专利名称：万古烯霉素、其生产方法及其作为药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及可以通过微生物HIL-006734(DSM12216)的培养而获得的名为万古烯霉素(Vancoresmycin)的化合物、及其药学上可接受的盐和衍生物。本发明进一步涉及万古烯霉素的生产方法、微生物HIL-006734(DSM12216)、万古烯霉素及其药学上可接受的盐和衍生物作为药物、特别是作为抗生素的用途、以及包含万古烯霉素或其药学上可接受的盐或衍生物的药物组合物。
甲氧西林耐受性金黄色葡萄球菌(MRSA)感染已知在若干感染性疾病中占主导地位，例如创伤和灼伤。万古霉素和替考拉宁属于糖肽类，是临床上仅有的两种用于MRSA感染治疗的抗生素。不过，由于最近出现了万古霉素和替考拉宁耐受性菌株，据报道这些感染变成威胁性的和致命性的。因此人们已经开始集中寻求一类结构上不同的、抗这些万古霉素和替考拉宁耐受性菌株的化合物。例如，早些时候描述过甲基硫霉素，这是一种环状硫肽(1996年7月11日提交的欧洲专利公报No.0818539)，作为抗万古霉素和替考拉宁耐受性菌株的抗生素。
现已发现，新颖的名为万古烯霉素的化合物具有抗生素活性。本发明因此涉及万古烯霉素，即下式化合物 及其药学上可接受的盐和衍生物，例如酯、醚和明显的化学等价物，包括所有立体异构形式和所有互变异构形式。
万古烯霉素的分子式为C71H126N2O21(MW1343.80)，可以具有下文给出的任意一种或多种其物理化学与光谱性质，例如其1H NMR光谱数据和其13C NMR光谱数据，都列在表2中。
可以形容万古烯霉素是新颖的抗万古霉素和替考拉宁耐受性菌株的抗生素。万古烯霉素具有迄今未曾报道过的新结构，即四酰胺酸(tetramic acid)部分在3-位携带酰基取代基，该取代基具有高度氧化的长链烷基，该烷基被氨基糖取代。通过在化学文摘中进行文献检索，确立万古烯霉素是一种新化合物。没有其它化合物表现万古烯霉素的结构特征。
万古烯霉素可以通过被称为第HIL-006734号培养物的微生物(以下称为HIL-006734)的培养而获得。这种用于生产万古烯霉素的微生物是从一种土壤样本中分离的，该土壤样本是从National Park,Borivli,Mumbai,India采集的。微生物HIL-006734属于放线菌目拟无枝酸菌属，已于1998年6月4日保藏于德国微生物与细胞培养物保藏中心(DSMZ:Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH),Braunschweig,Germany，已经给出入藏编号为DSM No.12216。
因此，本发明进一步提供了新颖的名为万古烯霉素的化合物的生产方法，该方法是将拟无枝酸菌属的HIL-006734种、其突变体和变体在需氧条件下、在含有一种或多种碳源与一种或多种氮源以及可选的营养性无机盐和/或微量元素的营养培养基中进行培养，然后分离所述化合物，按惯用方式纯化。
微生物ST101170的突变体和变体也能够合成根据本发明的化合物。这样的突变体可以是按已知方式生产的，包括物理方式，例如照射法，如紫外线或X射线，或者化学诱变剂，例如乙基甲磺酸(ethylmethylansulfonate,EMS)、2-羟基-4-甲氧基-二苯酮(MOB)或N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)。
可以生产本发明化合物的适当突变体和变体的筛选通过蓄积在培养肉汤中的化合物的生物学活性测定加以确认，例如试验其抗菌作用。
营养培养基优选地含有碳源、氮源和营养性无机盐。碳源例如淀粉、葡萄糖、蔗糖、糊精、果糖、糖蜜、甘油、乳糖或半乳糖，优选为淀粉。氮源例如大豆粉、花生粉、酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨、麦芽汁、玉米浆、明胶或酪蛋白氨基酸，优选为蛋白胨和酵母提取物。营养性无机盐例如磷酸氢钠、磷酸氢钾、氯化钠、氯化钙、碳酸钙、硝酸钾、硫酸铵或硫酸镁，优选为碳酸钙、氯化钠和硫酸镁。
