分。可操作的反义多核苷酸可包括对应的多核苷酸的一个片段，“多核苷酸”的定义包括所有这样的可操作反义片段。
对基因组DNA和异源种类DNA的鉴定可通过标准的DNA/DNA杂交技术来完成，在适当的严格条件下，以全部或部分cDNA序列作为探针来筛选适当的文库。另外，运用根据已知基因组DNA、cDNA和蛋白序列设计的寡聚核苷酸引物的PCR技术也可用来对基因组DNA和cDNA进行扩增及鉴定。使用常规合成方法可以得到对应鉴定的序列和变种的DNA。这里用到的多核苷酸与本领域中使用的术语相同，是被分离和纯化了的。这里用到的目标多核苷酸是指与靶植物基因组同源或异源并改变了靶植物基因组的多核苷酸。
这里用到的名词“多肽”包括任意长度的氨基酸链，包括全长的蛋白，其中的氨基酸残基由共价肽键连接。
当遗传构建体包含多肽的编码区时，该遗传构建体也进一步包含连在被转录多核苷酸上的一个基因启动子序列和一个基因终止序列。基因启动子序列一般位于被转录多核苷酸5’端，用于引发多核苷酸的转录。启动子序列一般位于基因的5’非编码区，但它们有时也出现在内含子或编码区中。当构建体包含一个有义方向的开放阅读框架时，基因启动子序列也引发该开放阅读框架的翻译。当遗传构建体包含一个反义方向的开放阅读框架或一个非编码区时，基因启动子序列可能包含一个带有RNA聚合酶结合部位的转录起始位点。
在本领域中有各种熟知的可被用于本发明中的遗传构建体的基因启动子序列。启动子基因序列以及基因终止序列如启动子序列可能是靶植物宿主的内源或外源序列，只要该启动子在靶植物中有功能即可。如启动子及终止序列可能来源于其它植物种类、植物病毒、细菌质粒等。
影响启动子选择的因子包括欲导入构建体的组织特异性及转录和翻译的时间选择。例如，组成型启动子，如花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)，会影响植物所有部分的多肽活性。使用组织特异性启动子则只会在目标组织中产生期望的有义或反义RNA。在遗传构建体中使用诱导型基因启动子序列，则可通过外来的诸如光、热、厌氧压力及营养条件的改变等刺激来调节RNA聚合酶的结合和起始转录速率。使用时序调控的启动子可以在转化细胞发育的某个特定阶段调节RNA聚合酶的结合和起始转录速率。优选使用被讨论的酶基因的原始启动子或欲被转化的生物体，如桉属或松属，中的特异性的靶组织的基因启动子。可被用于本发明中的其它基因启动子的例子包括甘露碱合酶(mas)、章鱼碱合酶(ocs)及其它在Chua等人的综述(Sciences，244174-181，1981)中提到的启动子。也可用启动子的多拷贝或多个启动子选择性地刺激包括部分遗传构建体的多核苷酸的表达。
位于被转录多核苷酸3’端的基因终止序列可能与基因启动子序列来自于同一基因或来自不同基因。本领域中许多熟知的终止序列可被用于本发明中，如根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中胭脂碱合酶的3’端。但是优选的基因终止序列来自于原始多肽的基因或来自于转化的靶植物种类。
本发明中的遗传构建体中也包含一个报道基因或选择标记，用于靶植物细胞中含有遗传构建体的转化细胞的有效检测。在本领域中熟知的这类报道基因或选择标志一般都带有对一种或多种毒素的抗性。一种在转化的植物组织中但不在细菌细胞中表达β-D-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的嵌合基因是一种优选的可被用于本发明方法的选择标记。Janssen和Gardner在Plant Molecular Biology1461-72，1981中描述的构建的二元载体pKIWI105是特别优选的选择标记。可对优选的选择标记进行修饰以提供多拷贝的目的启动子，如花椰菜花叶病毒355启动子。表达GUS的植物材料具有对诸如卡那霉素等的抗生素的抗性。另一种合适的选择标记是nptII基因，它的表达可以提供对卡那霉素或潮霉素这些在一般中度浓度下对植物细胞有毒性的抗生素的抗性(Rogers等，Weissbach A and Weissbach Heds.，Methods forPlant Molecular Biology，Academit Press Inc.圣地亚哥，加利福尼亚州)。此外，也可用本领域中的其它熟知的技术来确定转化细胞中期望的构建体的导入，如DNA印迹和蛋白质印迹法等。