HIL-006734的培养可以在25-35℃之间的温度下，在6.0与8.0之间的pH下进行。优选地，HIL-006734在30℃(±1℃)和pH7.0下培养。
HIL-006734的培养优选地进行60-96小时，此时获得本发明抗生素的最佳收率。特别优选的是在深层培养条件下发酵培养68-96小时，例如摇瓶内以及在实验室发酵罐内。发酵和生成万古烯霉素的过程可以通过高压液相色谱法(HPLC)加以检测，通过已知的微生物琼脂平板扩散测定法测量培养肉汤抗葡萄球菌和肠球菌的生物活性。优选的培养物是金黄色葡萄球菌3066，据文献报道它是甲氧西林(一种β-内酰胺类抗生素)耐受性菌株，以及屎肠球菌(屎肠球菌VR-1)，它对万古霉素是耐受性的。在所得培养肉汤中，万古烯霉素存在于培养物滤液以及菌丝体内，可以利用已知的分离工艺加以分离。因此，从培养物滤液中回收的方法可以是在pH5-8下用一种水不可混溶性溶剂提取，例如乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿或丁醇，或者在pH5-8下利用聚合树脂进行疏水作用色谱法，例如“Diaion HP-20”(Mitsubishi ChemicalIndustries Limited,Japan)、“Amberlite XAD”(Rohm and HassIndustries U.S.A.)、活性炭或离子交换色谱。优选的方法是用乙酸乙酯提取。活性物质也可以从菌丝体中回收，方法是在pH5-8下，用一种水可混溶性溶剂提取，例如甲醇、丙酮、乙腈、正丙醇或异丙醇，或者用一种水不可混溶性溶剂提取，例如乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿或丁醇，优选的方法是用乙酸乙酯提取。提取物的浓缩和冷冻干燥得到活性粗物质。
本发明的抗生素万古烯霉素例如可以如下从粗物质中回收利用任意下列工艺进行分级分离正相色谱法(采用矾土或硅胶作为固定相，洗脱剂例如石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、氯仿、甲醇或它们的组合，加入胺，例如NEt3)、反相色谱法(采用反相硅胶作为固定相，例如二甲基十八烷基甲硅烷基硅胶、也称RP-18，或二甲基辛基甲硅烷基硅胶、也称RP-8，洗脱剂例如水、缓冲液--即磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐(pH2-8)--和有机溶剂，例如甲醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃或这些溶剂的组合)、凝胶渗透色谱法(在诸如甲醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯或它们的组合等溶剂中采用树脂，例如SephadexLH-20(Pharmacia Chemical Industries,Sweden),TSKgelToyopearl HW(TosoHaas,Tosoh Corporation,Japan)，或者在水中采用Sephadex G-10和G-25)、或反流色谱法(采用一种两相洗脱系统，由两种或多种溶剂组成，例如水、甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、四氢呋喃、丙酮、乙腈、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、石油醚、苯和甲苯)。这些工艺可以重复使用，或者可以使用不同工艺的组合。优选的方法是反相硅胶(RP-18)色谱法。