用于操作导入植物材料的遗传构建体中元件的连接的技术在本领域中为人熟知，该技术包括含有一个或多个限制性内切酶位点的合成接头的使用，如在Sambrook等(分子克隆实验室指南，CSHL Press，冷泉港，纽约，1989)。在本发明的方法中使用的遗传构建体可被连接至含有至少一个诸如大肠杆菌(E.coli)的复制系统的载体中，由此在每一次操作后，得到的构建体被克隆和测序，操作的准确性也被确定。
以扩增期望多肽为目的的应用中，可在遗传构建体中以有义方向插入编码目标多肽的开放阅读框架或编码调节目标多肽的表达的调控因子的多核苷酸，这样靶植物中遗传构建体的导入会导致该基因拷贝数量的增多或该基因表达的增多及由此而来的多肽的增多。当需要对多肽进行负调控时，可在遗传构建体中以反义方向插入编码该多肽的开放阅读框架，这样由该多核苷酸转录得到的RNA与内源的mRNA序列互补。因此造成该基因拷贝的减少而导致该酶数量的减少。另外，也可通过插入编码诸如启动子或转录因子的调控元件的多核苷酸来进行调节，以调控编码目标多肽的多核苷酸的表达。
在另一实施方案中，用于转化靶植物材料的遗传构建体可能包含含有编码目标多肽基因的非编码区的核苷酸序列或与该非编码区互补的核苷酸序列。在这里使用的名词“非编码区”包括未被翻译的转录序列和位于翻译序列或开放阅读框架3’或5’区2000个碱基对内的非转录序列。可能在本发明构建体中被使用的非编码区的例子包括内含子和5’非编码前导序列。对靶植物进行这样的遗传构建体的转化可能导致由于共抑制作用而引起的植物中被选择的多肽的合成量减少的情况，如与Napoli等(Plant Cell2279-290，1990)和de Niebel等(Plant Cell7347-358，1995)所讨论的情况类似。
使用本发明的方法可将遗传构建体转入多种植物中，包括单子叶植物(例如禾本科植物、玉米、谷类、燕麦、小麦和大麦)，双子叶植物(例如拟南芥(Arabidopsis)、烟草、豆类、苜蓿、橡树、桉树、枫树)及裸子植物(如苏格兰松(Aronen，Finnish Forest Res.Papers，卷595，1996)，白云杉(Ellis等，Biotechnology1184-89，1993)和落叶松(Huang等，In vitro Cell27201-207，1991))。在优选实施方案中，遗传构建体被转入“木本植物”，木本植物在这里定义为茎生长多年且茎的直径每年都因新生木质组织而增加的乔木或灌木。优选从由桉属和松属物种中选择靶植物，最优选从Eucalyptus grandis和Pinus radiate中选择靶植物。
在本领域中稳定的将遗传构建体导入靶植物基因组的技术为人熟知，包括农杆菌介导的引入、电穿孔、原生质体融合、生殖器官的注射、未成熟胚胎的注射，高速发射引入等。技术的选择取决于欲转化的靶植物。例如，双子叶植物和某些单子叶及裸子植物可使用例如Bevan(Necleic Acids Res.128711-8721，1984)中所叙述的农杆菌Ti质粒技术，本发明中遗传构建体转化的目标包括组织，如叶组织、分散的细胞、原生质体、种子、胚胎、分生区、子叶、下胚轴等。本发明的方法中优选的转化靶植物材料包括用上文中提到的方法离体微量繁殖得到的枝条培养物。
优选使用农杆菌介导的转化技术将一个或多个遗传构建体转入靶植物枝条。有许多非常适用于该技术并且可以通过商用途径得到的农杆菌菌株。可获得根癌农杆菌AGL1菌株(Biotechnology9963-967，1991)，并且它也是一种优选的农杆菌菌株。带有遗传构建体的农杆菌菌株种群的转化方法众所周知。在An等人的“二元载体”，GlevinSB and Schilperoort RA eds，Plant Molecular Biology Manual，DordrechtKluwer Academic Publisher，pp。A3/1-A3/19，1998，中提到的冻融法是一种优选的将目标遗传构建体导入农杆菌培养物的转化方法。
根据优选实施方案，使用以下技术对带有目标遗传构建体的农杆菌菌落进行准备以对靶植物材料进行接种。令农杆菌菌落在诸如YEP培养基的生长培养基上进行培养，YEP培养基包含酵母提取物、蛋白胨和氯化钠。根据特别的优选实施方案，生长培养基包含浓度为20g/l的酵母抽提物、浓度为20g/l的蛋白胨和浓度为10g/l的氯化钠。在平板中挑取单菌落至含有对应选择标记的选择剂的培养基中进行培养。合适的选择剂包括抗生素等。在一个特别的使用带有包含嵌合的GUS基因的遗传构建体的转化农杆菌培养物的优选实施方案中，选择剂为卡那霉素。优选令选择的农杆菌菌落生长于含有卡那霉素和利福平的YEP培养基中。优选的培养基含有100mg/l的卡那霉素和50mg/l的利福平。将培养物置于29℃快速振荡培养数小时。接下来将培养物离心，漂洗，然后在诸如含浓度为50μM的乙酰丁香酮的MS培养基的培养基中重悬浮。优选将接种物调节至OD600值大约为0.15，并将接种物在接种前置于摇床上于29℃培养数小时。
选择用上文所述的方法得到的靶植物材料的成熟枝条进行转化。切下每个节上的茎节，在本发明的方法中优选使用第二和第三个节上切下的茎节。优选从茎上削去所有的叶片，并对其进行额外的损伤以提高农杆菌接种的效能和效率。茎节的损伤部位优选为每个芽的分歧轴区附近如每个芽的分歧轴区的交界和周围部分。损伤使茎节表面细胞层下的细胞暴露出来，接触到外部供应的液体和气体。可以用针或其它的尖锐工具穿刺茎节的表面细胞层以进行损伤，或通过用解剖刀片等工具对茎节进行轻度的纵向切割或擦划的方法进行损伤。在一个优选实施方案中，使用预诱导的步骤，在损伤和农杆菌接种前，将靶植物节放入芽诱导培养基中，使其在损伤和接种前长出腋生枝。用通过上文所述的方法得到的农杆菌培养物对选出的茎节，优选包括第二和第三节，进行接种。
在最佳侵染条件下用农杆菌悬浮液对茎节进行接种。培养可在大约20℃摇床上持续至少二十分钟，更优选为大约三十分钟。根据一个优选实施方案，在接种过程中的至少一段时间内降低气压。也就是，在接种过程中将茎节和农杆菌悬浮液周围的压力降至低于周围标准气压的水平。真空的应用，例如在接种过程中至少一段时间内的使用，可以提高转化的效率。在接种过程中使用至少大约三分钟，优选至少大约五分钟使用真空可提高许多应用中的效率。此外，还有其它熟知的合适技术。
接种后，去掉多余的悬浮液并将茎节转移至共培养培养基(co-cultivatin medium)中。合适的共培养培养基包括含约0.4％葡萄糖的MS培养基。在一个优选实施方案中，在共培养培养基中加入了酚类化合物，如浓度为1μM，优选为5μM的乙酰丁香酮。也可以额外或另外加入其它结构和/或功能类似的酚类化合物。根据另一实施方案中，在接种后使用芽诱导培养基代替上述的共培养培养基。合适及优选的芽培养基优选包括下文描述的含蔗糖、BA和NAA的MS培养基。共培养优选在三天的共培养过程中进行，其间茎节外植体被水平的放置于培养基的表面。
在共培养期后，将茎节由培养基中移出并进行漂洗。优选的漂洗培养基包括含timentin的MS培养基。优选timentin浓度为250mg/l。接下来优选垂直的将茎节在第一选择培养基中进行培养。第一选择培养基优选包含MS培养基、碳源、细胞分裂素和/或生长素，timentin和选择剂。合适的碳源包括浓度约为5至100g/l的蔗糖和/或葡萄糖。优选的碳源为浓度大于2％优选为大约3％的蔗糖。合适的细胞分裂素包括浓度约为0.1至10mg/l的BA、二甲代烯丙基氨基嘌呤(2iP，Dimethylallylaminopurine)、激动素(K)和玉米素(Z)。合适的生长素包括浓度约为0.001到1mg/l的NAA、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。优选的timentin浓度为250mg/l。优选的选择剂为浓度为50mg/l的卡那霉素。选择剂的选择和浓度取决于引入的遗传构建体中的选择标记。第一选择培养基的pH优选调至约5到6。将茎节每星期在新鲜培养基继代培养持续4到5星期至由茎节上长出不定枝。
由茎节上剪下推定的转化不定枝并将它们转移至枝条延伸培养基或第二选择培养基中。优选的枝条延伸培养基包括含浓度约为30g/l的蔗糖、约0.1mg/l的BA、约0.01mg/l的NAA和约1mg/l的赤霉酸及选择剂浓度高于第一选择培养基的完全的MS培养基。选择剂的选择和浓度取决于遗传构建体中的选择标记。第二选择培养基中的卡那霉素浓度优选为大于50mg/l。卡那霉素的浓度特别优选为100mg/l。遗传霉素及新霉素也是合适的选择剂。枝条延伸培养基或第二选择培养基也优选包含浓度约为250mg/l的timentin。也可用枝条茎节的GUS染色法清除嵌合枝条。取推定转化枝条的基节部分的横截面并用Stomp，“β-D-葡糖醛酸糖苷酶的组织化学定位”，GUS Protocolsusing the GUS gene as a reporter of gene expression，pp。103-113，1992，中的方法进行GUS过夜染色。为保证全部除去嵌合的转基因植物，只选用100％GUS染色的枝条进行小植株发育。