化合物万古烯霉素可以转化为药学上可接受的盐和衍生物，例如酯和醚以及其它明显的化学等价物，它们都涵盖在本发明内。盐和衍生物可以通过本领域技术人员已知的标准操作加以制备。盐例如钠盐和钾盐，例如可以通过将万古烯霉素用适当的钠碱或钾碱处理加以制备。
酯和醚可以通过文献方法加以制备，例如《高等有机合成》第4版，J.March,John Wiley & Sons.,1992。
按照本领域技术人员已知的标准操作，糖部分的氨基例如可以用酰氯进行烷基化或乙酰化。
化学等价物可以是与金属离子所形成的稳定的配合物，例如过渡金属元素，象La3+、Sm3+、Eu3+、Gd3+，它们是典型的四酰胺酸衍生物，可以通过文献给出的方法加以制备(K.Tanaka等《化学与药学通报》1979,27,1901,K.Matsuo《化学与药学通报》1980,28,2494)。
烷基侧链的双键可以通过文献给出的方法加以还原，例如P.N.Rylander《氢化方法》第2章，Academic Press,New York(1985),或者可以通过文献所述方法加以氢卤化，如H.O.House《现代合成反应》W.A.Benjymin,Inc.,New York(1972),pp446-452。如文献所述，例如《化学评论》1980,80,187，通过双键与OsO4等试剂的反应可以制备羟基化衍生物。
也可以生成这样的衍生物，如《高等有机合成》第4版，J.March,John Wiley & Sons.,1992所述，例如用MCPBA进行氧化，使双键转化为环氧化物。
万古烯霉素具有抗菌活性。万古烯霉素抗多种细菌的最小抑菌浓度见下表3。万古烯霉素及其药学上可接受的盐和衍生物可以对动物给药，优选为哺乳动物，特别是人，给药形式为它们单独的药物、彼此的混合物和可进行肠胃外给药的药物组合物。因此，本发明也涉及用作药物的万古烯霉素及其药学上可接受的盐和衍生物，以及万古烯霉素及其药学上可接受的盐和衍生物在具有抗菌活性的药物制备中的用途。本发明进一步涉及药物组合物，该组合物含有有效量的万古烯霉素和/或一种或多种其药学上可接受的盐和/或衍生物，以及药学上可接受的载体。
万古烯霉素可以口服、肌内、静脉内或通过其它方式给药。含有万古烯霉素或其药学上可接受的盐或衍生物与其它药学上的活性物质的药物组合物可以这样制备，将活性化合物与一种或多种药理学上的耐受性助剂和/或赋形剂混合，例如填充剂、乳化剂、润滑剂、味道掩蔽剂、着色剂或缓冲物质，再将混合物制成适当的药物剂型，例如片剂、包衣片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉末剂、适合于肠胃外给药的乳剂、混悬液或溶液。
可以提到的助剂和/或赋形剂的实例是黄蓍胶、乳糖、滑石、琼脂、聚乙二醇、乙醇和水。适合于肠胃外给药并且为其所优选的是水悬液或水溶液。也可能将活性物质本身给药，不加入载体或稀释剂，适合的剂型例如胶囊剂。
习惯上，在具体情况下适用的盖伦制剂和给药方法以及剂量范围取决于所治疗物种的种类和各病症或疾病的状态，可以利用本领域已知的方法加以优化。一般来说，活性化合物对重约75kg的患者的每日剂量为最少0.001mg至最多10mg，优选为最多1.0mg。
下面是本发明的例证性实施例，但不限制其范围实施例1从土壤中分离HIL-006734号培养物a)营养性分离培养基的组成玉米淀粉 10.0g酪蛋白1.0g蛋白胨1.0g牛肉膏1.0gK2HPO4: 0.5g琼脂粉13.0g软化水1.0升pH: 7.5b)土壤平板接种和分离在250ml埃伦迈厄烧瓶内，将10g从National Park,Borivli,Mumbai,India采集的土壤加入到90ml无菌水中，在旋转摇动器(220rpm)上摇动2小时。将上述土壤悬液分10步连续稀释至10-5。从最后的稀释液中取1ml悬液，放置在无菌玻璃陪替氏平皿(直径15cm)中央，向其中倒入大约50ml上述分离培养基，培养基中补充有25μg/ml两性霉素B作为抗真菌剂，然后冷却至45℃，充分旋转平皿。土壤悬液与培养基的混合物沉降后，在28℃(±1℃)下培养7天。定期观察陪替氏平皿，从所生长的微生物中分离HIL-006734(培养物编号Y-9439786)。