将转化的枝条移入适当的生根培养基中。优选的生根培养基包括含浓度约为1mg/l的IBA、包括诸如浓度约为100mg/l的卡那霉素的选择剂和浓度约为250mg/l的timentin的Gamborg培养基(SigmaG5893)或Knop培养基(Konp，Landw。Versuchs.Stat。793-107，1865)。生根需要大约2到4个星期来完成，并可令培养起始期在黑暗中进行以开始根的发育，随后再转入标准的光周期条件。在延伸和生根过程中可将外植体移植至较大的培养容器如Magenta盒等中。将生根后的枝条或小植株移植至生长培养基中至长成成熟的遗传修饰植物。通过这里公开的方法得到的遗传修饰植物可以被繁殖，如通过诸如腋芽增殖技术的标准无性繁殖技术进行繁殖。
在下文中为举例而非限制提供了一些实例。实例1和3叙述了有关桉属植物转化的再生和转化方案最优化的实验。所有提到的茎节的不定芽诱导由E.Grandis x niten克隆910.59(Fletcher ChanllengeForests公司，新西兰)培养物离体微量繁殖得到。除非特别说明，所有实例中的组织培养条件为20℃，由白色荧光冷光源得到的16小时光周期。这些组织培养条件一般是优选的。所有的培养物置于20×100mm的培养皿中，每皿10个茎节。
植物材料所有的植物材料由Te Teko实验室，Fletcher ChallengeForests Ltd.，新西兰，提供。E.grandis X E.Nitens克隆910.59，910.62和910.64由在增殖培养基(完全MS培养基，30g/l蔗糖，0.1mg/l BA及0.01mg/l NAA)上生长3星期，再移植至延伸培养基(完全MS培养基，30g/l蔗糖，0.1mg/lBA及0.01mg/l NAA)生长4到6星期的离体微量繁殖枝条培养物得到。
农杆菌构建体二元载体pKIWI的构建见Janssen和Garner的PlantMolecular Biology 1461-72，1989。该构建体含有一个表达β-D-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的嵌合基因，由于该GUS基因缺少细菌核糖体的结合位点，所以它只能在转化的植物组织中而不能在细菌细胞中表达。用冻融法将双元质粒载体pKIWI导入根瘤农杆菌菌株AGL1(Biotechnology9936-967,1991)中，冻融法内容见An等的“二元载体”，Gelvin SB and Schilperoort RA，eds.，Plant MolecularBiology Manual，DordrechtKluwer Acdemic Publishers，pp.A3/1-A3/19，1998。
转化用农杆菌的制备将带有pKIWI105的农杆菌菌株AGL1菌落在YEP培养基(酵母抽提物20g，蛋白胨20g，NaCl10g)上培养2-3天。从平板上挑取单菌落至含5ml YEP培养基的培养管中，YEP培养基中加入100mg/l卡那霉素及50mg/l利福平。将培养物于29℃温育剧烈振荡培养。将农杆菌培养物于3000g离心20分钟，以YEP重悬浮培养物，再将培养物漂洗3次。以加入50μM乙酰丁香酮的1/10灭菌MS培养基重悬浮细胞，并调OD600值至0.15左右。接种前将培养物于29℃在摇床上培养3到4小时。
转化用植物材料的准备在增殖培养基(完全MS培养基，30g/l蔗糖，0.1mg/l BA，0.1mg/lNAA)上将离体枝条培养物继代培养3星期，再转至枝条延伸培养基(完全MS培养基，30g/l蔗糖，0.1mg/l BA，0.01mg/l NAA，1mg/l赤霉酸)上培养4到6星期。转化前2-3星期将所有培养物转至新鲜培养基上进行培养。
选择长为3-4cm的成熟枝条。为得到最好的不定芽诱导效果，只使用第二和第三节上的茎节。削下并去掉所有的叶。用解剖刀片在茎节的两侧进行轻度纵向的额外损伤。仔细地切下枝条的第二和第三个节并将它们放入含农杆菌悬浮液的锥形瓶中。
外植体的农杆菌接种及推定的转基因枝条再生将茎节与用上文所述的方法得到的农杆菌悬浮液于20℃100rpm的摇床上培养30分钟。温育后，用无菌绵纸将多余的悬浮液吸干，再将茎节移植至共培养培养基(含0.4％葡萄糖的MS培养基)上。在3天的共培养培养时间中，将所有的外植体水平放置在培养基表面进行培养。共培养后，将所有茎节从培养基上取下，用含250g/l timentin的MS培养基洗涤3次，每次5分钟。洗涤后，将茎节垂直培养于选择培养基(MS＋3％蔗糖＋细胞分裂素和生长素＋250mg/l timetin＋50mg/l卡那霉素)上。除卡那霉素外，也可使用被称为遗传霉素或新霉素的G-418对转化组织进行选择。也可使用其它对应表达载体中选择标记的选择剂。前4周每周将茎节在新鲜培养基上进行继代培养一次至茎节上长出不定芽。
稳定转化枝条的选择由茎节上切下推定的转化不定枝条。将所有的枝条移植至延伸培养基(MS培养基，30g/l蔗糖，0.1mg/l BA，0.01mg/l NAA，1mg/l赤霉酸，100mg/l卡那霉素，250mg/l timentin)中培养2到4周。使用加大了卡那霉素浓度的第二步选择培养基以进一步清除可能逃脱了第一步低浓度卡那霉素选择过程的嵌合枝条。使用枝条茎节的GUS染色法以进一步清除嵌合枝条。取推定转化枝条的基节部分横截面用GUS过夜染色(“β-D-葡糖醛酸糖苷酶的组织化学定位”，GUSProtocolsusing the GUS gene as a reporter of geneexpression，pp。103-113,1992)。GUS在茎部分的分布图形的仔细分析显示了稳定转化的枝条(整个茎部分全被染成蓝色)对部分蓝色和未被染色的枝条。为保证得到100％的非嵌合转基因植物，只选用100％GUS染色的枝条进行小植株发育。
实例1本实验的目的是为确定诱导不定芽的茎节的最佳生长时期。使用的基础培养基为含30g/l蔗糖的完全的Murashige和Skoog(MS)培养基(Sigma M5519)。检验不同生长时期的茎节(顶节、第一、二、三、四节)和不同浓度苄氨基嘌呤(BA-1、2和3mg/l)的组合。所有的培养基中都含有0.01mg/l的萘乙酸(NAA)。
将离体培养3-4cm长的枝条切成单结节。在培养前预先去掉所有的叶片。每次处理培养约二十个外植体。每3星期将培养物移植至新鲜培养基。培养5周后对不定芽的发育进行评估。以下列出每组处理中外植体上不定枝条的形成率。
茎节的生长时期 BA浓度1mg/l 2mg/l 3mg/l枝条顶芽 25％(5/20)5％(1/20) 33％(7/20)第一节 57％(12/21) 35％(7/20)20％(4/20)第二节 76％(16/21) 12％(6/20)20％(4/20)第三节 75％(15/20) 15％(3/20)15％(3/20)第四节 45％(9/20)38％(8/21)10％(2/20)为从茎节诱导得到最大数量的不定芽，在下面的转化实验中只选用第二和第三节在含30g/1蔗糖、1mg/1 BA和0.01mg/l NAA的MS培养基上培养4周。
实例2本实验的目的是为确定用于选择转化芽组织的卡那霉素的最佳浓度。按实例1结尾处所述将外植体在浓度为0,5,10,25,50或100mg/l的卡那霉素中进行培养。将离体培养3-4cm长的枝条切成单结节，选用适当的节。在培养前预先去掉所有的叶片。每次处理培养约三十个外植体。培养3星期后将培养物移植至新鲜培养基。培养5周后测定不定芽抑制的百分比。卡那霉素浓度形成不定芽的茎节的％与对照组相比芽的抑制％0mg/l 80％(24/80)0％5mg/l 64％(18/28)20％10mg/l47％(14/30)41％25mg/l33％(10/30)59％50mg/l15％(14/31)81％100mg/l 3％(1/30) 96％
使用100mg/l的卡那霉素得到最高程度的芽抑制作用。使用低浓度(25-50mg/l)进行转化不定芽的起始选择。在下面的转化枝条选择中，使用100mg/l的卡那霉素对嵌合枝条进行有效选择。
实例3本实验的目的是为确定在农杆菌感染前使用细胞分裂素对茎节进行预处理是否能提高转化效率。在农杆菌侵染前，在芽诱导培养基(含30g/l蔗糖，1mg/l BA，0.01mg/l NAA的MS培养基)上对第二和第三结节进行预培养0,1,2,4，或7天。
将离体培养3-4cm长的枝条切成单结节。每次处理至少使用50个结节(第二和第三节)。每3星期将培养物移植至新鲜培养基。对所有组织进行染色检验GUS活性(Stomp，“β-D-葡糖醛酸糖苷酶的组织化学定位”，GUS Protocol susing the GUS gene as a reporter ofgene expression，pp。103-113，1992)作为转化的指示。细胞分裂素 全部外植体 全部外植体的芽预处理的时间GUS阳性的％ 的GUS阳性％0天 9％(10/109) 4％(4/109)1天 3％(2/73) 0％3天 5％(3/60) 0％4天 5％(3/60) 0％7天 4％(2/53) 0％以上结果显示用细胞分裂素对外植体进行预处理没有提高转化效率。事实上，在农杆菌侵染后，外植体呈现棕色。在下面的转化实验中，除非特别说明，茎节切下后立即就用来进行农杆菌的侵染。
实例4以下是根据上述实例得到的优选转化和再生方案。
离体微量繁殖母株的准备每3-4周在延伸培养基上进行定期继代培养。
持续时间＝3-4周转化用农杆菌的准备准备新鲜农杆菌培养物，将过夜培养物离心，在加有50μM乙酰丁香酮的1/10灭菌MS培养基中培养3-4小时至0D600为0.3-0.5。