实施例2HIL-006734号培养物的维持维持培养基的组成在下列培养基上维持HIL-006734麦芽汁 10.0g葡萄糖 4.0g
酵母提取物 4.0g放线醇(Actidiol): 0.05g琼脂粉 13.0g软化水1升pH: 7.0-7.5加热，使各成分充分溶解后，将所得溶液分装在试管内，在121℃下灭菌20分钟。将试管冷却，呈倾斜位置固化。用金属丝环使HIL-006734划线生长在琼脂斜面上，在28℃(±1℃)下培养，直至观察到良好的生长。将充分生长的培养物贮藏在+8℃冰箱内。
甘油工作种子的制备培养基的组成酵母提取物 4.0g可溶性淀粉 15.0gK2HPO4: 1.0gMgSO4×7H2O:0.5g软化水1升pH: 7.0将上述培养基100ml的量分装在300ml埃伦迈厄烧瓶内，在121℃下高压灭菌20分钟。将烧瓶冷却至室温，用上述琼脂斜面接种。在28℃下，在180rpm旋转摇动器上进行五天培养。将1.5ml该培养物与1.5ml甘油(99％)混合，贮藏在-20℃下。
实施例3HIL-006734号培养物的摇瓶发酵种子培养基的组成葡萄糖15.0g大豆粉15.0g玉米浆 5.0gCaCO3: 2.0gNaCl:5.0g
软化水1升pH: 6.8-7.0培养基在使用时可以含有或不含有玉米浆。
将上述培养基以100ml的量分装在500ml埃伦迈厄烧瓶内，高压灭菌20分钟。将烧瓶冷却至室温，每只烧瓶接种菌环量的上述实施例2的充分生长的培养物，在27℃(±1℃)下，在240rpm旋转摇动器上摇动72小时，得到种子培养物。
生产培养基的组成葡萄糖 20.0g大豆粉 10.0gCaCO3:0.2gCoCl2·6H2O: 0.001g软化水 1升pH: 6.8或淀粉10.0g葡萄糖 10.0g甘油99％10.0g玉米浆 2.5g蛋白胨 5.0g酵母提取物 2.0gNaCl: 1.0gCaCO3:3.0g软化水1升pH: 7.2(灭菌前)将生产培养基以100ml的量分装在500ml埃伦迈厄烧瓶内，在121℃下高压灭菌20分钟。将烧瓶冷却至室温，接种上述种子培养物(2％v/v)。在27℃(±1℃)下，在240rpm旋转摇动器上进行48小时发酵。利用已知的孔扩散法试验抗金黄色葡萄球菌3066和屎肠球菌VR-1的生物活性，以测定抗生素的生产。
实施例4HIL-006734号培养物的发酵罐培养在摇瓶内制备种子培养物将实施例3的种子培养基150ml的量分装在1000ml埃伦迈厄烧瓶内，在121℃下高压灭菌20分钟。种子培养物如实施例3所述生长在这些烧瓶内。
大规模发酵生产培养基的组成葡萄糖 20.0g大豆粉 10.0gCaCO3: 0.2gCoCl2·6H2O: 0.001g软化水1升pH: 7.0或淀粉 10.0g葡萄糖 10.0g甘油99％ 10.0g玉米浆 2.5g蛋白胨 5.0g酵母提取物 2.0gNaCl: 1.0gCaCO3: 3.0g软化水1升pH: 7.2(灭菌前)将20升生产培养基分装在(两只)22升发酵罐内，另将9升生产培养基分装在(两只)12升发酵罐内，加入1ml(/10升发酵罐)Desmophen作为消泡剂，在121℃下原位灭菌40分钟，冷却至27℃(±1℃)，接种1.5升(/22升发酵罐)或0.75升(/12升发酵罐)上述种子培养物。
利用下列参数进行发酵温度27℃(±1℃)搅拌200rpm通气15lpm/22升发酵罐10lpm/12升发酵罐收获时间64小时通过试验抗金黄色葡萄球菌3066和屎肠球菌VR-1的生物活性和HPLC分析，测定抗生素的生产。培养肉汤的最终pH为7.0-7.5。收获培养肉汤，离心，通过实施例5或6所述方法从培养物滤液和菌丝体中分离和纯化抗生素。