持续时间＝2天。
转化用植物材料的准备选择培养于枝条延伸培养基(含30g/l蔗糖，0.1mg/l BA，0.1mg/lNAA和1mg/l赤霉酸＝GA3的MS培养基)中的3-4cm高的延伸枝条。
持续时间＝连续农杆菌对外植体的接种将茎节与农杆菌悬浮液于20℃摇床(100rpm)上温育30分钟。移植茎节至共培养培养基。
持续时间＝3天。
推定转化不定芽的诱导在摇床上用含250mg/l timentin的MS培养基漂洗外植体3×5分钟。漂洗后，于芽诱导/选择培养基(含30g/l蔗糖，1mg/l BA，0.01mg/l NAA，50mg/l卡那霉素和250mg/l timentin的MS培养基)上对茎节进行培养。每周在新鲜培养基上继代培养。
持续时间＝3-4周。
推定转基因枝条的再生切下所有推定的转化不定枝并移植至枝条延伸培养基(含30g/l蔗糖，0.1mg/l BA，0.01mg/l NAA，1mg/l GA3，100mg/l卡那霉素和250mg/l timentin的MS培养基)。
持续时间＝4-6周。
转基因植物的获得选择全部GUS染色阳性的枝条并移植至生根培养基(含1mg/l吲哚-3-丁酸＝IBA，100mg/l卡那霉素和250mg/l timentin的Gamborg或Knop培养基)中。
持续时间＝2-4周转化和再生的总持续时间为大约10-15周。
实例5转化组织中的转基因表达以下是根据实例4所描述的桉属外植体获得、纵向损伤和农杆菌侵染的基本方案，其中与实例4不同的是农杆菌菌株AGL1带有的pKIWI105质粒由额外的第二个花椰菜花叶病毒35S启动子片段(位置-89至291)修饰以产生控制报道GUS基因的双35S启动子。共培养后，在芽诱导/选择培养基上培养外植体至少4-5周，之后将外植体从培养中移出进行染色以检测GUS活性(Stomp，“β-D-葡糖醛酸糖苷酶的组织化学定位”，GUS Protocols，use the GUS gene as a reporterof gene expression，pp.103-113，1992)。图1所示为蓝色染色(GUS-阳性)的枝芽。蓝色染色区显示了枝条的转化。
实例6DNA稳定整合的PCR检测除GUS染色法外，也可用基因组DNA作为模板以聚合酶链式反应(PCR)方法对外源DNA在植物DNA的稳定整合进行确定。根据标准方案用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)从桉属植物染成蓝色的枝芽中分离DNA。
以蓝色枝芽中提取的基因组DNA作为模板用35S-GUS-1F(序列标识号1)和35S-GUS-2R(序列标识号2)为引物进行PCR。循环条件为94℃-1分钟(1个循环)；94℃-1分钟，55℃-1分钟，72℃-1分钟(35个循环)；72℃-5分钟(1个循环)。以含有导入基因构建体的质粒DNA为阳性对照。用琼脂糖电泳分离DNA片段，见图2。
图2泳道2中蓝色枝芽DNA的PCR产物与由对照质粒DNA得到的预期条带(泳道3)大小一致，说明已将引入的DNA转化至桉属植物的DNA。用蓝色枝条DNA和农杆菌virG基因引物得到的PCR结果为阴性，说明污染的细菌DNA未出现于桉属植物的DNA样品中。
实例7转化过程中外植体接种/侵染方案的修改用实例4中的方法得到桉属植物的节，再用灭菌的301/2号针在每个芽的分歧轴区交界和周围部分的至少外层细胞层进行穿刺损伤。损伤后用实例5中的方法用含双35S-GUS构建体的农杆菌对外植体进行侵染，随后不加选择的在芽诱导培养基上共培养。共培养后，将外植体移植至芽诱导/选择培养基上进一步生长和发育。侵染后4-5周之后用实例5中的方法对外植体进行GUS活性的染色。
处理 芽中GUS-阳性的外植体的％非转化对照 0％用针损伤后 9％以上结果说明用针损伤及用芽诱导培养基的共培养产生了转化的枝芽。
将桉属植物的节不进行选择的置于芽诱导培养基上培养7天，以长出一些腋生枝。之后用解剖刀片或针对每个腋生枝的基部(在所有叶片以下)进行损伤，再用实例5中的方法将外植体置于农杆菌悬浮液中。另外，在将外植体放入细菌溶液后，用真空泵对外植体抽真空7分钟，接下来用实例5中的方法在加有0.4％葡萄糖的MS培养基上进行共培养，再置于芽诱导/选择培养基上生长。侵染后4-5周之后用实例5中的方法对外植体进行GUS活性的染色。
处理 芽中GUS-阳性的外植体的％非转化对照 0％解剖刀片损伤＋真空处理 5％以上结果说明对预诱导的桉属植物节的腋生枝进行损伤可以作为一种农杆菌侵染和转化靶外植体组织的方法。
实例8在共培养培养基中加入乙酰丁香酮对转化的影响测试在共培养培养基中加入一种酚类化合物乙酰丁香酮的效果。用实例5中的方法用含有35S-GUS构建体的农杆菌侵染桉属植物的节，再用实例5中的方法将其于含乙酰丁香酮的加入了0.4％葡萄糖的MS培养基上进行共培养。共培养后，将外植体移至芽诱导/选择培养基上进一步生长。侵染后4-5周之后用实例5中的方法对外植体进行GUS活性的染色。共培养处理(乙酰丁香酮)芽中GUS-阳性的外植体的％0μM 5％5μM 8％以上结果说明在共培养培养基中加入5μM乙酰丁香酮提高了转化效率。
测试以芽诱导培养基替代包含加入0.4％葡萄糖的MS培养基的共培养培养基的效果。用实例5中的方法得到的桉属植物节部分进行农杆菌侵染。侵染过程中，使用7分钟的真空条件侵染外植体。在共培养阶段将外植体置于加入0.4％葡萄糖的MS培养基或不加选择剂的芽诱导培养基中，再用实例5中的方法于芽诱导/选择培养基上进行培养。侵染后4-5周之后用实例5中的方法对外植体进行GUS活性的染色。
共培养处理 芽中GUS-阳性的外植体的％MS＋0.4％葡萄糖 5％芽诱导培养基8％以上结果说明在共培养阶段使用芽诱导培养基提高了转化效率。
实例9
以下是根据上述实例得到的替代优选转化和再生方案。
离体微量繁殖母株的准备每3-4周在延伸培养基上进行定期继代培养。
持续时间＝3-4周转化用农杆菌的准备准备新鲜农杆菌培养物，将过夜培养物离心，在加有50μM乙酰丁香酮的1/10灭菌MS培养基中培养3-4小时至0D600为0.3-0.5。
持续时间＝2天转化用植物材料的准备选择培养于枝条延伸培养基(含30g/l蔗糖，0.1mg/l BA，0.01mg/l NAA和1mg/l赤霉酸＝GA3的MS培养基)中的3-4cm高的延伸枝条。将枝条切成单节茎节。优选第二和第三节进行接种。任选的，将单节茎节置于芽诱导培养基培养至少3-4天以刺激一些腋生枝的生长。
持续时间＝连续农杆菌对外植体的接种去掉单节茎节上的所有叶片并用穿刺的方法对在每个芽的分歧轴区交界和周围部分的至少外层细胞层进行损伤。将茎节与农杆菌悬浮液于20℃摇床(100rpm)上温育30分钟。在接种阶段的至少一段时间内使用真空。移植茎节至任选含有诸如乙酰丁香酮的酚类化合物的共培养培养基。
离体微量繁殖母株的准备每3-4周在延伸培养基上进行定期继代培养。
持续时间＝3-4周转化用农杆菌的准备准备新鲜农杆菌培养物，将过夜培养物离心，在加有50μM乙酰丁香酮的1/10灭菌MS培养基中培养3-4小时至0D600为0.3-0.5。
持续时间＝2天转化用植物材料的准备选择培养于枝条延伸培养基(含30g/l蔗糖，0.1mng/l BA，0.1mg/lNAA和1mg/l赤霉酸＝GA3的MS培养基)中的3-4cm高的延伸枝条。将枝条切成单节茎节。优选第二和第三节进行接种。任选的，将单茎节置于芽诱导培养基培养至少3-4天以刺激一些腋生枝的生长。
持续时间＝连续农杆菌对外植体的接种去掉单节茎节上的所有叶片并用穿刺的方法对在每个芽的分歧轴区交界和周围部分的至少外层细胞层进行损伤。将茎节与农杆菌悬浮液于20℃摇床(100rpm)上温育30分钟。在接种阶段的至少一段时间内使用真空。移植茎节至任选含有诸如乙酰丁香酮的酚类化合物的共培养培养基。
持续时间＝3-10天推定转化不定芽的诱导在摇床上用含250mg/l timentin的MS培养基漂洗外植体3×5分钟。漂洗后，于芽诱导/选择培养基(含30g/l蔗糖，1mg/l BA，0.01mg/l NAA，1mg/l GA3，50mg/l卡那霉素和250mg/l timentin的MS培养基)上对茎节进行培养。每周在新鲜培养基上继代培养。
持续时间＝4-5周推定转基因枝条的再生切下所有推定的转化不定枝并移植至枝条延伸培养基(含30g/l蔗糖，0.1mg/l GA，0.01mg/l NAA，1mg/l GA3,100mg/l卡那霉素和250mg/l timentin的MS培养基)。
持续时间＝4-6周转基因植物的获得
选择全部GUS染色阳性的枝条并移植至生根培养基(含1mg/l吲哚-3-丁酸＝IBA，100mg/l卡那霉素和250mg/l timentin的Gamborg或Knop培养基)中。
持续时间＝2-4周SEQ ID NOS序列1、2见所附的序列列表中。附件序列表中使用的核苷酸编码，包括符号“n”，符合WIPO标准ST.25(1998)，附录2，表1。在这里引用的参考材料，包括专利文献及非专利出版物，在此全部引为参考。虽然在前面的说明书中，在描述本发明时涉及到特定的优选实施方案，并给出了许多细节以做例证，但显然对于本领域的技术人员而言，本发明容许另外的实施方案且可以对本发明中的某些在这里被描述的细节做相当大的改动而不背离本发明中的基本原则。