实施例5万古烯霉素的分离和纯化收获培养肉汤(60升)，离心分离菌丝体(2.5kg)和培养物滤液(50升，pH7.3)。菌丝体用甲醇提取(2×20升)，合并活性提取液，减压浓缩，得到70g粗物质。培养物滤液(50升，pH7.3)用2N盐酸调至pH5.5，通过Diaion HP-20柱(2.5升)。柱子用水(10升)、然后用15升甲醇∶水(1∶1)洗涤。发现活性化合物存在于15升甲醇∶水(3∶1)和30升甲醇洗脱液中。通过抗金黄色葡萄球菌3066和屎肠球菌VR-1的生物测定进行纯化作用的监测。合并活性洗脱液，浓缩得到15g粗物质。合并的粗物质经过Sephadex LH-20柱(2.5cm×90cm)色谱，用甲醇反复洗脱，合并活性部分，浓缩。进一步经过Toyopearl TSKHW40F柱(6cm×35cm)色谱，用甲醇洗脱。合并活性部分，减压浓缩，得到3g半纯物质。利用下列条件，通过制备型HPLC进行最后的纯化半纯物质最后用制备型HPLC纯化，柱子为25mm×250mmHibar-Lichrospher RP-18(10μ)，使用67.5∶32.5甲醇∶磷酸盐缓冲液(0.01M,pH6.5)作为洗脱液，流速为23ml/min，在220nm下检测。
合并活性洗脱液，减压浓缩以除去溶剂，然后在Diaion HP-20柱(50ml)上除去盐分，用乙腈∶水(80∶20)洗脱，减压浓缩，冷冻干燥，得到70mg纯化合物。
实施例6万古烯霉素的分离和纯化收获培养肉汤(200升)，离心分离菌丝体和培养物滤液。菌丝体彻底用甲醇(30-40L)提取，提取液浓缩至1∶10，得到无色沉淀，滤出，得到30-50g粗物质。该物质进一步用HPLC纯化1)柱子Fractogel TSK-HW 40(4L,500×100mm)洗脱剂MeOH流速20ml/min检测204和236nm活性级分在125分钟后洗脱。合并后的级分减压浓缩，冷冻干燥。
2)柱子硅胶60(Merck)；Erimatech(300×20mm,100ml)洗脱剂A) CH2Cl2∶MeOH 9∶1B) CH2Cl2∶MeOH 3∶1+1％ NEt3C) MeOH梯度分钟％A％B％C0 1000 023 1000 024 0 100051 0 100052 0 0 10093 0 0 100流速25ml/min检测236和288nm含有万古烯霉素的级分在32分钟后洗脱。合并的各级分在减压下浓缩，冷冻干燥。两支纯化柱的产率为50％。
万古烯霉素的物理化学与光谱性质见表1和2，抗各种细菌的最小抑制浓度(MIC)列在表3中。
表1外观 白色固体溶解性甲醇、DMSO熔点 141-143℃[α]D-13°(c0.2，甲醇)TLC(薄层色谱) Rf:0.6[硅胶板(产品No.5554,E.Merck)；n-BuOH∶MeOH∶水(4∶1∶2)]HPLC(高压液相色谱)保留时间14.70min[柱子LiChrocart(250mm×4mm)RP SelectB(5μ)；洗脱剂20分钟内0.1％含水正磷酸(pH2.5)至CH3CN的梯度；流速1ml/min；检测220nm]附
图1或者柱子Purospher Star RP.18e(Merck),55×4mm,3μm洗脱剂CH3CN/0.01％H3PO4(85％)梯度时间 ％CH3CN0.00 5.03.00 95.05.00 95.06.00 5.010.005.0流速2ml/min温度40℃检测210nm,254,280,320,380tR:2.19minESI-MS(电雾化电离-质谱)1342(M-H)-HR-FAB-MS(高分辨率快速 1343.89142(M+H)+原子轰击质谱) [C71H127N2O21计算值1343.889915(M+H)+]分子式 C71H126N2O21UV/VIS MeOH,λmax(logε)=234nm(4.39),280(4.29)(图2)IR KBr,ν=3384cm-1(br),2934(m),1674(m),1616(s),1456(s),1381(m),1064(图3)1H NMR 见表213C NMR见表2表2万古烯霉素在300K、在MeOD中的1H和13C NMR光谱数据