序列表<110>Genesis Research&Development Corporation LimitedFletcher Challenge Forests Limited<120>获得遗传修饰植物的方法及通过此方法得到的植物材料和植物产品<130>24769MRB<140><141><150>US09/153,320<151>1998-09-15<150>US60/151,106<151>1999-08-27<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>实验室制造<400>1caaagatgta cccccaccca cga 23<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>实验室制造<400>2ggctttcttg taacgcgctt tccca 2权利要求
1.一种获得遗传修饰植物材料的方法，包括培养靶植物茎节；用遗传构建体转化茎节；引发由转化后茎节再生不定枝；和选择转化不定枝芽。
2.根据权利要求1的方法，其中靶植物为木本植物。
3.根据权利要求2的方法，其中靶植物选自桉属和松属植物种类。
4.根据权利要求1的方法，其中遗传构建体包含一个报道基因和一个期望被导入靶植物的多核苷酸。
5.根据权利要求1的方法，其中茎节来自于微量繁殖枝条培养物。
6.根据权利要求1的方法，其中靶植物茎节先用增殖培养基预处理再被移植至枝条延伸培养基中。
7.根据权利要求1的方法，其中茎节的转化包括携带转入遗传构建体的农杆菌培养物与茎节的温育。
8.根据权利要求7的方法，其中在与农杆菌一起温育前对茎节进行损伤。
9.根据权利要求1的方法，还包括在对转化的不定枝芽进行选择前从茎节上切下不定枝。
10.根据权利要求1的方法，其中遗传构建体包含一个带来对一种选择剂抗性的选择标记，该方法还另外包括将不定枝芽放入含第一种浓度选择剂的第一选择培养基中，再将在第一选择培养基中存活的不定枝芽放入含浓度大于第一种浓度的第二种浓度选择剂的第二选择培养基中的转化不定枝芽的选择。
11.根据权利要求10的方法，其中第一和第二选择培养基包含卡那霉素。
12.根据权利要求11的方法，其中第一选择培养基中卡那霉素的浓度小于或等于50mg/l，第二选择培养基中卡那霉素的浓度大于50mg/l。
13.根据权利要求1的方法，其中遗传构建体中包含同源于靶植物基因组的遗传物质。
14.根据权利要求1的方法，其中遗传构建体中包含异源于靶植物基因组的遗传物质。
15.根据权利要求1的方法，其中遗传构建体中包含影响靶植物的以下表型性质的遗传物质抗虫性、抗病性、抗除草剂、不育、生根性、温度耐受性、耐旱性、耐盐性、木质及生长速度。
16.根据权利要求1的方法，其中遗传构建体包含编码目标多肽或目标多肽功能区的遗传物质。
17.根据权利要求1的方法，其中遗传构建体包含编码目标多肽或目标多肽功能区的基因或基因部分的反义拷贝。
18.根据权利要求7的方法，还包括在茎节与农杆菌培养物温育阶段，将茎节置于减压大气中。
19.根据权利要求1的方法，其中遗传构建体包含至少一个启动子区。
20.根据权利要求1的方法，其中遗传构建体包含多于一个的启动子区。
21.根据权利要求1的方法，还包括转化前腋生枝生长的引发。
22.根据权利要求1的方法，还包括将转化后的不定枝芽移植至生根培养基及形成小植株。
23.根据权利要求22的方法，还包括将小植株移植至种植培养基及栽培小植株形成成熟的遗传修饰植物。
24.根据权利要求23的方法获得的遗传修饰植物。
25.来自权利要求24中遗传修饰植物的植物材料和植物。
26.来自权利要求24中遗传修饰植物的植物产品。
27.根据权利要求1的方法获得的遗传修饰植物材料。
全文摘要
获取遗传修饰植物,尤指木本植物,特别是桉属(Eucalyptus)及松属(Pinus)植物的方法,包括用期望的遗传构建体对靶植物材料进行转化和使用不定枝芽体系对转化植物材料进行再生。本方法具有高转化效率并显著减少了转化及再生方案的持续时间。用农杆菌介导的技术对靶植物的茎节进行转化,并对农杆菌侵染的茎节进行不定枝芽的再生。另有优选的培养用培养基,包括选择培养基,以及改进的植物培养技术。
文档编号C12N5/10GK1326510SQ99813210
公开日2001年12月12日 申请日期1999年9月15日 优先权日1998年9月15日
发明者B·弗林, K·T·奇尔 申请人:吉尼西斯研究及发展有限公司, 弗莱彻·查仁茨·福雷斯特斯有限公司