表3试验生物体MIC(μg/ml)金黄色葡萄球菌209P0.05金黄色葡萄球菌20240 0.05金黄色葡萄球菌E-710 0.10金黄色葡萄球菌SG511 0.05金黄色葡萄球菌30660.10沃氏葡萄球菌6563Ⅱ(2) 0.10金黄色葡萄球菌E-712 0.10金黄色葡萄球菌20424 0.10金黄色葡萄球菌Chantot 31153 0.05金黄色葡萄球菌Wein 11 0.05金黄色葡萄球菌Wein 12 0.05金黄色葡萄球菌503(Mers) 0.025金黄色葡萄球菌Brussel 41150.05金黄色葡萄球菌MLS-16 0.39溶血葡萄球菌809 0.05表皮葡萄球菌825 0.10表皮葡萄球菌823 0.20表皮葡萄球菌607 0.10表皮葡萄球菌5747 IW 0.10粪肠球菌ATCC 292120.39粪肠球菌D 21777 0.39粪肠球菌D 23241 0.39粪肠球菌D 756 0.39粪肠球菌D 26777 0.39粪肠球菌D 7F 0.39屎肠球菌D-65 0.39屎肠球菌5601(H) 0.39屎肠球菌P-1 0.39屎肠球菌P-2 0.39屎肠球菌VR-1 0.39海氏肠球菌55 0.39耐久肠球菌4939H 0.39大肠埃希氏菌9632 ＞100大肠埃希氏菌super sen.2231＞100铜绿假单胞菌M35 ＞100
权利要求
1.万古烯霉素，即下式化合物 及其药学上可接受的盐和衍生物，以所有它们的立体异构和互变异构形式存在。
2.万古烯霉素，即分子式为C71H126N2O21的化合物，可以这样获得，将微生物拟无枝酸菌属HIL-006734种(DSM12216)或其变体或突变体之一在需氧条件下、在含有碳源和氮源的营养培养基中培养，然后按惯用方式分离和纯化，及其药学上可接受的盐和衍生物，以所有它们的立体异构和互变异构形式存在。
3.生产如权利要求1或权利要求2所要求保护的万古烯霉素或其盐或衍生物的方法，包括将微生物拟无枝酸菌属HIL-006734种(DSM12216)或其变体或突变体之一在需氧条件下、在含有碳源和氮源的营养培养基中培养，然后按惯用方式分离和纯化。
4.如权利要求3所要求保护的方法，进一步包括使万古烯霉素与适当的试剂反应，生成药学上可接受的盐或衍生物。
5.拟无枝酸菌属HIL-006734种(DSM 12216)或其变体或突变体之一。
6.用作药物的如权利要求1或权利要求2所要求保护的万古烯霉素或其药学上可接受的盐或衍生物。
7.药物组合物，包含有效量的如权利要求1或权利要求2所要求保护的万古烯霉素或其药学上可接受的盐或衍生物，和药学上可接受的载体。
8.用作抗生素的如权利要求1或权利要求2所要求保护的万古烯霉素或其药学上可接受的盐或衍生物。
全文摘要
本发明涉及可以通过微生物HIL－006734(DSM12216)的培养而获得的名为万古烯霉素的化合物、及其药学上可接受的盐。本发明进一步涉及万古烯霉素的生产方法、微生物HIL－006734(DSM12216)、万古烯霉素及其药学上可接受的盐作为药物、特别是作为抗生素的用途、和包含万古烯霉素或其药学上可接受的盐的药物组合物。
文档编号C12P19/58GK1325453SQ99813112
公开日2001年12月5日 申请日期1999年11月4日 优先权日1998年11月9日
发明者N·V·S·拉马克里施纳, R·G·巴特, E·S·斯里库马, E·K·S·维加亚库马, S·D·纳克, U·V·奥克, R·P·坦普尔, C·霍普曼, M·库兹, J·温克, G·塞伯特, D·勒贝勒, J·阿斯佐迪 申请人:阿文蒂斯药物德国有限公司